Kullanımı<em&gt; Ex vivo</em&gt; Chandler Döngü Aparatı Modifiye Polimer Kan Kondüit biyouyumuna De¤erlendirilir

Özet

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Özet

Sentetik yüzey gövdesine içeri getirildiği zaman, yabancı cisim reaksiyon meydana gelir. Bu işlem sonrası komplikasyonlara yol açan, kan proteinleri adsorpsiyon ve trombositlerin arkaya takılmasının ve aktivasyonu, monosit / makrofaj yapışma, ve inflamatuar hücre sinyal olayları ile karakterize edilir. Chandler Döngü Aparatı araştırmacılar kan geniş hacimli polimerik kanallar üzerinde perfüze zaman meydana gelen moleküler ve hücresel etkileşimleri çalışmak için izin veren deneysel bir sistemdir. Bu amaçla, bu cihaz, çeşitli polimer yüzey modifikasyonları, anti-enflamatuar özellikleri tahmin edilmesine izin veren bir ex vivo bir modeli olarak kullanılmıştır. Laboratuvarımız kovalent rekombinant CD47 ile aktifleştirme kimyası ile modifiye kan kanallar, polimerik yüzeylere biyouyumluluk kazandıran göstermiştir. Polimerik yüzeylere CD47 ekleme polimerik kan kanalların etkinliğini teşvik etmek etkili bir araç olabilir. HerEin CD47 değiştirilebilir ve kontrol kanallarına kan etkileşimleri incelemek için klinik olarak anlamlı bir polimer, kan ve boru, bir ex vivo deney modeli olarak Chandler özenin kullanımının, rekombinant CD47 eklemek için kullanılan foto-aktifleştirme kimyası ayrıntılı bir yöntemdir.

Giriş

Örneğin kardiyopulmoner baypas ve böbrek diyalizi gibi pek çok klinik uygulamalar ise, polimerik kan kanalların kullanılmasını gerektirir ve genellikle işlem sonrası komplikasyonlara ¹ ile ilişkilidir. Kan ile perfüze edilmiş olduğunda, bu polimerler, kan proteinleri ve trombositler, monosit / makrofaj yapışma emdirme ile sonuçlanır, yabancı cisim reaksiyonu (FBR) kural dışı, ve işlem sonrası komplikasyonlara ve katkı yapan tüm bu pro-enflamatuar sitokinlerin salınması / veya aygıt hatası ^2,3. Böylece, bu sorunu çözmek için stratejiler biomateryaller önemli bir araştırma ve devam eden alan kalır. Müfettişler biyoaktif veya biyoinert molekülleri ^4-6 kan temas yüzeyleri değiştirerek bu sorunu çözmek için çalıştılar. Laboratuvarımızda Araştırma FbR hafifletmek ve bu malzemelerin etkinliğini artırmak için bir strateji olarak polimerik biyomalzeme rekombinant CD47 (recCD47) ekleyerek odaklanmıştır. CD47 bir yerde ifade transmembr olduğuhücreleri ^7-10 ve gösterileri ifade üzerine bağışıklık kaçırma bilinen bir rol kazandıran "öz" durumu ile ane protein polimerik yüzeyler ^11-13 eklendiği takdirde biyouyumluluk veren de söz veriyorum. Sinyal-düzenleyici proteini alfa (SIRPα), CD47 için ortak kökenli alıcı, ve zar-ötesi proteinlerin ailesi-ihtiva-eden immüno reseptör tirosin bazlı inhibisyon motifi (İTİM) üyesi, miyeloid kökenli ¹⁴ hücreleri üzerinde ifade edilir. Daha önce CD47, SIRPα aracılı hücre sinyal iletimi yoluyla, in vitro, ex vivo olarak, poliüretan (PU) ve polivinil klorür (PVC) için bağışıklık tepkilerini aşağı regüle eder ve in vivo modellerde ^11-13 olduğunu göstermiştir.

Yapılan incelemelerde Orta kimyasal olarak reaktif tiyol gruplar kovalent olarak bir çok fonksiyonlu bir polimer (PDT Bz ile reaksiyona sokulması suretiyle borunun polimerik boru eklenmiş olduğu, burada tarif edilen bir nispeten yeni bir foto-aktifleştirme kimyası, bir2-piridilditiyo (PDT) oluşan) Ph, fotoreaktif benzofenon (BzPh) ve bir karboksi-değiştirilmiş polialilamin ^11-13. Tris kovalent ekteki PDT gruplarının indirgenmesi (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP); ¹¹ sonradan olarak bir yüzey tiollenmiş terapotık kısımlar ile reaksiyona verir. Bu tarifnamede daha önce ayrıntılı ^12,13, ayrıca bir C-terminali poli-lisin ^12,13 kuyruk ilavesiyle modifiye recCD47, Sülfosukinimidil-4-[N -maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksilat ile reaksiyona sokulur (sülfo-SMCC) 1 saat boyunca ve boru ¹¹ arasında bir recCD47 monosulfide bağ oluşumuna müsaade eden, tiol-reaktif gruplar oluşturmak için. CD47 fonksiyonalize yüzeylerinin anti-enflamatuar kapasitesi orjinal trombotik pıhtılaşma ¹⁵ bir in vitro modeli olarak, 1958 de tarif edilmiştir bütün insan kanı ile Chandler döngü aygıtı kullanılarak ex viv o test edilmiştir. Aparat bir dayanırkapalı bir boru sisteminin kısmen hava ve boru ¹⁵ yoluyla kan dolaşımı için bir döner motor ile doldurulur. Bu deneysel modelde, modifiye edilmiş ve modifiye edilmemiş yüzeyleri üzerine kan maruz kalma etkisi ve aynı zamanda kan hücrelerinin fizyolojisi üzerine, bu yüzey modifikasyon etkisini incelemek için bir fırsat sağlar.

recCD47 Bu aktifleştirme kimyası kullanılarak polimer çeşitli yüzeyler eklenmiş olabilir, ve anti-enflamatuar kapasitesi polimer yüzeyleri ^11,12 üzerinden kan perfüzyonunun taklit eden klinik olarak anlamlı bir eks vivo modeli kullanılarak değerlendirilebilir. Aparat insan kanı maruz kaldığında, değiştirilmemiş polimerlere kıyasla recCD47 modifiye klinik sınıf kan kanalları önemli ölçüde daha az trombosit ve inflamatuar hücre eki göstermektedir. Bu modifikasyon işleminin bir adım-adım bir açıklaması aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protokol

RecCD47 ile 1. değiştirme Polimer Yüzeyler

NOT:. Protokol, Şekil 1 'de şematik olarak özetlenmiştir Şekil 1A, tiol-reaktif polimer yüzeylerinin oluşumunu göstermektedir Şekil 1B, tiol-reaktif recCD47 yaratılışını gösterir..

1. 1. Gün
   1. , Steril su içinde bir PDT-BzPh çözeltisi (1 mg / ml) ve potasyum bikarbonat (KHCO ₃₎ (0.7 mg / ml) hazırlayın. 4 ° C (ışıktan koruma) gece boyunca karıştırın.
2. Gün 2
   1. (Dönen tekerlekler etrafında sığacak kadar uzun) 40 cm uzunluğunda parçalar halinde polimerik borunun kesin.
   2. Bir çalkalama ya da Chandler döngü aygıtı üzerinde oda sıcaklığında 90 dakika boyunca hexacylpyridinium bir% 0.1 sulu çözelti içinde tüpler bekletin. 90 dakika bekletin sonra steril su 3x tüpleri durulayın.
   3. (% 15 sulu potasyum fosfat monobazik eklenerek Gün 1 PDT BzPh çözeltisinin asitleştirilmesi KH ₂ PO _4). Bulanık bir misel çözeltisinin oluşturulması, PDT BzPh ml'si başına 50 ul KH ₂ PO ₄ ekleyin.
   4. Bir çalkalama veya aparat üzerinde oda sıcaklığında 40 dakika boyunca asidifiye PDT BzPh çözelti içinde tüpler bekletin.
   5. Bir defa, seyrek asetik asit (1.000 1) ile boru durulayın.
   6. 60 dakikalık bir toplam süresi boyunca UV-ışını tüpleri için Açığa. Tüm yüzey alanını aydınlatmak için her 15 dakikada ¼ tüpler döndürmek.
   7. Bir çalkalama veya aparat üzerinde oda sıcaklığında 20 dakika boyunca, 20 mg / ml potasyum bikarbonat çözeltisine (KHCO ₃₎ tüpler bekletin.
   8. , Steril su içinde, 4 ° C'de steril su ve 3 x deposuyla tüpleri durulayın.
3. Gün 3
   1. (: Çeker ocak içinde gerçekleştirme Dikkat) 200 ul dimetilformamid (DMF) içerisinde 5 mg Sülfo-SMCC çözülür.
   2. RecCD47 poli-lizin çözeltisi 0.1 mg / ml aşama 1 'de hazırlanmış olan Sülfo-SMCC çözeltisi 50 ul, ve RO' de 60 dakika karışmasınaom sıcaklığı.
   3. 60 dakika süreyle karıştırılmaya sırasında gazını Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ve bir kenara, steril.
   4. Saflaştınlır Sülfo-SMCC, üretici talimatlarına göre bir 7K molekül ağırlıklı bir kesim sıkma tuz giderme kolonu kullanılarak recCD47 tepki gösterdi. Nihai akış yoluyla (yüksek kaliteli tiol-reaktif recCD47) toplayın ve kat DPBS ile borunun iç için gerekli hacme kadar seyreltin.
   5. Steril ile 2 gün tüpleri durulayın, DPBS 3x gazı alındı.
   6. En az 2 dakika süreyle gazdan arındırılmış DPBS içinde 20 mg / ml 'si ile tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP) bir çözeltisi ile, tüplerin olarak değiştirilmiş bir yüzeyi React. Steril gazı alınmış DPBS 4x'te tüpleri durulayın.
   7. Tüplerine Sülfo-SMCC-reaksiyona recCD47 ekleyin ve bir çalkalama cihazında ya da 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.

Modifiye Yüzeyler üzerinde recCD47 2. İmmünotest Kantitasyonu

1. Modifiye tüpleri durulayın Gün 3 zekâ gelen sayısal edilecekh DPBS 3x. Mağaza tüpler 4 ° C'de DPBS ölçümü için kullanılmaz.
2. 96 çukurlu bir levhanın gözleri içine biyopsi zımbaları çift boru örnekleri yapmak ve yerleştirmek için 4 mm biyopsi zımbası kullanın.
3. Tespit antikoru ile tedavi edilmeyen modifiye edilmemiş bir boru numunesinin oluşan bir negatif kontrol hazırlayın. Tespit antikoru ile tedavi edilmiş bir modifiye edilmemiş boru numunesi aşağıdakilerden oluşan bir antikor kontrolü hazırlayın. Tespit antikoru ile muamele edilmiş tadil edilmiş boru test numunelerini hazırlayın.
4. Bir karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 60 dakika boyunca DPBS içinde% 0.4 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile blok örnekleri.
5. Engelleme aspirat BSA ve tris-tamponlu tuzlu su ve% 1 Tween-20 (TBST) 3x, bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika her biri ile yıkayın.
6. Bağışıklık için üreticinin tavsiye edilen seyreltme göre% 0.4 BSA içinde antikorun bir seyreltme çalışma hazırlayın. İnsan CD47 Antikor B6H12-FITC 1 seyreltilir: 100% 0.4 BSA içinde.
7. Uygun oyuklara antikor seyreltme 200 ul ilave edin. Tekni% 0.4 BSA, sadece Te negatif kontrol eder. Bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika boyunca (ışıktan koruma) için oda sıcaklığında inkübe edilir.
8. TBST'dir 3x, 10 dakika bir çalkalayıcı her ile durulayın. Son TBST'dir durulama aspire ve tüp numune kuyulara 200 ul DPBS ekleyin.
9. Nihai akış yoluyla yüksek kalitede tiol-reaktif rekombinant CD47 bir toplayın ve kat DPBS ile tüplerin iç için gerekli hacme kadar seyreltin.
10. FITC uyarma (485 nm) ve emisyon (538 nm) ayarları ile bir mikrotablaya okuyucu kullanarak FITC sinyal yoğunluğu okuyun.
11. Hesaplayın recCD47 otomatik floresans ve non-spesifik antikor, kontrol örneğinden bağlayıcı oluşturacak şekilde standart değerlere dayalı polimer yüzeyine bağlanır.

3. Chandler Döngü Aparatı Protokolü

Kan toplama protokolü Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) onayı ve bilgilendirilmiş onam evrak önce insan kan numunelerinin toplanması başlamadan isteyin. Bilgi edininonaylanmamis bir insan kanı donörden onayı.
Not: aparatı gösteren bir diyagramı Şekil 2 de gösterilmiştir.

1. Yaklaşık olarak 1/2 tekerleklerinin çapı kadar damıtılmış su ile doldurun su banyosu içine monte edilmiştir. % 10 ağartıcı çözelti yapmak için su banyosu için yeterli çamaşır suyu ilave edin. Ayarlama, su 37 ° C banyo ısısı ve dengelenmeye gelmeye bırakın.
2. Metal (Şekil 1 B 'de gösterildiği gibi) bağdaştırıcılar, modifiye edilmemiş ve modifiye edilmiş boru boru toplayın, ve Şekil 1C' de gösterildiği gibi, cihaz tekerlekleri etrafında bir araya getirin. Bu boru yerine metal adaptör ile tekerleğin etrafında kuytu uyduğundan emin olun.
3. Sitrat ya da diğer antikoagülan, 2 ml ile doldurulmuş bir şişe içinde, bir IRB onaylı protokol kullanılarak 30 ml'lik bir kan örneği elde edilir, ve numune, bir kez tıkama bilmek çevirerek karıştırın.
4. Tüp içinde bir hava bırakarak metal valfi ve bir şırınga kullanarak her bir tüp için kan yaklaşık 10 ml ilave edilir. Valf kapağını ve r Secure3 saat boyunca otate.
5. % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile muamele edilmiş bir atık behere kan akıtmak (ya da kurumsal politika tarafından gerekli).
6. Yavaşça bütün kan izlerini kaldırmak için DPBS boru içini durulayın. Akış yoluyla atık beher toplayın. Kurumsal politikası uyarınca kan imha edin.
7. Aparatı ve yüzeyleri% 10 çamaşır suyu çözeltisi kullanılarak ya da kurumsal politikaya göre temas herhangi bir kan dezenfekte edin.
8. Fluoresan mikroskobu ya da tarama elektron mikroskobu için işlem örnekleri aşağıda tarif edildiği gibi.

4. Floresan Mikroskopi ve Hücre Sayım

1. % 4 paraformaldehid (PFA) solüsyonu (Dikkat: davlumbaz gerçekleştirin) hazırlayın.
2. 4 ° C de bir gece% 4 PFA çözeltisi içinde boru inkübe edin.
3. Gece boyunca inkübasyondan sonra,% 4 PFA çıkarın ve DPBS filmler çok yavaşça çalkalayın.
4. Boyama için lümen yüzey ortaya bölüme hortumu kesilir.
5. LekeOda sıcaklığında 30 dakika boyunca 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile ortam monte edilmesi için bir kaç damla ise, borunun bir bölümü (ışıktan koruma). Boyama sonra, arka plan DAPI sinyali azaltmak için DPBS ile çok yavaşça tüp durulayın.
6. DAPI filtre ve dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü 200X büyütmede görüntüsü altında 9 körü körüne seçilen alanlarda hücrelerin sayısını saymak için.
7. Tutanak hücre görüş alanı başına sayar ve sonuçların istatistiksel önemini belirlemek için uygun istatistiksel analizler gerçekleştirmek.

5. Taramalı Elektron Mikroskobu

1. % 2 glutaraldehit çözeltisi (Dikkat: davlumbaz gerçekleştirin) hazırlayın.
2. Gece boyunca 4 ° C'de% 2 glutaraldehid solüsyonunda boru inkübe edin.
3. Gece boyunca inkübasyondan sonra, yavaşça DPBS ile boru 3 kez yıkayın.
4. Ozmiyum tetroksit bir% 1 çözeltisi hazırlayın (Dikkat: Şiddetli inhalasyon tehlike! ) Davlumbaz kullanın.
5. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ozmiyum tetroksit bir% 1 çözeltisi içinde boru inkübe edin.
6. Yavaşça DPBS boru 3x durulayın.
7. Etanol konsantrasyonları bir dizi (% 25,% 50,% 75,% 95 ve% 100 etanol) hazırlayın.
8. Etanol konsantrasyonu dizi içinde inkübe edilerek, boru kurutmak. % 25,% 50,% 75, ve 20 dakika her biri için% 95 etanol içinde inkübe edin. 30 dakika boyunca% 100 etanol içinde inkübe edin.
9. Süper kritik nokta nemi çıkarmak için 45 dakika boyunca _CO2 ile boru kurutun.
10. Gümüş macun veya grafit ile bir örnek saplama Mount tüp bölümleri.
11. Altın paladyum 12.5 nm ile kaplayın tüp bölümleri.
12. Bir taramalı elektron mikroskobunda inceleyin.

Sonuçlar

SMCC ile tiyol-reaktif recCD47 poli-lisin ile birlikte PDT BzPh ve TCEP kullanımı yoluyla tiol-reaktif polimer yüzeyleri oluşturma polimerik yüzeylere recCD47 eklenmesine izin verir. Modifikasyon işlemi Şekil 1 şematik olarak özetlenmiştir. Bu modifikasyon işleminin rahatlık, bu protein varsayarak, örneğin amin içeren bir lisin ve yeterli kimyasal yönden reaktif gruplar ile modifiye edilebilir, bir çok farklı protein ve bir çok farklı polimerik yüzeylere uygulanabilir olmasıdır , ...

Tartışmalar

(Şekil 1 'de özetlenen veriler) foto-aktifleştirme kimyası PDT-BzPh eki ve daha sonra UV ışınlaması kolaylaştırmak için yeterli hidrokarbonlara hemen hemen herhangi bir polimer yüzeyinin değişimine olanak sağlar PDT BzPh fotoğrafı dışı bırakacaktır. Reaktif tiyol grupları ile polimerik yüzey fonksiyonalize ilgi test edilebilir bir molekül, bir dizi daha sonra eklenmesine izin verir. Bizim özel çalışmalarda biz rekombinant CD47 ^11-13 seçti. Bu iki fonksiyonlu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891