Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zigotların

Özet

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Özet

Echinoderms uzun gen düzenlemesi ve gelişimsel süreçlerinin evrim çalışma için daha yakın üreme ve gelişme çalışmaları için bir favori model sistem olmuştur ve. Deniz yıldızı Patiria miniata önce deniz kestanesi, Strongylocentrotus purpuratus ve Lytechinus variegatus hemen hemen sadece çalışmalar yapılmıştır Bu tip bir model sistem olarak yaygınlık kazanmaktadır. Bu model sistemler bir avantajı da, belirli bir genin veya aşağı regüle kadar olan bir grup hücre etiketleme ya da bir raportör genin modifiye edilmiş embriyoların üretilmesi kolaylığıdır. Tek bir yöntem, modifiye edilmiş mikro-enjeksiyon embriyo çeşitli oluşturma yeteneğine sahiptir. Burada, P. gamet elde edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır miniata, zigot üreten ve mikroenjeksiyon yoluyla perturbe maddeleri eklemek. Sağlıklı morphant embriyolar bundan sonra ge nicel ve nitel çalışmalar için izole edilmiştirne fonksiyonu. Bu organizma için genomu ve transkriptom verilerin mevcudiyeti uygulandı ve gerçekleştirilmesinden kolaylığı olan çalışmalar türlerini artmıştır.

Giriş

(Yaygın yarasa yıldızı olarak da bilinir), deniz yıldızı, Patiria miniata, bir ^{6 8} evrimsel ^4,5 gelişim hücresel ^{1- 3} çeşitli, ve ekolojik çalışmalar ^{9 11} için ilginç ve çok yönlü bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Yetişkin P. miniata Baja California ¹² Sitka, Alaska pasifik kıyılarında dağıtılır ve kolayca deniz akvaryumunda tutulur. Oositler elde yıl boyunca ve her kadın onlarca yumurta binlerce tutabilir. Oositler kolayca olgunlaştı ve dıştan ¹³ döllenir. Oluşan embriyolar kolay gözlem için izin şeffaf; onlar eşzamanlı geliştirmek ve geliştirme için sadece deniz suyu gerektirir. Tüm genom düzeneği ve çok sayıda transcriptomes, P. mevcuttur miniata ( Echinobase.org ). Bu avantajlar araştırma aralığı için ideal hale getirmektedirve öğretim amaçları.

Son yıllarda, S. miniata gelişim düzenleyici gen şebekesi için bir model sistem ^14-16 analiz haline gelmiştir. Bu tür çalışmaların amacı, düzenleyici genlerin tüm iltifat belirlemek ve bunların etkileşimlerinin ağı belirlemektir. Bu çalışmaların çoğu antisens oligonükleotidlerinin ya da in vitro sentezlenen mRNA ile tanıtım yoluyla perturbe gen ifadesini gerektirir. Buna ek olarak, sis düzenleyici analizler düzenleyici DNA ¹⁵ işlevini karakterize etmek için kullanılır. Bu analizler karışıklık reaktifler ve / veya DNA muhabiri embriyolara inşa tanıtılması gerektirir. Ayrıca, bu düzensizliklerin bir aşağı akış etkisine karakterize etmek için, bir potansiyel hedefler, gen ekspresyonunda değişmeler için çok sayıda embriyolar tahlil gerekir. Zigot yüzlerce mikroenjeksiyon teknikleri bu işin merkezindedir.

P. dahil derisidikenliler miniata , cinsel olgunluğa ulaşmak için birçok ay gerektirir. Bu nedenle, geliştirilmesi ve bu deneysel hayvan transgenik çizgiler korumak için genel olarak pratik değildir. Bu nedenle, transgenik yetişkinlerin üreme verimli embriyolar modifiye oluşturabilirsiniz olamaz. Bunun yerine, pertürbasyon mikroenjeksiyon yoluyla de novo gerçekleşmesi gerekir. Mikroenjeksiyon hücre geçirgen olmayan reaktif ile embriyolar değiştirmek için bir fırsat sunuyor. Aşağıdaki protokol, bir 2-3 saat mikroenjeksiyon yoluyla oturma döllenmiş yumurta yüzlerce DNA, mRNA, hücre izleyiciler ve morfolino antisens oligonükleotitlerin bir yöntemi tarif etmektedir. Bu gibi akış aşağı deneyler çeşitli için yeterli malzeme oluşturur, ancak in situ hibridizasyon, RNA sekansına ve Western blot ile, QPCR ancak bunlarla sınırlı değildir.

Protokol

Pratik olduğu kadar 15 ° C'de tüm deniz suyu veya yapay deniz suyu (GB), yetişkin hayvanların ve kültürleri tutun. Emin olun yumurta ve zigot SW dalmış tutulur.

Damıtılmış veya ters ozmoz su ile yeniden sahip ticari olarak hazırlanmış deniz tuzu SW kaynağı olarak da hizmet eder. Hidrometre kullanarak tuzluluk kontrol ve optimum düzeyde sağlamak için tuzlar veya su ayarlayın. 1,020-1,025 arasında özgül ağırlık düzeyleri tutun. Tüm cam tutun ve plasticware kimyasallar ile herhangi bir kirlenmeyi önlemek için diğer tüm laboratuvar donatımı ayrı. Deiyonize su ya da su içinde birkaç kez çalkalayın seyreltik sodyum hipoklorür ve zaman zaman ıslatma ile durulanarak temiz embriyo laboratuvar dereceli.

Patiria miniata Yetişkinler 1. alınması ve olgunlaştırılması Gametler

1. Gonadları çıkarılması için bir hayvan seçin. Yumurtalıkların veya testislerin varlığı bakarak çıkarıldıktan sonra seks belirleyin P. çünkü miniata se değildirxually dimorfik.
2. Bir bisturi (Şekil 1A) ile deniz yıldız kolun tarafındaki 1 cm'den daha büyük, küçük bir açıklık, kesin. Küçük künt uçlu forseps geri kesi kenarları çekin kullanma gonad dokusu erişmek ve kesiden yumurtalık dokusu çekin.
   NOT: gevşek gri veya kahverengi doku (Şekil 1B) olduğu gut doku, çekerek kaçının. Testisler beyaz veya bej iken ve görünüm (Şekil 1D) sütlü veya puslanacak deniz suyu neden olacaktır bozulduğunda yumurtalıklar, tipik, turuncu, sarı veya açık kahverengi (Şekil 1C) vardır.
3. Akvaryuma kadın dönün. Yumurtlama neden olabilir işlenmesinin stres yana SW bir kap içinde bir veya iki saat için erkek izole. Hayvanlar kesi boyunca iyileşmek ve birkaç ay için gametler sağlamaya devam.
4. Mümkün olduğu kadar az SW, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine testisler toplayın ve kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin. Bize herhangi testisler değil Mağazabir haftaya kadar 4 ° C 'de toplama gününde ed.
5. SW birkaç mililitre küçük bir cam kültürü çanak yumurtalıklar toplayın. Hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar forseps iki çift dokuyu ayrı kızdırmak, yumurtalık dokusundan oosit bırakın.
   Not: En uygun olarak, oosit kısmı tam olarak geliştirilmiştir. Böyle oosit (Şekil 2B), kahverengi, küçük grenli ve opak olan gelişmemiş oosit alt kümesi karşılaştırıldığında, büyük yuvarlak ve oosit (Şekil 2A) belirgin bir torbacığı sarı veya açık kahverengi açıktır. Oositlerin daha yaklaşık 25% 'den fazla gelişmemiş çeşitten ise, oositlerin elde edilmesi için farklı bir kadın seçin.
6. 200 um bir gözenek boyutuna sahip olan bir gözenekli filtre kap aracılığıyla oosit ve kalan doku dökün ve akışı toplamak. Bu oosit tüm çeşitleri içeren ancak yumurtalık dokusu kaldıracaktır. W püskürtme ile filtre tarafından yakalanan dokudan kalan oosit bağdakibücür şişe ith GB. Filtre bardak 50 ml konik tüp (Şekil 3A-A ") kullanılarak yapılır.
7. 100 mikron gözenekli filtre kap aracılığıyla adım 1.6 den yoluyla akışını dökün. Akmakta olan küçük oosit atın. Filtre üzerinde kalacak olgunlaşması için hazır büyük tam gelişmiş oosit. Temiz bir 200 ml'lik bir cam kaba oosit durulayın.
8. Oosit 200 ml'lik bir cam kabın SW 95 ml ilave edilir. 10 uM'lik bir son konsantrasyon 200 uM 1-metiladenin 5 ml.
9. 15 ° C'de büyük bir sığ kültür çanak ve yere oosit aktarın. Hacim kültür tabağına bir yüksek yüzey alanlı oksijen alışverişine izin verir. Oosit olgun değil ya da bu olgunlaşma aşamasında kalabalık ise iyi gelişmemiş olabilir. Kültür az 200 oosit / ml kadar birkaç GB yemekler artı 10 uM 1-methlyadenine ayrıldı.
10. F oosit bu olamayacağım oosit kılacak gibi artık 45-90 dakika boyunca olgun, ama izin verertilized. Olgunlaşma tam olup olmadığını belirlemek için, bir diseksiyon kapsamında oosit bakmak. Olgunlaşma sırasında hücre zarı ile Germinal vezikül doğru hareket eder ve sigortalar. Daha sonra bozulur ve bu nedenle artık olgun oosit (Şekil 2C) görülebilir.

Olgun OOSİT 2. Döllenme

1. GB yaklaşık olarak 1 ml kültür, küçük bir cam tabak içinde testis dokusunda, yaklaşık bezelye boy, kıyma küçük bir küme seçti.
2. Olgun oositlerin yaklaşık 100 ml elde edilen süt, deniz suyunun 2-3 damla transferi ve karıştırmak için kültür kaplarına girdap Pasteur pipet kullanın. Testis doku parçalarını transfer kaçının. Polyspermy ve sonraki zayıf gelişmesine neden olabileceğinden spermlerin daha büyük miktarlarda ekleyerek kaçının.
3. Birkaç dakika sonra, bir diseksiyon kapsamında oosit gözlemlemek. Döllenmiş yumurta veya zigot, cel kapalı yükselir net bir kabarcık bir gübreleme zarf varl membran (Şekil 2B).
   NOT: kötü fertilizasyon oranları da iyi gelişmemiş olabilir sağlıksız bir kültürün bir göstergesi olduğundan yumurta az 90 civarında daha% döller eğer kültürü ile devam etmeyin.
4. Döllenme işlemi tamamlandıktan sonra, 100 mikron gözenekli filtre içinden dökülmesi ve taze yazılımı ile bir kültür kabı içine durulanarak zigot üzerinde verilmeksizin değiştirilebilir. Bu oksijen açlığı önlemek için fazla sperm kaldırmak için önemlidir. 15-30 dakika boyunca 15 ° C 'de kültür tabağına yerleştirin.

3. De-jelleştirici ve Kürek döllenmiş yumurta

1. 60 x 15 mm polistiren Petri kabı kapağı alarak enjeksiyon yemekleri hazırlayın.
   1. Mikroenjeksiyon mikroskop görüş alanını eşleşen alanı çevresinde yemeğin arkasında, üzerinde kalıcı bir işaretleyici kalem çizgi çizin. Bu, tüm embriyolar sıralı görüş alanı içinde mikroskop olmasını sağlar.
   2. Daire, p bir çizgi puanı bir cam Pasteur pipet kullanınreferably daire (Şekil 3B) bir tarafında kapalı. Enjeksiyon iğneleri (4.5 Adım) kırmak için daha sonra bu hattı kullanın.
      Not: Reaktifler genellikle deniz kestanesi embriyolar, örneğin, protamin sülfat ya da poli-L Lisin, gereksiz yapıştırmak için kullanılan. P. De-jöleli miniata zigot kaplanmamış plastiğe çok iyi sopa. Onlar cam yemekler iyi sopa unutmayın.
2. Kaplanacak yüzey olması ve böylece her bir çanak yaklaşık 10 mi GB ekleyin, ancak bu embriyolar bozmakta sıralı olabilir su çanak aşırı sıçrama olmaz.
3. P. çıkarın önce kürek çekme asit SW ile miniata zigot jöle ceket. Bu jöle ceket modeli deniz kestanesi türleri için gözlenen daha kapsamlıdır.
   1. PH 4,0-4,2 aralığında asit SW hazırlayın. PH değeri, normal gelişim izin verecek şekilde jel kaplamanın etkin şekilde çıkarılmasını sağlamak için çok önemlidir.
   2. GB 1 L'lik bir stok SW içinde 1 N (1 M) tek HCI damla ekleyin. Her damla tamamen karıştırmak için izin verve daha HCI ilave edilmeden önce pH izlemek.
      NOT: Uygun pH HCl sonuçlarının birçok ml biri, ancak bir kerede tüm hacmi eklemeyin.
      NOT: SW ile davlumbaz 1 N HCI hazırlayın ve 12 N (12 M) HCI.
   3. 100 mikron gözenekli filtre üzerine onları dökerek zigot üzerinde SW çıkarın. (Yaklaşık 10 mi) mümkün olan en küçük SW miktarda bir 200 ml'lik bir cam kaba durulayın. Asit SW (pH 4,0) ile 150 ml beher kadar doldurun ve zigot 3 dakika boyunca asit SW oturmak için izin.
4. Iki adet 200 ml'lik çanaklar arasında ileri ve geri onları dökerek zigotlardan jöle ceket şerit, 200 mikron mesh filtre üzerinden zigotların geçen her zaman. Bir 2 dakikalık bir zaman penceresi üzerinde 5-10x çevresinde filtre içinden zigotların dökün.
5. 100 mikron gözenekli filtre üzerine zigotların dökerek asit SW çıkarın. SW ile küçük bir cam kültürü çanak içine zigotların durulayın. De-jöleli zigot plastik tabaklar yapışabilir. Satır embriyolar derhal; daha j üretmeye başlarzamanla plastik tabaklar zayıf yapışmasına yol açar kedward ceket.
6. Cam kültürü çanak zigotların pick up ve enjeksiyon yemekleri düz çizgiler içine yerleştirmek için bir ağız pipet (Şekil 3C-C ') kullanın. Cam, yumuşak kadar bir alev üzerinde bir Pasteur pipeti ince yan merkezini eritin. Hızlı bir cam çok ince esneme elde etmek için ayrı cam uçlarını çekin. Cam soğuduktan sonra, (bir ağız pipet Wessel ve arkadaşları görmek hazırlama hakkında ek bilgi için., 2004 ¹⁷ Sweet ark. 2004 ¹⁸⁾ Pasteur pipet küçük ucunu kesiyorum.
   1. Sadece tek bir zigot girerek bir seferde pipet çıkış böylece çapı, embriyoların çapından biraz daha büyük olan bir kürek pipet hale getirmektedir. Bu, tek bir sıra oluşturacak şekilde izin verir. Küçük çaplı pipetler döllenme zarfı şerit ve P. gibi zigotların bozabilir miniata zigot hiyalin membran a yoknd oldukça yumuşak.
   2. Zigot plastik tabak sopa yoksa, ek süre asit SW (birkaç dakika daha kadar) için saklayın. Alternatif olarak, daha küçük çaplı bir pipet zigotlar daha etkili bir şekilde yapışmasına izin vermek için jöle katı çıkartılmadan yardımcı olabilir.
   3. Zigot biraz olumlu batmaz ve yüzer ya da sadece yemeğin alt yukarıda hover eğiliminde. Zigotlar nazik bir pipet (Şekil 3D) çıkar çıkmaz, çanak yüzeyine bastırılır, böylece bu durumda kürek pipet yerleştirin.
      NOT:. Bu yemekler birçok satır sığdırmak için izin olan P. miniata embriyonik membranlar zamanla nüfuz daha zor hale gelmez ve bu nedenle tek bir tek tabak üzerinde zigot yüzlerce enjekte edebilir.

Zigotlar 4. Enjeksiyon

1. Final konsantrasyona uygun morfolino antisens oligonükleotitlerin konsantrasyonları (MASO), mRNA ya da enjeksiyon çözeltileri DNA'lar ile hazırlayın200 mM KCl entration. 400-800 uM MASO ve DNA, 2.5 ng / ml toksisiteyi en aza indirirken, morphant fenotipleri üretme eğilimindedir. Yumurta nihai konsantrasyonu, bir başlangıç ​​konsantrasyon ^14. 1/125 olur. 5 dakika boyunca 65 ° C'ye kadar Masos ısı ihtiva eden enjeksiyon çözeltileri için kullanımı ve daha sonra oda sıcaklığında saklamak için hemen önce.
   1. Enjekte edilen embriyolar sıralama kolaylığı için,% 0.1 lik bir konsantrasyon elde etmek için enjeksiyon solüsyonu için rodamin dekstran izleyici ekleyin.
2. Üreticinin talimatlarına göre çekme aracı, bir iğne cam kılcal boru (1,0 mm dış çaplı x 0.75 mm İÇ, 100 mm uzunluk) çekerek enjektör hazırlayın. Deniz kestanesi enjeksiyon için uygun iğneler de deniz yıldızları için iyi çalışabilir, böylece benzer parametreleri ¹⁹ kullanın.
3. Bir Microloader pipet kullanarak bir enjeksiyon iğnesi içine enjeksiyon solüsyonu yaklaşık 2 ul yükleyin.
4. M içine iğnenin künt ucunuanipulator. Set 100 milisaniye darbesine Picospritzer ve 40 psi hava basıncı.
5. Mikroskop sahneye sıralı embriyoların bir tabak koyun ve görüş alanındaki tüm embriyolar var. Atılan hattı iğneye yakın tarafında olacak şekilde çanak yönlendirilir. Uç hattının ortasına yakın ve sadece su yüzeyinin üstünde olacak şekilde yaklaşık 60 ° 'lik açı iğne yerleştirin.
6. Atılan hat odaklanın ve ucu odak noktası haline gelene kadar iğne düşük. Biraz daha ipucu indirin ve attı hattının sırtlar içine hafifçe çalıştırarak açık ara. Çanak yüzeyinden ucu kaldırın ve zigot ilk satırının üstünde konumlandırmak ve zigot odaklanmak.
7. Bir 60 ° bir açıda gelen zigotun merkezi impale sağlayacak şekilde ucu aşağı indirin. İğne kolayca P. nüfuz miniata zigot. Enjeksiyonundan bir bolus tanıtmak için ayak pedalı (veya enjeksiyon iğnesi malzeme zorlayarak diğer araçlarla) adımembriyo ölü m çözeltisi.
8. % 20-30 embriyo çapı ya da 25 ile 80 pl bir bolus nişan. Bolus bundan daha büyük veya daha küçük ise, Picospritzer üzerinde enjeksiyon süresini ayarlamak ve sonraki embriyo enjekte edilir. İstenen bolus boyutu elde etmek süresini ayarlamak için devam edin. 100 msn süresince başlayın. Yaklaşık 200 milisaniye daha büyük uygun hapını tanıtmak gerekirse iğne Yeniden bölünürler. İğneyi atın ve en az 15-20 msn iğne boyutu çok büyük olduğu gibi bu hap boyutu elde etmek için gerekli ve normal gelişimini bozabilir, yeni bir tane hazırlayabilirsiniz.
9. Enjeksiyon yemeğin kalan zigotların enjekte edin. Embriyolar kolayca bölünme başlayana kadar ve ilk bölünmesinden sonra tek blastomer içine enjekte edilebilir. Periyodik olarak, iğne yapışmazlar, zigotların kaldırmak için su yüzeyinin üzerinde iğne kaldırın. Gerekli iğne ucu yeniden kırmak ya da bir tıkanma meydana gelirse yeni bir iğne yüklerseniz.

5. Alt Analizi için Embriyolar Enjekte Toplama

1. Embriyolar SW 15 ° C'de geliştirmeye olanak sağlar. Oksijen alış verişine olanak sağlamak için, kültürler içinde hacme büyük bir yüzey alanına koruyun. Embriyolar kalabalık değil emin olun; veya 200 embriyolar / ml altında kültürleri tutun. Embriyonun istenilen aşamaya bağlı olarak, yaklaşık 20-24 saat sonrası döllenme enjekte embriyolar toplamak planlıyoruz.
   NOT: Bu genellikle sıralamak ve normal gelişen embriyo kolayca morfolojik ayırt edilir, ancak henüz yüzme olmadığından toplamak ve ideal bir zamandır.
2. Embriyolar yumurtadan varsa, yavaşça yüzme önlemek için şok tuz. SW yavaşça girdap şeklinde sallandı enjeksiyon çanak GB 10 ml 5 M NaCI 200 ul ilave edin. Bir kaç dakika sonra, embriyolar yemeğin altına düşecek. Bu toplayın ve normal tuzluluk SW taşıyabilirsiniz.
3. Injecti kullanılan izleyici ile uyumlu uygun bir floresan ışık kaynağının altında enjekte embriyolar toplayınçözüm üzerinde. Hiçbir izleyici kullanılmışsa, sıralama embriyolar normal morfolojiye seçmek için.
4. Ağız pipet kullanarak, SW asgari bir miktarı ile embriyolar floresanlama çekmek ve SW ile dolu küçük bir kültür çanak içine üfle. İdeal ağız pipetler embriyolar onlara zarar vermeden ve dışarı çıkardı, ama istenmeyen embriyolar ve yabancı GB da yukarı çekti, böylece büyük olmamak için yeterince büyük bir açılış var.
5. Bir kez istenen tüm embriyoların yeni bir çanak içine toplanmıştır, floresan ışığı altında embriyoların gözlemlemek ve herhangi bir un-enjekte edilen embriyolar veya az gelişmiş embriyolar kaldırmak.
6. Kültür bir kuluçka istenen aşamalarında embriyolar sıralanır ve görüntüleme veya diğer istenen protokolleri ile devam edin.

Sonuçlar

Bu protokolün amacı, embriyo içine reaktifler tanıtmaktır. Bu, yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonunu tahrik eden bir raportör konstruktunu bir DNA enjekte edilerek protokol etkinliğini göstermektedir. DNA bölünmesi sırasında ilk olarak birleştiren Enjekte embriyolar klonal yamalar (Şekil 4A-B) GFP ifade eder. Embriyoların içine uygulanması tercih edilmekte olan birçok reaktif maddeler, yüksek miktarlarda ve embriyo optimal gruplar için toksiktir. , Gelişimini geciktirmek döl...

Tartışmalar

Bu tekniğin acemi kullanıcılar için zor ama başarıyla morphant embriyolar oluşturmak için gerekli olan iki kritik adımlar vardır. İlk olgun ve düzgün döller sağlıklı oosit seçmektir. Bir kültürde normal gelişim yüzdesi mevsime göre, hayvanın sağlığını ve oositler tek bir bireysel, hasat edilen sayısıdır. Oositler Ekim ile Nisan arasında daha kaliteli olma eğilimindedir. Bu çoğunluk Şekil 2A yerine Şekil 2B gibi bakmak emin geçmeden önce oosit dikk...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Methyladenine	Acros Organics (Fisher Scientific)	AC20131-1000
190 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0185-C/5PK-05
100 micron nitex nylon filter	Small Parts (originally Sefar)	CMN-0105-C/5PK-05
Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Capillary tubing	FHC, Inc	30-30-0	For pulling microinjection needles
Model P-97 Needle Puller	Sutter Instruments	P-97
Dextran, Rhodamine Green	Life Technologies	D7163	If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer
Instant Ocean Sea Salt	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Also available in many pet stores
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003