Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Özet

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Özet

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Giriş

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms^1–3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change⁴, the spread of invasive species⁵, and host-pathogen interactions^6,7.

The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.

Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism^8–10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa^11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus^15–17. Diapause eggs are more desiccation resistant^5,18 and contain more total lipids¹⁹ than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects^20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect²². In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.

This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause²³, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

İki A. 1. Larva Yetiştirme albopictus Grupları Erişkinliğe

1. İki optimum diapause ifadesi ¹⁶ 21 ° C'de programlanabilir aydınlatma ile fotoperiyot dolapları ve yaklaşık% 80 bağıl nem ayarlayın.
   1. Bir 16L Program bir kabine: 8K ışık: karanlık döngüsü (non-diapause LD fotoperiod uyaran). Bir 8L ikinci kabine ayarlayın: 16D ışığı: karanlık döngüsü (uyarıcı diapause) ^13.
   2. Her iki dolapları aynı zamanda Programın 'ışıklar' fotoperiyodların arasındaki sirkadiyen zaman senkronize etmek.
2. Deney gerçekleştirmek için gerekli yumurta miktarını hesaplayın. Kafes başına 300-500 yumurta hedefleyin. En azından üç diapause kafesleri çoğaltmak ve olmayan üç-diapause kafesler RNA üretimi için gerekli olan çoğaltmak. Bu deney başına 1,800-3,000 yumurta Takriben için toplamları.
   1. Yaklaşık içine deiyonize H ₂ O 500 ml yumurta kağıtları daldırarak tarafından Hatch yumurta
   2. Ekle ca. Zemin köpek maması ve tuzlu su karidesi oluşan 1 ml gıda bulamaç olarak daha önce ²⁴ nitelendirdi. Kafes ile konteyner örtün ve bir lastik bant ile yerine örgü tutmak.
   3. Yaklaşık 24 saat LD fotoperiyodun kabine yerleştirin.
3. Aktarım yumurtadan larva için 10 x 10 x 2 cm'lik Petri yaklaşık 90 ml ile doldurulmuş kaplar deiyonize _H2O
   1. Tabak başına yaklaşık 30 larva koruyun. Örneğin, her Pazartesi, Çarşamba, Cuma ve (MWF) ²⁴ yemeklere her 48-72 saat temizlemek için larva aktarın.
   2. Daha önce olduğu gibi, iyonu giderilmiş su içinde ezilmesi köpek maması ve tuzlu su karidesi her MWF oluşan besleme yaklaşık 1 mi gıda bulamaç ²⁴ tanımladı.
4. Her kafes biyolojik çoğaltmak içermektedir her fotoperiyod tedavisi için 3-4 yetişkin kafesleri ayarlayın.
   1. 9.5 L kovalar ters taraftan, bir 10-by-14 cm delik kesip, ve 15 cm çapında bir delik. Comesh ile ilk Sür. Ortopedik çorap yaklaşık bir ayak uzunluğu kesin, ve diğer deliğin içine etrafında bir ucunu tutkal.
   2. Çorap kapalı ve düğüm kapatma ayak ucunu kesin - kafesin iç erişim gerektiğinde yalnızca açık. Kafes kapak için, sadece jant bırakarak, tüm iç kesip, ve örgü ²⁴ ile iç plastik değiştirin.
   3. Kafesin tarafında kalıcı bir kalem ile deney ile ilgili numarayı, kafes başlangıç ​​tarihini ve diğer bilgileri çoğaltmak, fotoperiod unutmayın.
5. Islak filtre kağıdı ile yetişkin kafesleri alt Hat. Filtre kağıdı ²⁴ ovipozisyon teşvik, hangi kafeste yerel nem oranı yükselir, ancak suya durmaktan kaçınmak için yeterli deiyonize H ₂ O ile filtre kağıdı nemlendirin. Gerektiğinde kurutulması için günlük olarak tekrar nemli filtre kağıdı edin.
6. En az 100 kadın dahil, bir RNA kütüphanesi için yeterli yumurta üretmek için / 9.5 L cage, kafes başına en fazla 500 sivrisinek ile.
7. En fazla 50 pupa başına 25 mi _H2O yoğunluğunda, temiz _H2O küçük bir kap içinde pupa MWF yeri ve toplamak Bir yetişkin kafesine pupa fincan aktarın. İlgili fotoperiyodun kabine yerleştirin kafesleri - A. albopictus pupa ¹⁵ fotosensitiftir.
8. Ölü pupa oluşumu kitle mortaliteye neden olabilir, çünkü, bardak H ₂ O temiz ve berrak olduğunu günlük olun ve ölü pupa çıkarın. Tüm pupa ortaya Ey bardak sonra H ₂ çıkarın.
9. Ortaya yetişkinler için şeker sağlamak için kafesin üst örgü organik üzüm yerleştirin. Üzüm Monitör ve küf birikmesini önlemek için her 3-5 gün onları değiştirmek.

Yetişkin 2. Bakım Çiftleşme ve Yumurta Üretim izin ver

1. (SECTI nemli bir filtre kağıdı ile kafes alt astar yüksek nemde (yakl.% 80) en kafesleri bakımı, ve yukarıda tarif edildiği gibi, küflü üzüm erişim sağlamakons 1.5 ve 1.9).

3. Kan-besleme

1. Yumurtlama yaklaşık 100% diapause yumurta ¹⁴ başlamadan önce kadın en az sekiz net kısa gün maruz emin olmak için eclosion sonra 2-6 gün arasında kan besleme kadınlarda hazırlanın.
2. Hemotek Membran Besleme sistemi hazırlayın. Güç kaynağı besleyen birimleri takın. Ayar vidası kullanarak 37 ° C her biriminin sıcaklığını ayarlayın. Kalibrasyon sırasında besleme ünitesinin sıcaklığını ölçmek için bir elektronik termometre ve probu kullanın.
3. Yemek haznesini hazırlayın. Yemek rezervuar diyafram üzerinde kollajen besleme membranın bir kare gerin ve bir O-ring ile sabitleyin. Dikkatle kırışıklıkları kaldırmak için köşeleri çekin; makas ile aşırı membran düzeltin.
   NOT: Kollajen membran tüm sivrisinek türleri için de işe yaramayabilir ve bir çalışma varsa optimum membran bulmak için çeşitli denemek için gerekli olabilirA dışında başka türler albopictus. Parafilm pipiens'in ile iyi çalışır.
   1. Kan kullanmadan önce en az 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, dondurulmuş çözülme saklanır.
   2. Membran aşağıya bakacak şekilde tutun rezervuar, desteksiz ve dolum portları yukarı bakacak. Bir anti-pıhtılaştırıcı olarak sodyum sitrat olan tavuk tam kan, yaklaşık 3 ml ile doldurulması için bir transfer pipeti veya şırınga kullanın. Plastik fişler ile dolum noktalarını Seal.
4. Besleyici altındaki ısı transfer plaka üzerinde damızlık üzerine vidalanarak besleyici hazırlanan rezervuar takın. Sivrisinekler kafesin örgü ile besler, böylece besleyici ters çevirin ve kafesin üst, aşağı membran tarafına yerleştirin. Besleme en üst düzeye çıkarmak için yaklaşık 45 dakika boyunca kafes üzerine besleyici tutun.

4. yumurtlama teşvik

1. Dört beş gün renkli bir karanlık her kafes donatmak, kan yemek sonrası 50 ml cağartılmamış tohum çimlenme kağıdı (yumurta kağıt) veya dokulu olmayan ağartılmış kağıt havlu ile kaplı ve deiyonize su ile ⁹ yarıya doldurun kadar. 250'den fazla sivrisinek bir kafes içinde iseniz, iki bardak kullanın.
   NOT: Küçük kafeslerde veya tek dişi şişeleri için, yumurtlama kaplarda "hay infüzyon" nedeniyle mikrobiyal floranın ²⁵ koku ovipozisyon artabilir.

5. toplayın ve Mağaza Yumurta

1. Yumurta üretimi genellikle önümüzdeki hafta boyunca azalır, sonra beş gün kan beslenme sonra yaklaşık zirveleri, çünkü kan besleme 4-5 gün içinde yumurta toplama başlar.
2. Deneyin ihtiyaçları yumurta toplama sıklığını Vary. Genel amaçlar için, bir MWF programa yumurta kağıtları toplamak. Her kafes yumurta kağıtları çıkarın ve taze kağıt ile değiştirin. Yumurta depolama karıştırıcı etkilerini önlemek için SD fotoperiyodun kabinesinde Petri kapları ve mağaza son zamanlarda kaldırıldı kağıtları yerleştirin.
3. Yumurta kağıtları yeniden izin Yumurta kuruma direncini artırır ²⁶ serozal manikür oluşumuna, izin sonrası yumurtlama 2 gün boyunca ıslak ana.
4. Yaklaşık 48 saat sonra toplama, açık havada kuru yumurta. Kağıt H ₂ O koyu veya yumurta yumurtadan uyaran o kadar ıslak gevşek ve hafifçe nemli, ama öyle ki kağıt kurutun.
   NOT: Bir 6,5 "x 4" Kağıt kuruması yaklaşık 3.5 saat sürebilir. Bu yumurta kuruma ²⁷ neden olacak gibi değil, aşırı kuru yumurta kağıtları dikkatli olun.
5. LD ve SD hem fotoperiyodların rezerv ek yumurta diapause insidansını değerlendirmek ve (Diapause Ölçme Bölüm 6) photoperiodic etkisini yorumlamak.
6. Uzun süreli depolama için, 21 ° C'de yumurta kağıtları tutmak ve Petri kutularına yaklaşık% 80 nem. Embriyo gelişimi, 21 ° C'de 4-5 gün sürer, yerel nem korumak için bir su şişesi ile bir Saklama kabı depolama kabı içinde Petri kapları tutun.

ove_title "> 6. Diapause İnsidans Tedbir

1. Ek saklıdır embriyolar diapause yanıtı ölçmek için 7-20 gün eski (yumurtlama, Bölüm 4 Canlandıracak bakınız) kullanın.
2. Her yumurta kağıt üzerinde bulunan yumurta sayısını kaydedin.
3. Tamamen yaklaşık 80 ml ​​deiyonize H ₂ O ile 90 ml'lik Petri kabındaki bireysel yumurta kağıtları daldırarak yumurtadan yumurta teşvik Yaklaşık 0.25 mi gıda bulamaç ekleyin.
4. 24 saat sonra ince çizgiler birinci değişim safhasındaki larva sayısı kalın. Larvaları görselleştirmek ve çanağın bir tarafında bir ışık kaynağı yerleştirmek için siyah bir yüzey Petri tabağına yerleştirin. Larva bireysel larva net bir taksitli için izin ışık kaynağından uzak hareket edecek. Bireysel larva anlatırken önlemek için sayım sırasında bir pipet ile bireysel larva çıkarın.
5. Yeni bir Petri kabı ve yeniden-kuru yerleştirin yumurta kağıtları. Yeniden yumurtadan yumurta yine ~ 1 hafta ve sonra yukarıdaki yöntemi kullanarak yumurtadan yumurta taksitli.
6. Kalan u Yeri yumurta kağıtları Yaklaşık 80 ml ​​beyazlatma solüsyonu ²⁸ ml 90 yeni Petri kapları yumurta n-yumurtadan. Yumurta kağıtları tamamen ağartma çözeltisine batırılmış emin olun ve çamaşır suyu kokusunu önlemek için bir davlumbaz gecede altında bırakın.
   NOT: Bu maddeler, 4 ° C'de yaklaşık 1 hafta boyunca muhafaza edilebilir, ancak aksi takdirde taze yapılmalıdır.
7. Koryon temizlemek ve embriyo, un-yumurtadan yumurta görselleştirme sağlayacak beyazlatma gibi bir ışık mikroskobu kullanılarak yumurta kontrol edin. Yumurta embriyolu ise yumurta sırt tarafında birbirine zıt iki küçük siyah noktalar şeklinde görünen gözlü grimsi beyaz bir renge sahip olur. Un-taranmış, embriyonlu yumurta ¹³ sayısını taksitli.
8. Hayır =% diapause: Aşağıdaki formül ile diapause sıklığını belirler. embriyone un-yumurtadan yumurta / (hayır. yumurtadan yumurta + hayır. embriyone un-yumurtadan yumurta) 100 ¹³ x.

Yumurta / pharate Larvalarına 7. RNA Ekstraksiyon

"ontent> NOT: Bir laminer akış kaputu kullanın Trizol.

1. Bir deve tüyü fırça kullanarak cam taşlama için yumurta kağıtları farklı gelişim zaman noktalarında gelişen embriyolar ya pharate larva içeren Fırça sivrisinek yumurtaları. Tamamen toz haline gelene kadar Trizol yumurta (doku 50-100 mg başına 1 mi) öğütün. Yeterli RNA elde kütüphanede başına en az 400 yumurta kullanın.
   1. Seçenek olarak ise, sıvı azot içinde dondurularak yumurta bileşenini ve Trizol taşlama önce bir ay kadar için mikrosantrifüj tüpleri içinde -80 ° C'de saklandı.
2. Trizol RNA ekstraksiyonu yapın, üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropanol çökeltme eklenmiştir.
3. RNA, bağlı bozulmayı önlemek için herhangi bir kalıntı nükleazlar kaldırmak için RNaz dekontaminasyon çözelti ya da diğer maddeler ile birlikte tezgah tedavi edin.
   1. DNase ile ekstre RNA tedavi edin. Üreticinin talimatlarına göre, 37 ° C'de 30 dakika boyunca DNaz ile RNA örnekleri inkübe edin. 1 & # kullanın181; 50 ml'lik bir reaksiyon içinde RNA kadar 10 ug l DNaz. Bir reaksiyonda RNA fazla 10 ug varsa DNase miktarını artırır.
   2. 5 ul askıya DNaz inaktivasyon reaktif ekleyerek DNase inaktive. Kuluçka döneminin (hafif girdaplama) sırasında üç kez karıştırma, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   3. 1.5 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin. Sonraki adımlar için yeni tüplere tedavi RNA örnekleri ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
4. Fluorometri toplam RNA örneklerinin kalitesini değerlendirmek. Bu görev için uygun alet ile bir özel tesisine örnekleri gönderin. Tesis çip aşılanan floresan boya ile görüntülendi numune RNA türlerinin, boyutlarını belirlemek için çip jel elektroforezi gerçekleştirecektir. Sonuçlar bir electropherogram olarak iade edilecektir.
   1. Varlığı o tarafından kanıtlandığı gibi, varlığında veya bozunma ürünlerinin yokluğunda toplam RNA numunelerinin bütünlüğünü belirlemekElde electropherogram (Şekil 1B) üzerinde 18S ve 5S ribozomal RNA zirveleri arasında f zirveleri.

8. RNA Sıralama

1. Standart protokolleri takip zenginleştirilmiş eşleştirilmiş-uç mRNA kütüphaneleri ve mRNA sıralama, yapımı için ticari bir sıralama merkezi yeterince yüksek kalitede (Şekil 1A) ve miktarı (kütüphane başına genellikle> 3 mg) ile toplam RNA örnekleri gönderin.
2. Birden fazla şeritli bir tek deney sıralanması için kullanılan ediliyorsa, sıralama sırasında şerit arasında teknik varyasyon için hesap sıralama için iki şerit halinde bireysel kütüphaneler bölünmüş.

9. lllumina Oku Temizlik

NOT: Şekil 2, bu protokolün biyoinformatik bölümünü özetlemektedir. Bu protokolün biyoinformatik bölümünde kullanılan tüm programlar ve kaynakların tam listesi için, Tablo 1 bakınız. InAyrıca, Ek Dosya 1 Aşağıdaki biyoinformatik protokol adımların her biri için komut satırı örneklerini içerir.

1. NCBI UniVec Çekirdek veritabanına% 95 kimlik ya da daha yüksek bir eşleşme için ssaha2 ²⁹ (Tablo 1) kullanarak (Tablo 1), C. albopictus rRNA dizi (Gen Bankası # L22060.1), ve sıralama adaptörleri (Ek Dosya 1'de verilmiştir Ayrıntılı komut satırı örnekleri). Sağlanan Perl script (Ek Dosya 2) adapte örneğin Perl kullanarak maçlarda veya benzeri bir komut dosyası aracı ile okuma çiftleri çıkarın.
2. Kalan Temiz SolexaQA paketiyle ³⁰ okur (Tablo 1; Ek Dosya 1): DynamicTrim.pl varsayılan ayarları kullanarak 20'den daha az bir phred puan eşdeğeri olan bölgeleri kırpın.
   1. Kaldır ileri hem LengthSort.pl ile daha kısa 25 bp okur ve ters aynı anda okur. FastQC (Tablo 1 ile fastq temizlenen dosyaların kalitesini değerlendirmek ) - Özellikle, başına tabanı dizisi kalitesi ve başına dizisi kalitesi puanları 20'nin üzerinde olduğunu doğrulayın.

10. Dijital Normalleştirme

1. K-mer boyutu 20, 20 bir kapsama kesme, ve x kullanarak (özellikle normalize-by-median.py; (Ek Dosya 1 Tablo 1) khmer aracını kullanarak ³¹ okur temizlenmiş dijital normalleşme bir tur yapın = 1E10).
2. Yüksek RAM ile bir makine mevcut (GBS yüzlerce) ise Alternatif, Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl komut (Tablo 1) kullanın.

11. De Novo Transkriptom Meclisi

1. Montaj büyüklüğüne bağlı olarak, RAM kadar 256 Gb ve 24 işlemcilerde olan bir bilgisayar veya bilgisayar kümeye erişimi edinin.
2. Komşularla içine yerleştirilen dijital normalize okuma monte etmek, Trinity ³² (Ek Dosya 1 Tablo 1) kullanın. Azaltmak için,bellek kullanımı, --min_kmer_cov 2 kullanın.

12. Meclis Değerlendirme

1. Trinity kontig çıkış Assemblathon2 projesi ³³ assemblathon_stats.pl çalıştırın. (; Ek Dosya 1 Tablo 1) Bu script gibi iskelelerinin sayısı, N50, montaj kompozisyon, ve daha fazlası gibi değerlendirilmesi montaj kalitesi ile ilgili temel hesaplamaları gerçekleştirir.

Montajlı transcriptome 13. Ek Açıklama

1. Bir referans protein kümesi karşı toplanma BLASTX (Tablo 1) gerçekleştirin; sivrisinekler için, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens ve Aedes aegypti uygun referanslar vardır. Özellikle, BLASTX (Ek Dosya 1) takip patlamanın referans protein Fasta dosyasını, biçimlendirmek.

14. Harita RSEM ³⁴ Kullanma Meclise okur (Tablo 1)

1. Bir 'transkript-to-gen haritasının' dosyası oluşturun hangiİlk sütun referans gen kimlikleri ve ikinci sütun kontigi kimlikleri içeriyor. Bir elektronik tablo editörü olarak, BLASTX çıkışından birinci ve ikinci sütun takas ve bir .txt dosyasına bu sütunları yazın. Unix formatına sonuçlanan .txt dosyasında satır sonlarını dönüştürmek için lineBreak programını kullanın.
2. RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hazırlamak-referans komut kullanarak transcriptome Fasta dosyasından bir başvuru dataset oluşturun.
3. RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hesaplamak ifade komutunu kullanarak her kütüphane için ayrı ayrı ifade değerlerini hesaplayın. Okur gibi, okuma-temizleme adım (adım 9.2) kaynaklanan fastq eşleştirilmiş dosyaları kullanın.
   1. Biyolojik tekrarında RNA dizileme için iki şerit bölünmüş ise, tek bir dosya oluşturmak için ifade hesabında hem fastq dosyaları içerir.
4. Kolayca diğer p tarafından işlenen bir matris her kütüphaneden ifade sonuçlarını dönüştürmeRSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan sağlanan komut rsem-oluşturmak-veri-matris kullanarak rograms.

15. Diferansiyel İfade Analizi

1. R ve Edger (Tablo 1) takın.
2. Adım 14.3 (Ek Dosya 1) den RSEM sonuçlarını yüklemek için read.delim kullanın. Gerekirse, en yakın tam sayıya sayıları yuvarlak.
   NOT: Kenar düzeninin kılavuzu önemini algılamak için yeterince yüksek bir ifade ile genlere veri kümesi sınırlayan önerir.
3. Edger için verileri biçimlendirmek için, yüklenen veri dosyası (Ek Dosya 1) bir DGEList nesnesi oluşturur. Ardından, TMM normalleştirme (Ek Dosya 1) kullanarak veri normalleştirmek. Veri (Ek Dosya 1) ortak ve tagwise dağılımlarını tahmin.
4. Bir Benjamini-Hochberg ile farklı ifade genleri tanımlamak p-değeri <0.05 (Ek Dosya 1) düzeltildi. Bereket vs log-kat-değişim (Ek Dosya 1) dağılımını çiziniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İki temsili RNA örneklerinin Florimetri (Şekil 1A, B) nt yaklaşık 2.000 iki bant gösterdi. böcek 28S ribozomal RNA, kolayca kısa ısıtma veya hidrojen bağları ³⁵ bozan maddeler ile parçalanmıştır hidrojen bağları ile bir arada tutulan iki polinükleotid zincirlerinden meydana gelmektedir. Elde edilen iki bileşen yaklaşık 18S ribozomal RNA gibi aynı boyutta. ikinci RNA numunesi bozulması yüksek seviyelerde (Şekil 1B) göstermiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol A indüklenen diapause photoperiodically nedeniyle farklı şekilde ifade edilen genleri bulmak için yöntemler sunulur albopictus. photoperiodic diapause yanıt odaklanan kişiler için özellikle - protokolü benzersiz acemi kullanıcılar için erişilebilir bir moleküler fizyoloji programın tüm deneysel yönlerini yapmak için sivrisinek yetiştirme ve biyoinformatik teknikleri birleştiren önemli olduğunu. Yetiştiricilik hataları tespit etmek genellikle gereklidir - - Mevcut y?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator - Model 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Controlled environment room	Thermax Scientific	N/A	Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/
Cool Fluorescent bulb	Philips	392183	4 W
Petri Dish 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Filter Paper 20.5 cm	Fisher	09-803-6J
9.5 L Bucket	Plastican	Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Fabric-Mosquito Netting White	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Orthopedic stockings	Albahealth	23650-040	product no. 081420
Organic Raisins	Newman's Own	UPC: 884284040255
Oviposition cups (brown)	Fisher Scientific	03-007-52	The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.
Recycled Paper Towels	Seventh Generation	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Glass Grinder	Corning Incorporated	7727-2	These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.
TRI Reagent	Sigma Aldrich	T9424	Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution — this reagent is toxic.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Place up to 12 RNA samples on one chip.
Hemotek Membrane Feeder	Hemotek	5W1	This system  provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company's mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.
Digital Thermometer and Probe	Hemotek	MT3KFU	MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.
Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate	Pel-Freez Biologicals	33130-1	The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 °C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.