Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Özet

Biz hücreleri ve embriyolar incelemek için bir cihaz ve yeni bir yöntem sunulmuştur. Tek hücreler tam microcavity dizileri sıralanır. Onların 3D hapsi fizyolojik koşullarda karşılaşılan 3D ortamlarda yolunda atılmış bir adımdır ve organel yönünü verir. Hücre şekli kontrol ederek, bu kurulum standart deneylerde bildirilen değişkenlik en aza indirir.

Özet

Biyolojik hücreler genellikle daire (2D) yüzeylerinde görülür. Bu durum fizyolojik değildir ve fenotipleri ve şekiller oldukça değişkendir. Bu tür ortamlarda hücreler dayalı tarama bu nedenle ciddi sınırlamaları vardır: hücre organelleri heterojen ve / veya belirli bir hücre organelleri düzgün görüntülenmiştir olamaz olan aşırı fenotipleri, hücre morfolojileri ve boyutları göstermektedir. Buna ek olarak, in vivo olarak hücreler, bir 3 boyutlu bir ortamda yer alır; Bu durumda, hücreler, esas olarak doku çevreleyen hücre dışı matris ile etkileşimi farklı fenotipleri göstermektedir. Standartlaştırmak ve hücre tabanlı tahlillerde için fizyolojik olarak ilgili 3 boyutlu bir ortamda tek hücre sırasını oluşturmak için, burada in vitro olarak 3D hücre kültürü için bir cihazın mikroüretim ve uygulamalar sunulmaktadır. Bu cihaz, mikro boşlukların üst 2B dizi (tipik olarak 10 ⁵ oyuklar / ^cm2), tek hücreler ya da embriyolar ile doldurulmuş, her oluşur. hücre poziyon, şekil, polarite ve iç hücre organizasyonu 3D mimarisini gösteren sonra normalize olur. Biz bir lamel üzerine yapıştırılmış ince bir polidimetilsiloksan üzerine 'eggcups' (PDMS) katman deseni mikro boşlukların bir dizi çoğaltma kalıp kullanılır. Boşluklar yapışmayı kolaylaştırmak için fibronektin ile örtülmüştür. Hücreler, santrifüj ile sokulmuştur. Dolum yüzdesi% 80'e kadar izin her bir sistem için optimize edilmiştir. Hücreler ve embriyolar canlılığı teyit edildi. Biz çekirdek ve Golgi gibi hücresel organellere, görüntülenmesi için bu yöntemi uygulanır ve bu tür hücre mitoz sırasında cytokinetic halka kapatılması gibi aktif süreçleri incelemek için. Bu cihaz, Golgi ve çekirdek hizalama için cytokinetic halka kapanması ve sıkıştırılmış fenotipleri sırasında bu tür periyodik birikimleri ve miyozin ve aktin homojensizliklerin gibi yeni özellikler, belirlenmesini sağladı. Biz memeli hücrelerinin, fisyon maya, tomurcuklanan maya, C yöntemi ile karakterize elegans wher durumda i'inci özel adaptasyon. Son olarak, bu cihazın özellikleri ilaç tarama tahlillerine ve kişiselleştirilmiş ilaç için özellikle ilginç hale getirir.

Giriş

İn vitro hücre-esaslı deneyler mevcut (2B), iki boyutludur. Bu yapılandırma, memeli hücreleri için doğal olmayan ve bu nedenle ¹ fizyolojik olarak ilgili değildir; Hücreler şekil, boyut ve heterojen fenotip bir çeşitlilik göstermektedir. Böyle düzlemde ve hücresel organellerin aşırı fenotipleri (özellikle stres lifleri) içinde düzensiz dağılım olarak, tarama uygulamaları uygulandığında Onlar ek ciddi sınırlamalar mevcut. Bu yüksek bütçeler her yıl harcanan uyuşturucu testi için klinik çalışmalarda özellikle önemlidir. çünkü ilaç taraması erken dönemlerinde yapay 2B kültür durumun hayvan modellerinde uygulandığında bu ilaçların pek çoğu da başarısız olur. Buna ek olarak, bu yaklaşım ile, özel hücre organelleri doğru genellikle gözlem düzlemine dik bir düzlemde gelişen yapılar, hücre mitoz sırasında cytokinetic aktomiyosin halkası gibi, görsel ve edilemez. Birazyeni 2D deneyleri hücre iskeleti organizasyonu yukarıda belirtilen sakıncaları ve önemli anlayışlar ^2,3 gözlenmiştir aşmak için öne sürülmüştür. Bununla birlikte, bu deneyler, hala mevcut ciddi bir sınırlaması hücreleri hücreler 3B yapıların varlığı, in vivo olarak gözlemlenen bir tezat çok yayılmış bir fenotip göstermektedir. Kültür yöntemi ile ilişkili Bu eserler gibi gelişmiş stres lifleri ^1,4,5 olmayan fizyolojik özellikleri tetikleyebilir.

2D ^6,7 ortamlarda göre üç boyutlu hücre kültürü deneyleri, çok sayıda avantaj sağlar. Onlar fizyolojik daha alakalı ve sonuçlar bu nedenle anlamlıdır. Bir örnek olarak, hidrojeller gömülü hücrelerin 3D-benzeri yapılar gösterir ancak morfolojileri bir ^8,9 bir hücreden diğerine farklılık göstermektedir. Bununla birlikte, bunların morfolojileri tarama uygulamaları komplike bir hücreden, farklıdır. Alternatif bir strateji tek gömmektirmicrofabricated boşlukların ^10,11 hücreleri. Hücre pozisyon, şekil, polarizasyon ve hücre içi organizasyonu daha sonra normalize olabilir. Hücrelere 3D benzeri mimari sağlamanın yanı sıra, mikro boşluklara da yüksek içerik tarama çalışmaları ^10,12-14 için izin verir; tek hücre mikrodiziler ve hücresel organellerine sipariş edilebilir ve değerlendirmelerin paralel gözlenebilir. Bu düzenlilik hücrelerinin sayısının az ve daha iyi uzaysal / zamansal çözünürlükte iyi istatistikler sağlar. Yararlı bileşikler güvenilir tespit etmek daha kolaydır.

Bu çalışmada, yüksek içerik tarama uygulamaları ^10,12,13 için imalat ve yeni bir 3D benzeri tek hücre kültür sisteminin uygulanmasını göstermektedir. Cihaz elastomerik mikro boşluklara (10 ⁵ boşluklar / cm ^2), icat 'eggcups' (AK) bir dizi oluşur. Bu çalışmada Ölçüler ve AT toplam hacmi bireysel NIH3T3 ve HeLa hücrelerinde tipik hacmi optimize edilmiştirhücre bölünmesi sırasında. silindirik - - boşlukların Morfoloji etkin işlemlerin görüntülenmesi için gerektiği gibi yönlendirmek hücre şekli seçilir. ^15,16 lamel çoğaltma kalıp bir cam üzerine yapıştırılmış ince bir polidimetilsiloksan (PDMS) tabaka üzerine desen AT'nin bir dizi kullanılır. Hücreler santrifüj ile EC tanıtıldı. Biz 2D aynı hücrelerle karşılaştırıldığında burada gözlem ve 3D (EC) hücresel organellere (aktin stres lifleri, golgi aygıtı ve çekirdek) normalleşmesini rapor (düz) uygulanabilir. Biz de böyle bir hücre mitoz ¹⁷ sırasında cytokinetic actomyosin halka kapatılması gibi aktif dinamik süreçlerin gözlem raporu. Son olarak, biz böyle tomurcuklanan maya, fisyon maya ve C gibi katı duvarlar, diğer sistemlerde bu yöntemin sonuçlarını göstermek model sistemlerinde geniş bir yelpazede bizim metodoloji uygulanabilirliğini teyit elegans embriyolar.

Önümüzdeki ayrıntılı ve kapsamlı p sunmaksırayla rotocol imal ve 3D mikrofabrikasyon için 'eggcups' uygulamak. Bizim yaklaşım basittir ve bir temiz oda ihtiyacı yoktur. Biz bu yeni metodoloji Petri yerine de, ilaç tarama deneyleri ve kişiselleştirilmiş tıp için özellikle ilginç olacağını tahmin ediyoruz. Son olarak, cihaz, kanser ¹⁸ veya temel araştırma ^19, örneğin, dış uyarılara karşı hücre yanıtlarının dağılımı çalışmaları için yararlıdır.

Protokol

'Eggcups' 1. Mikro ve

1. Master Fabrikasyon: mikro boşluklara Dizi
   1. nem bulunması, buharlaştırılması için 200 ° C'ye kadar bir 3 '' silikon gofret ısıtın.
   2. Spin-kat SU-8 fotorezist ince bir tabaka. İstenilen kalınlık ve fotorezist tipine bağlı olarak reçine ve iplik hızı seviyesini ayarlayın. Bu kalınlık 'eggcups' (EC) derinliğini belirleyecektir. 2800 rpm'de 30 mikron kalınlığında bir tabaka ve SU-8 2025, Spin-kat için.
   3. Ön fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 tabakası için 1 dakika boyunca (2 aşama 1) 65 ° C 'de gofret. İstenilen fotorezist türüne ve kalınlığına göre zaman uyarlayın. Ayrıntılar için üretici veri sayfasını kontrol edin.
   4. Ön fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 katman için 3 dakika boyunca (2 aşama 2) 95 ° C 'de gofret. İstenilen fotorezist türüne ve kalınlığına göre zaman uyarlayın. Ayrıntılar için üretici veri sayfasını kontrol edin.
   5. YükUV ışınlarına maruz için maske hizalama üzerinde gofret. Üzerinde fotolitografi maskesi yerleştirin. Maske çapı 20 um dairesel özellikler (diskler) içindeki bir modelini göstermektedir. birbirleri arasında mükemmel bir temas sağlamak.
      NOT: Farklı üreticilerin fotolitografi maskeleri sunuyoruz. uzamsal çözünürlük nihai maliyetini belirleyecek. Asetat maskeleri düşük maliyetle kabul edilebilir çözünürlük (≈10 um) sağlarlar. Krom maskeleri daha iyi çözünürlük sağlar, ancak daha pahalıdır. Hücrelerin hacmine (fotolitografi maskesi) disklerin çapları uyarlayın. maske disklerin boyutları cihazda boşlukların çapı belirleyecektir. Düşük dolum yol açacaktır Küçük çapları; çok büyük çaplı hücreleri sınırlandırmak olmaz. HeLa ve NIH3T3 hücreleri için 20 um ila 25 çapları önerilmektedir.
   6. UV lambası önce fuar gücünü kontrol edin ve buna göre pozlama süresini optimize eder. 41.5 sn (ya da optimize edilmiş maruz kalma süresi) de için (dalga boyu = 365 nm) saçmak250 mJ / ^cm2.
      NOT: SU-8 2025 UV maruz bölgeler tedavi olacağı anlamına gelir negatif fotorezist vardır. Bu durumda, dairesel özellikleri, siyah ve geri kalan şeffaftı. ters bir şekilde pozitif fotorezist çalışması: açık olmayan bölgeler tedavi edilir. tasarım ve fotoğraf maske bağlı buna göre ışığa seçin.
      NOT: Uygun koruyucu gözlük ile UV ışınlarından gözleri koruyun.
   7. yavaşça ışığa dirençli tabakanın maske çıkarın.
   8. Sonrası fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 tabakası için 1 dakika boyunca (2 aşama 1) 65 ° C 'de gofret. Sonrası fırında 30 mikron kalınlığında SU-8 2.025 katman için 3 dakika boyunca (2 aşama 2) 95 ° C 'de gofret. İstenilen fotorezist türüne ve kalınlığına göre zaman uyarlayın. Ayrıntılar için üretici veri sayfasını kontrol edin. sonrası pişirme sonra yaklaşık 1 dakika için tezgah üzerinde oda sıcaklığına kadar gofret soğutun.
   9. Spin-kaplayıcı gofret yerleştirin ve kapak SU-8 geliştirici birkaç mm damlaBütün gofret alanı. spin-kat 1000 rpm'de 30 saniye boyunca, daha sonra 2 dakika süre ile geliştirilmesi ve. prosedürü üç kez tekrarlayın.
   10. gelişmemiş SU-8 tam olarak çıkarılmasının sağlanması için 2-propanol ile durulayın. Beyaz bölgelerin hali tam olmayan bir gelişim gösterir. Bu durumda, gelişmekte olan adım ek tekrarlayın.
   11. Sabit fırında 200 ° C'de gofret fabrikasyon mikro yapıların sağlamlığını sağlamak. Bu adım isteğe bağlıdır.
   12. 94 mm x 15 mm polistiren Petri kabı içinde mikroyapılarına 3 'gofret saklayın.
       NOT: yüzey işleme gerek sonraki adımlar için, özellikle silanizasyon de vardır.
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) Replica Fabrikasyon: Direkler Dizi
   1. İyice 1:10 oranında karışımı (a / a) çapraz bağlayıcı ve 50 ml'lik bir tüp içinde 30 g bir toplam ön polimer.
      Not: 1:10 (h / h) oranının kullanılması da çalışmaktadır.
   2. 5 dakika boyunca 1800 x g'de santrifüj tüpüHava kabarcıklarını çıkarmak.
   3. mikro yapıların üstünde yavaşça PDMS bırakın.
      NOT: hava kabarcıkları bu adımı sırasında görünüyorsa, 15-20 dakika süreyle bir vakum pompası kullanılarak örnek degas.
   4. 4 saat 65 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde örnek yerleştirin.
      Not: pre-polimer oranı: sertleşme süresi birlikte çapraz bağlayıcı ile, kullanıcı arasında değişir ve. Bu kez PDMS sertliğini belirleyecektir. En fazla 2 saat tedavi etmek ve sabit bir sertleştirme süresi sadık önerilir.
   5. Yavaşça yaklaşık 10 ^5, mikro ya da 'eggcups' içeren yaklaşık 1 cm ² faiz (damgası) alanını kesmek için bir neşter kullanın.
      NOT: İlk PDMS kesin ve daha sonra yavaşça soyulabilir. bir optik mikroskop ile PDMS çoğaltma kalitesini kontrol edin.
3. çoğaltma kalıplama tarafından 'eggcups' Fabrikasyon. Aşağıda, 'eggcups' imalatı için iki alternatif stratejiler açıklanmıştır. Her iki protokol simi olanlar ve aynı sonuçlar sağlar:
   1. Strateji 1
      1. 30 saniye boyunca oksijen plazma tedavisi ile imal PDMS damga etkinleştirin. toz birikmesini önlemek için kapalı bir Petri kabı geçici olarak aktif pul saklayın.
         NOT: Plazma diğer gazlar kullanıldığı takdirde fuar süresini ayarlayın.
      2. aktive PDMS yanında 15 ml tüp kap baş yukarı (yapılarıyla taraf) bir Petri kabındaki damga yerleştirin. Trimetilklorsilan 200 ul (TMSC) ile kapağı doldurun. Petri kabı kapatın ve 7 dakika damga Silanize izin verin.
         NOT: pul ve / veya renk (beyaz) değişim Bazı geçici deformasyon görülebilir. damga kısa sürede tekrar orijinal şekline geri olacak ve yapılar etkilenmeyecektir.
         NOT: TMSC akut inhalasyon ve dermal toksisite üretir ve (önemli mesafeler arasında gerçekleşmesi mümkün ateşleme flashback) ile son derece yanıcıdır. Sonuç olarak, bu kaynaktan uzağa çeker ocak kullanılmalıdırateşleme s.
      3. baş yukarı yapılarla spin-lak PDMS damga yerleştirin. yapıların üstüne: sıvı PDMS (20 ul) etrafında birkaç mikrolitre küçük bir damla (pre-polimer çapraz bağlayıcı ağ / ağ 1:10) koyun. 30 saniye için 1500 rpm'de döndürün kat yapıları üzerine PDMS ince bir tabaka yatırmak.
         NOT: damga merkezinde küçük bir delik olan spin-lak ayna yerde bir Petri kabı kapağı üstündeki damga uymuyorsa.
      4. tevdi spin kaplı PDMS tabakasını sertleştirmek için 4 saat boyunca 65 ° C 'de fırında damgasını.
      5. 30 saniye boyunca oksijen plazma temizleyici kullanarak, bir cam lamel # ile birlikte, baş yukarı PDMS damga koyarak çapı 0 25 mm ince PDMS katmanı etkinleştirin. bir sonraki aşamada hızlı devam edin.
         NOT: Diğer kalınlıkları, şekiller ile lamelleri ve boyutları da kullanılabilir. Ancak, bazı hücresel yapılar seçilen lamel kalınlığı ve objektif bağlı görselleştirmek zor olabilirbüyütme ve / veya NA ve / veya çalışma mesafesi. objektif bir fiş kontrol edin.
      6. temas halinde cam lamel ile damga (ince spin kaplı tabaka ile taraf) yerleştirin. yavaşça tüm cımbız ile damganın yüzeyi etrafında Basın 'bağ' yapmak için. Son olarak, yaklaşık 10 saniye boyunca pul üstüne sabit bir basınç tutun.
      7. Hafifçe 30 dakika 'soyma' kurtarmak '' eggcups 'için lamel dışarı damga sonra (Şekil 1). etanol ve kuru ile iyice durulayın. (Onlar 'unpeeling' adımında ayırmak yani) pdms 'eggcups' de cam lamel yapıştırılır değilseniz, plazma temizleyici ayarlarını düzenlemeyi düşünün ve adım 1.3.1.5 de yeniden başlatın.
         NOT: Bu adım hassastır. ince PDMS tabakasının lamel ve / veya dekolmanı kırılmasını önlemek için dikkat edin.
      8. 1 mm x 1 tedavi PDMS küçük bir parça (sap) Tutkalmm sıvı PDMS küçük bir damla ile lamel kenarında hacminde 3 mm x ve daha önce olduğu gibi PDMS tedavi. Bu (Şekil 1 e bakınız) daha sonra örnek manipülasyonu kolaylaştıracaktır. Bu adım isteğe bağlıdır.
   2. Strateji 2
      1. 30 saniye boyunca oksijen plazma tedavisi ile imal PDMS pulları hidrofil. toz birikmesini önlemek için kapalı bir Petri kabı geçici olarak aktif pul saklayın.
         NOT: Plazma diğer gazlar kullanıldığı takdirde fuar süresini ayarlayın.
      2. 30 saniye için 15 W 25 mm çapında cam lamelleri # 0, oksijen içerikli plazma işlemiyle hidrofilize. bir sonraki aşamada hızlı devam edin.
         NOT: Diğer kalınlıkları, şekiller ile lamelleri ve boyutları da kullanılabilir. Ancak, hücresel yapılar seçilen lamel kalınlığı ve objektif özelliklerine bağlı olarak görselleştirmek için zor olacak (yukarıda nota bakın).
      3. Spin-katlı çapraz bağlayıcı ağırlık / ağırlık PDMS (1:10 arasında, küçük bir damla: Ön-polYmer) cam lamelleri üzerine birkaç mikrolitrelik. Spin-kaplama 1500 rpm'de 30 saniye boyunca yaklaşık 50 um'lik bir son kalınlığı için.
      4. Sıvı PDMS küçük bir damla ile lamel kenarında hacmi 1 mm x 1 mm x 3 mm tedavi PDMS küçük bir parça (handle) Tutkal ve daha önce olduğu gibi PDMS tedavi. Bu (Şekil 1 e bakınız) daha sonra örnek manipülasyonu kolaylaştıracaktır. Bu adım isteğe bağlıdır.
      5. Temiz bir toz birikimi korumak için bir Petri kabı içine silme üzerine geçici olarak PDMS kaplı lamelleri saklayın.
      6. Her pul üstüne Silanizing reaktif bir damla koyun ve 1-2 dakika boyunca buharlaşmasına izin verin. Daha sonra, _{bir N2} akımı altında kurutun.
         NOT: Bu adımda, pul geçici deformasyon buharlaştırma gözlenebilmektedir. Damga mikro yapıların herhangi bir kalıcı deformasyona uğramadan _N2 ile kurutulduktan sonra tekrar orijinal şekline geri olacaktır.
      7. üstünde çok nazikçe Silanlanmış damga BırakPetri kabındaki saklanan cam lamel PDMS-spin kaplı. Her iki taraf da tamamen temas sırasında paralel olduğundan emin olun. tuşuna basarak veya PDMS kaplı lamel üzerine yerleştirdikten sonra damga hareketli kaçının.
      8. Hava kabarcıklarını çıkarmak için 1-2 saat vakum örnekleri ile Petri kabı yerleştirin.
         NOT: Numuneler damga değiştirmesini önlemek için tamamen yatay olduğundan emin olun. Ayrıca potansiyel vakum pompası neden titreşim kaçının.
      9. 4 saat 65 ° C'de bir fırına yerleştirin.
      10. Yavaşça, 'eggcups' ortaya çıkarmak için damga soyulabilir. etanol ve kuru ile iyice durulayın.
          NOT: Bu noktada Pratik gereklidir. ince PDMS tabakasının lamel ve / veya ayrılma kırılması kaçınarak dikkat edin.

2. 'Eggcups' içine Hücreleri Tanıtımı

memeli hücreleri içinde 'eggcups' PDMS yüzey KD tanıtmak içined dışı matrisin yapışma proteinlerine fonksiyonalize edilmesi. Bu örnek, fibronektin, ancak kolajen gibi diğer ilgi çekici proteinler, kullanır kullanılabilir.

1. 30 saniye için oksijen plazma temizleyici 'eggcups' hidrofilize.
   NOT: Gerekirse parametreleri optimize edin.
2. Sığır kaynaklardan 20 ug ml PBS 1x çözümü ^-1 fibronektin hazırlayın.
3. 5 dakika boyunca UV 'eggcups' sterilize edin. Tüm 'eggcups' alanı kapsayacak ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona fibronektin çözeltisi (20-50 ul) etrafında küçük bir damla bırakın. kuruyarak örnek koruyun.
4. nazikçe PBS 1x ile 'eggcups' durulayın. 3 kez tekrarlayın.
   Not: Örnek birkaç hafta boyunca karanlıkta 4 ° C de, hemen veya hafızaya kullanıma hazırdır.
5. yüksekliği 63 mm, dış yarıçapının, 26 mm ve 50 ml'lik bir tüp içine, iç yarıçapı boyutları 7 mm'lik silindirik bir ölçüye plastik bir parça ilave edilmiştir (bkzŞekil 2), ²⁰
   UYARI: öğelerini UV sterilize veya onlara önceden kullanımını sterilize edin.
   NOT: Bu parça kolayca laboratuarda imal edilebilir. veya herhangi bir kullanılabilir makine atölyesi ile.
6. Tüp içinde, hücre kültür ortamında 13 ml koyun (Tablo 1 e bakınız). orta numunenin tam daldırma sağlamak için silindirik parça üzerinde en az 2 cm doldurmalıdır.
   NOT: Belirli hücre tiplerinin ayrıntıları ve bu maya veya C gibi diğer model sistemler için elegans embriyolar ve kullanılan ilgili orta bölüm 5 ve Tablo 1 'e bakın. açıklanan protokol HeLa, NIH3T3 hücreleri ve diğer hücre çizgileri (Tablo 1 e bakınız) için optimize edilmiştir.
7. Plastik parçanın üst tarafına çok yumuşak tüp ve paralel içindeki 'eggcups' tanıtılması. PDMS kolu kullanarak örnek tutmak için keskin cımbız kullanın. Basın nazikçe ona kadar lamel plastik parça, un üst tarafının üstüne yatıyortamamen batırılır e (bakınız Şekil 2).
   NOT: Bu keskin ve düz cımbız kullanılması tavsiye edilir. Kavisli cımbız ile, numunenin manipülasyon zordur ve kırılmasına neden olabilir.
8. Kültür hücreleri P60 Petri kabındaki% 80-100 izdiham kadar ve trypsinization bunları toplamak.
   Not: Hücreler transfekte edilmiş ya da ilgi duyulan herhangi bir ilaç ile tedavi edilen vahşi tür olabilir.
   NOT: 'eggcups' girmek için tek hücre önlemek olacaktır hücre agrega oluşumu önlenmelidir. Bu adım, pipet yukarı ve aşağı iyice trypsinization sonra optimize etmek.
9. 5 ml kültür ortamı içine hücreleri yeniden askıya. 'Eggcups' üstünde hücrelerinin 200 ul pipetle.
   NOT: 'eggcups' üst ancak fiziksel temastan kaçınma mümkün olduğunca merkezli olarak hücreleri bırakın. Bu kırılmasına ve / veya numunenin zarar görmesini önleyecektir.
10. 2 dakika süreyle 1800 xg'de santrifüj.
    NOT: İlk santrifüj sonra, bir mikrofon kontrol'Eggcups' doldurma yüzdesi roscope.
11. Pipet 2 dakika süreyle 1800 xg'de 'eggcups' ve santrifüj üstünde hücrelerin tekrar 200 ul. Doldurma yüzdesi optimize etmek için üç kez olmak üzere toplam için tekrarlayın.
    NOT: Geçen santrifüj sonra, bir mikroskop ile 'eggcups' doldurma yüzdesini kontrol edin. Gerekirse, istenen dolum yüzdesi ulaşana kadar doldurma + santrifüj adımları tekrarlayın.
12. PDMS kolu tutan keskin cımbız kullanarak tüpten örnek çıkarın. 'Eggcups' tutulur değil 'rahatsız edici' hücrelerde dikkatli olmak emin olun (bakınız Şekil 2).
13. ortam ile bir Petri kabındaki numune yerleştirin. yavaşça sonraki mikro dizinin her tarafına (toplam 4 tarafı) kadar pipetleme ve üç kez aşağı 'eggcups' olmayan hücrelerin aşırı kaldırmak için durulayın.
    NOT: Pipetleme çok güçlü yayımlayabilir'Eggcups' dışarı bazı hücreler.
14. nonattached hücreleri çıkarmak için taze ortam ile orta yerine.
    Not: Bu adım, ilgi konusu olan, bir ilaç ilave edilebilir.
15. Hücreleri düzeltmek veya time-lapse imaging.See adım 4.1 için onları hazırlamak.

Cytokinetic Yüzük Kapanış: 'Eggcups' Aktif Hücresel Dynamics 3. Gözlem

Not: Bu örnek miyozin ve aktin MYH10-GFP ve LifeAct mCherry transfekte edilir HeLa hücrelerini kullanır, sırasıyla, hücre mitoz sırasında cytokinetic halka kapatma kilit rol oynayan aktif moleküller. Cihaz çapı 25 um mikro boşluklara sahip hazırlanır. kendi gözlem, bir Epifloresans inverted mikroskop, kullanılan bir 60X petrol amacı (1.40 NA, DIC, Planı Apo) ve GFP (miyozin) ve TxRed (aktin) filtreleri ile donatılmıştır. Alternatif dik konfokal mikroskop bir 25X veya 63X HCX IR APO L su objektif (0.95 NA) ile donatılmış, kullanılmıştır. Bu EXA içinmple, son derece çifte timidin blok, mitoz blok veya mitotik sallamak-off yöntemi ^21-24 kullanarak hücreleri senkronize etmek tavsiye edilir.
NOT: 'eggcups' için kullanılan PDMS kalınlığı ters ve dik yerleştirilmiş mikroskoplar hem hedeflerin çeşitli kullanımını sağlar.

1. Talep mikroskopun tutucu içine 'eggcups' ve% 10 FCS, L-15 gözlem, 1 ml aracı ile doldurun. Buharlaşmayı önlemek için, tutucu üst kısmında bir cam kapak yerleştirmek veya medium.Select 60X petrol amacı üzerine mineral yağı, ince bir tabaka uygulanır.
   Not: L-15 ortamı olmayan _CO2 ortamlar için uygundur. DMEM bazı bileşikler otomatik floresan unutmayın. Bu ortam kullanıldığında, 1-2 saat süre ile, yüksek yoğunluklu bir lamba ile aydınlatılarak floresan bileşikler photobleach önerilir.
   NOT: DIC görüntüleme ile çalışırken plastik kapakları kullanmaktan kaçının.
2. 'Eggcups' ve glikozu ile tutucu yerleştirinmikroskopta koyar ve araç. 'Eggcups' kadar aydınlık ışığını kullanarak dikkatli bir şekilde odaklanmak ve hücreler gözlem aynı düzlem içindedir.
3. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. aktin ve miyozin için filtreler TxRed ve GFP seçin; Her kanal için fuar süresini ayarlamak. Tipik bir alım hızı her iki kanal için 5 sn.
   NOT: fuar süresi kullanılan kurulum, boya veya diğer ilgi hücresel organeller bağlı ayarlanması gerekebilir.
4. ilgi bölgeyi seçin ve GFP veya TxRed kanalını kullanarak bir cytokinetic yüzük için ararlar. doğru odaklanın.
   NOT: Halka miyozin keskin ve tanımak kolaydır.
5. Halka tamamen kapatılana kadar her iki kanala otomatik edinilmesini çalıştırın.
   NOT: Bazı photobleaching görülebilir. Bunu azaltmak için mikroskop parametreleri ayarlayın.

'Eggcups' içine Sabit Hücresel Organellerin 4. Gözlem

Bu adım, daha önce veya aşama 3. sonra yapılabilir. Hücreler doğrudan santrifüj aşamasından sonra sabit ve ilgi organel veya mikroskop gözlem sonra lekeli olabilir. Bu örnekte, "eggcups 'in NIH3T3 fibroblastlar üzerinde Golgi aygıtı, çekirdek ve aktin lifleri boyamasını göstermektedir.

1. 'Eggcups' de Hücrelerin Fixation
   1. % 3 paraformaldehit (PFA) ve sıcak 37 ° C hazırlayın. 50 ml tüp (ya da mikroskop sahibinden) 'eggcups' örnek çıkarın ve P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1x kez durulayın.
      Not:% 3 paraformaldehit hazırlanması için protokoller başka yaygın olarak bulunmaktadır.
      DİKKAT: PFA hazırlanması sırasında nitril eldiven ve göz koruması kullanın.
   2. tamamen PBS kaldırmak ve% 3 PFA 1 ml damla ve 17 dakika boyunca inkübe. PFA çıkarın ve PBS 1X 1 ml ile iki kez yıkayın. % 0.5 Trit 1 ml kullanılarak Permeabilize hücrelerive 3 dakika boyunca üzerinde 5 dakika boyunca PBS 1X ile iki kez yıkanır.
2. 'Eggcups' hücrelerin boyanması
   1. PBS: 500 oranında seyreltilmiş bir 1 birincil antikor tavşan poliklonal anti-Giantin Golgi aygıtı boyama hücreleri inkübe edin. Bir plastik film kağıda antikor çözüm 100 ul damla yerleştirin ve baş aşağı 45 dakika süreyle 'eggcups' içindeki hücreleri kuluçkaya yatmaktadır.
      NOT: kurumasını önlemek için bir kapak ile örnek koruyun.
   2. dikkatle 'Eggcups' bırakın ve bir P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1X ile 3 kez, her biri 5 dakika, durulayın.
   3. ve (1: 200) Phalloidin Alexa Fluor 488 ile aktin stres elyafların boyanması için: ikincil antikor Cy3 keçi anti-tavşan (1.000 1) ile PBS içinde bir kokteyl hazırlayın.
   4. Bir plastik film kağıda antikor çözüm 100 ul damla inkübe hücreleri ve baş aşağı 45 dakika süreyle 'eggcups' içindeki hücreleri kuluçkaya yatmaktadır.
   5. Yayın dikkatle 'eggcups 've P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1X ile 3 kez, her biri 5 dakika, durulayın.
   6. Bir plastik film kağıda 1 ug ml ^-1 PBS DAPI 100 ul damla yerleştirmek çekirdek boyanması için inkübe hücreleri ve baş aşağı 45 dakika süreyle 'eggcups' içindeki hücreleri kuluçkaya yatmaktadır. Bu aşama, aşama 4.2.3 ile yapılabilir.
   7. dikkatle 'eggcups' bırakın ve bir P35 Petri kabı içine yerleştirin. PBS 1X ile 3 kez, her biri 5 dakika, durulayın.
   8. kurumayı önlemek için oje ile örnek: (1 v / 1) standart bir mikroskop cam slayt ve mühür PBS: 15 ul Gliserol kullanarak Dağı hücreleri.
      Not: 'eggcups' kalınlığına bağlı olarak, montaj zor olabilir. Kurutma korunan PBS içinde P35 Petri kabı, sonra içine örnek saklanması tavsiye edilir.
3. Mikroskop Gözlem
   NOT: Bu örnekte bir dik konfokal mikroskop kullanılır PMT ve Hibrid dedektörleri ile donatılmıştır. Bir 25X veya 63 X HCX IR APO L su amacı (0.95 NA) numunenin geniş bir alanı sağlamak ve yüksek içerik tarama uygulamaları için cihazın uygulanabilirliğini göstermek için seçildi.
   1. 25X veya 63X su hedefi seçin.
      NOT: Uygulama ve sinyale bağlı olarak farklı hedefleri de kullanılabilir. Ancak yüksek sayısal açıklık hedefleri kullanımı tavsiye edilir.
   2. 'Eggcups' sabit örnek yerleştirin ve dikkatli bir gözlem düzlem içindedir 'eggcups' ve hücrelerin kadar aydınlık ışık (faz kontrast ya da DIC) ile odaklanır.
   3. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. filtreleri GFP, Cy3 ve DAPI aktin, Golgi sırasıyla çekirdek gözlem seçin; Tüm kanallar için fuar süresini ayarlamak.
      NOT: fuar süresi kurulumuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
   4. Seçin ve ilgi bölgeyi odak; görüntü yakalama (bakınız Şekil 3) başlatın.

tle "> 5. Maya Hücreleri Gözlem Adaptasyon ve C Embriyo elegans

1. Fisyon ve tomurcuklanan maya hücreleri
   Not: Bu örnek, sırasıyla miyozin ve aktin için RLC1 mCherry ve KKH-GFP ile etiketlenmiş olan fisyon maya hücreleri kullanır. tomurcuklanan maya hücreleri floresan burada etiketli değil. fizyon maya gözlem için ters dönen disk konfokal mikroskop kullanıldı. Bir 100X HCX PL APO CS yağ objektif (1.4 NA) tüm satın almalar için kullanılmıştır. Seçenek olarak ise, hücreler aynı zamanda, bir 20X faz kontrast hava amacı LCPlanFl (0.4 NA) ile donatılmış bir ters faz-kontrast mikroskobu kullanılarak gözlenmiştir. Bu örnekte, iletişim kuralı, her iki hücre tipinde için aynıdır.
   1. yukarıda tarif edildiği gibi "eggcups 'yüzeyi hazırlayın. Fizyon ve çiçek mayası hücreleri için, çapı 5 um boşluklarının hazırlanması (Tablo 1 e bakınız). Bu durumda, yüzeye yapışma proteinleri ile fonksiyonalize edilmesi gerekmez.
      NOT: Dolum can konik 'eggcups' kullanılarak optimize edilebilir. Bu şekil yakalar ve santrifüj sonra durulama adımında serbest kaçınarak hücreleri korur. yüzde dolgu yaklaşık% 80 optimumdur. Bu konik 'eggcups' Derin tepkisel iyonla hakketme ¹³ vasıtası ile imal edilebilir.
   2. Uygun kültür ortamı içinde kültürü maya hücreleri 0.2 ve 0.8 aralığında bir optik yoğunluk (OD) elde edilene kadar (Tablo 1 e bakınız). agrega kaldırma Maya hücrelerinin kültür sonikasyon.
   3. santrifüj 'eggcups' maya hücreleri yerleştirin. Santrifüj için uygun OD kültürlenmiş hücreler 4 mL 'eggcups' ile boru üzerine ilave edilir. 'Eggcups' hücreler rahatsız değil iken ilk santrifüj sonra, yavaşça, 'eggcups' olmayan hücrelerin yeniden askıya tüp sallayın. Yine tüp, santrifüj açılması ve iki kez bu adımı tekrarlayın olmadan. Bu birikim, garantiBoş mikro boşluklara içine kültür hücreleri ve dolum yüzdesini artıracaktır.
      NOT: maya çalışırken, bu deneyler sırasında çalışma sıcaklığına önceden ısıtmak santrifüj tavsiye edilir
      NOT: protokol burada durakladı ve sonra 12 saat kadar devam edilebilir. Bu durumda, çalışma sıcaklığında örneği saklamak ve buharlaşmasını önlemek için kapağı.
   4. Bir mikroskop tutucuya 'eggcups' koyun ve görüntüleme için filtre sterilize ortamı ile tutucu doldurun. Yüzen maya hücreleri etkin bir şekilde kaldırılana kadar artık aynı ortamda hücreleri durulayın. durulama işlemi sırasında 'eggcups' hücreleri rahatsız etmemek için özen gösterin.
   5. 100X petrol hedefi seçin ve dikkatli odaklanın. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. fizyon maya için, aktin ve miyozin filtreleri GFP ve TxRed seçin ve her iki kanal için fuar süresini ayarlamak. Tipik bir alım hızı 3 sn.
      NOT: bağlıflorofor, etiketleme türü ve set-up, maruz kalma süresi diğer sistemler için değişir.
2. C. elegans Embriyo
   NOT: Bu örnek, C kullanır 25-30 mikron genişliğinde ve uzun 50-55 mikron elegans embriyolar. ^25'de gösterildiği gibi Embriyolar kültürlenmiştir. C işlemek için nasıl basit bir görsel protokol elegans ²⁶ bulunabilir. Gözlem, bir 40X hava amacı 0.55 NA ile donatılmış bir ters çevrilmiş faz-kontrast mikroskobu kullanılarak yapıldı.
   1. Yukarıda tarif edilen ve çapı 25 um olarak 'eggcups' yüzeyi hazırlanması (Tablo 1 e bakınız). Bu durumda, yüzeye yapışma proteinleri ile fonksiyonalize edilmesi gerekmez.
   2. Kültür C. Uygun kültür ortamı elegans embriyolar (Tablo 1 e bakınız).
   3. Yukarıda açıklandığı gibi santrifüj 'eggcups' embriyolar yerleştirin (2.12 bölümüne 2.6 bakınız) kültür ortamı olarak ultra saf su kullanarak.
      Not: Embriyolar deney süresince normal, aşırı saf su içinde 'davranmak' edildi. Alternatif uzun vadeli deneyler için bir fizyolojik M9 tampon kullanın.
   4. (Bölüm 2.14 bakınız) yukarıda tarif edildiği gibi örnek durulayın. Bir mikroskop tutucu içine 'eggcups' koyun. 40X hava hedefi seçin ve dikkatli odaklanın. yazılımını açın ve parametrelerini ayarlamak. 3 saniyelik bir kazanım hızını seçin.

Sonuçlar

'Eggcups' (AK) 3 boyutlu bir ortamda odaklı hücrelerin ve embriyoların görselleştirme sağlayan bir roman içeriği yüksek-tarama yöntemi vardır. Buna ek olarak, standart 2D (düz) kültürlerde gözlemlemek zor olan bazı hücresel süreçler, bu yeni yöntem ile gözlenebilir. Şekil 1a (Bölüm 1, yukarıda tarif edilen protokol da bakınız AT mikrofabrikasyon için prosedürün bir özetini gösterir ). Yöntem 1b Şekil., Basit, hızlı, verimli ve özel ekipman he...

Tartışmalar

Replika döküm 'eggcups' imal etmek amacıyla kullanılmıştır. üretim süreci bir temiz oda ihtiyacı yoktur; Bazı uygulama gerekebilir rağmen, kolay ve basittir. Özellikle, PDMS damga serbest yüksek kalite 'eggcups' geniş bir alana üretmek için en kritik adımdır. Bu nedenle, özel bir dikkat bu adımda alınması gerekir. Bu adımı tekrar tekrar başarısız olursa, silanizasyon ve plazma bağlayıcı önce plazma temizleyici parametrelerini optimize etmek düşünün. Yetersiz silanizasy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ddH20 (ultrapure)	Millipore	-	Use always fresh water.
Parafilm (plastic film)	Bemis	PM-999	Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness.
Photo-mask	Selba	-	http://www.selba.ch
Silicon wafer	Siltronix	-	http://www.siltronix.com/
SU-8 photoresist	MicroChem	2000 series	http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
SU-8 developer	MicroChem	-	http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm
working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information
2-propanol	Sigma-Aldrich	19030	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en&region=CA
Available from multiple companies.
Sigmacote (siliconizing reagent )	Sigma-Aldrich	SL2-25ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr&region=FR
harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Chlorotrimethylsilane (TMCS)	Sigma-Aldrich	386529-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr&region=FR
TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition
Nitrile gloves	Kleenguard	57372	http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m
Available from multiple companies.
Glass coverslips #0	Knittel glass	KN00010022593	http://www.knittelglass.com/index_e.htm
Very fragile. Manipulate gently.
Sharp straight tweezers	SPI	0WSSS-XD	http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7
50 ml tube	BD Falcon	352070	http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp
Available from multiple companies.
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 kit	http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN
The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies.
Microscope glass slides	Dutscher	100001	http://www.dutscher.com/frontoffice/search
Available from multiple companies.
DMEM high-glucose medium	Fisher Scientific	41965-039	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Bovine calf serum	Sigma-Aldrich	C8056-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en&region=CA
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200-072	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS 1x	Fisher Scientific	14200-067	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
PBS is at 10x and should be diluted to 1x using ddH2O
L-15 medium	Fisher Scientific	21083-027	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD
Medium for atmospheres without CO2 control
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Penicillin & Streptomycin	Fisher Scientific	15140-122	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM
Petri dish P35	Greiner	627102	http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/
Petri dish P60	Greiner	628163	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/
Petri dish P94	Greiner	633179	http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/
Paraformaldehyde 3 %	Sigma-Aldrich	P6148-500G	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr&region=FR
Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information.
Triton 0.5 %	Sigma-Aldrich	93443-100ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488	InVitrogen	A12379	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379
dissolve powder in 1.5 ml methanol
Alexa Fluor 647	InVitrogen	A21245	1:200 dilution in PBS 1x
rabbit polyclonal anti-Giantin	Abcam	ab24586	1:500 dilution in PBS 1x
http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html
rabbit anti-anillin	Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008).		1:500 dilution in PBS 1x
Anti-phosphotyrosine	Transduction Lab	610000	http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000
Cy3 goat anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	111-166-047	http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp
1:1,000 dilution in PBS 1x
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr&region=FR
1 mg/ml for 1 min
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410-500ML	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en&region=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax
HeLa cells	-	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
NIH3T3 cells	ATCC	-	Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1
Fission yeast	-	-	For details on strains, contact the corresponding author.  See also Table 1
C. elegans worms	-	-	For details, contact the corresponding author.  See also Table 1
YES (Agar) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-732	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
YES (Media) + 5 Supplements included	MP Biomedicals	4101-522	http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search
For preparation: follow the instructions as given on the box
EMM (Media)	MP Biomedicals	4110-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search
For preparation: follow  instructions as given on the box
Filter sterilized EMM (Media) - Only for imaging	MP Biomedicals	4110-012	For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence.
Supplements (for EMM)	MP Biomedicals	4104-012	http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search
(Add 225 mg/L into the EMM media before autoclaving or filtering)
Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters	Millipore	-	http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2