Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Özet

Kanser tümörü çevreleyen dokunun hem de yerel pro- ve anti-inflamatuar aracılar tarafından etkilenir kompleks bir hastalıktır. Bu nedenle, daha çok deri altı modellere göre ortotrop enjeksiyon modelleri, bir şekilde daha iyi taklit eden insan patoloji kanser ilerlemesinin incelemek için yararlı olabilir.

Özet

Meme kanseri büyüme modelini bir bolluk kullanılarak farelerde incelenebilir. Meme kanseri hücrelerinin genetik manipülasyon yeni tümör bastırıcılarının keşfetmek için onkojenik ilerlemesi veya yardım katılan proteinlerin fonksiyonları içgörüler sağlayabilir. Buna ek olarak, farklı genotipleri olan farelere kanser hücreleri enjekte stromal bölmesinde öneminin daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Birçok model hastalığın ilerlemesi bazı yönlerini araştırmak için yararlı olabilir ama tüm kanser sürecini özetlemek yok. Buna karşılık, meme kanseri hücrelerinin daha iyi farelerin meme yağ tabanına kadar engraftmınt hastalığı ve uygun stromal bölmesinde varlığı ve bu nedenle daha iyi taklit eden, insan kanser hastalığı yerini tartışıldı. Bu makalede, biz orthotopically farelere meme kanseri hücrelerini implante ve analiz etmek dokuları toplamak için nasıl açıklamak için nasıl açıklamak: 14px; line-height:. 28px; "> tümör çevre ve uzak organlara metastaz bu modeli kullanarak, birçok kanser yönleri (büyüme, anjiyogenez ve metastaz) tümör hücrelerinin büyümesi için uygun bir ortam sağlayarak basit incelenebilir.

Giriş

Kanser yüzyıllar boyunca için çalışmalara konu olmuştur çok karmaşık bir hastalıktır. Meme kanseri en sık görülen kanser türüdür; kadınlarda görülür, ancak düzensiz de erkeklerde ²⁷ oluşabilir. hastalığın başlıca olarak vücuttaki hücrelerin sonsuz büyümesine yol açar kontrol mekanizması yönetim hücre bölünmesi kaybına neden olur. Bu arızalar çeşitli mekanizmalarla neden olabilir: Birincisi, sağlıklı hücreler kanser hücrelerinin kendi büyüme faktörlerini yapmak ve böylece daha yüksek bir çoğalma hızı ¹ elde büyüme faktörü reseptörlerinin ifadesini artırmak ise çoğalmaya için çevredeki hücrelerden büyüme sinyalleri gerekir; ikinci olarak, kanser hücreleri, anti-proliferatif sinyaller ⁸ daha az duyarlı olan; üçüncü olarak, aynı zamanda gerekli olan vücut hücre ölümü, hücre sayısını dengelemeye; Bununla birlikte, kanser hücreleri, programlanmış hücre ölümü kaçmak apoptoz ¹⁴ olarak adlandırılan; Dördüncü, hücreler, hücre dışı matrislerin bağlısırayla hayatta ama tümör hücreleri bağlanma ihtiyacı olmadan büyüme ve anoikis ¹⁹ direnç gösterebilir; Beşinci, telomeraz aktivasyonu telomer kısalması circumvents ve replikatif yaşlılıkla ²¹ önler; son ama en az değil, değişmiş genetik içeriği ^15,16 mitoz sonuçları takiben DNA kalite kontrol atlama. Bu deregüle çoğalmasında bir rol oynar onkojenlerinin veya tümör bastırıcıları tespit etmek amacıyla, farelerde tümör büyümesi deneyler çok önemlidir.

Primer tümör büyümesi genellikle ana ölüm nedeni değildir. Bir ikincil site birincil siteden kanser hücrelerinin göçü, metastaz denir, çoğu kanser hastalarında ²² önde gelen ölüm nedenidir. Metastaz ikincil site bağışıklık saldırı, ekstravazasyon ve büyümeyi kaçınarak, dolaşımı yoluyla seyahat, tümör hücresi istilasını, intravasation gerektirir. Mezenkimal geçiş (EMT) epitel önemli bir süreç olduğunumetastaz ve metastaz hücresinin ¹² için ön koşul olan yüksek motilite ve invaziv hücreleri, verimli gen ifadesi profilleri bir anahtar içerir. Kanserli süreci kanser hücreleri, stromal hücreler ve pro- ve anti-enflamatuar hücreler arasında karşılıklı etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli işlemlerden oluşan bir kombinasyonun elde edilen gibi, kanser için bir in vitro yaklaşım, genellikle, kanserli süreci içine tam fikir vermez. Benzer şekilde, tümör damar sistemini etkileyen anti-kanser tedavileri, genellikle bu şekilde in vivo kullanımı yaklaşımları kaçınılmazdır, in vitro incelenmiştir edilemez.

Meme kanseri ilerlemesini incelemek için, farklı deneysel yöntemler geliştirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan model, farelerde ⁵ içine, göğüs kanseri hücrelerinin deri altına enjeksiyondur. Bu deney düzeneğinde, araştırmacı, in vitro olarak bir seçim hücre hattına değişiklikler geniş bir katabilmektedir (örnuyarılması, proteinlerin aşağı doğru düzenleme) ile deri altına hücreleri enjekte edilir. Bu yöntem basittir ve enjeksiyon işlemi fareler üzerinde ameliyat gerek kalmadan basit olmasına rağmen, tümör enjekte edildiği de site meme kanseri gelişimi ile sonuçlanabilir yerel meme tümörü çevre ve bu ortamda olmadığını temsil etmez insan patolojisinde gözlenenden farklıdır. İkincisi, genetiği fareler meme kanseri ilerlemesini incelemek için bir in vivo aracı olarak sıkça kullanılır. Bu modelde, Oncogene (yani PyMT, Neu) sentezleme spontan meme tümör s oluşumuna yol açan, bir göğüs doku spesifik promotör ile tahrik edilir. Bu deneysel kurulum süresi ³ tümör boyutu kontrol ederken uyuşturucu veya antikorlar enjekte ederek hastalığın tedavi yönünü incelemek için yararlıdır. Ancak, eksik veya ayrıca ins verebilir ilgi bir gen mutasyona diğer fare suşları ile bu farelerin üremememe tümör büyümesi ²⁴ farklı proteinlerin rolünü içine ights. Bu modelin olumsuz tümör boyutu ve sayısının varyasyon eğilimli olmasıdır. Ayrıca, transgen ekspresyonu seviyesi, genomu içinde entegre yeri değişir ve başka bir ⁴ bir fare suşundan değiştirebilir. Insan hastalıklarında, hücrelerinin sadece bir alt popülasyonu onkojenini ifade eden tümör baskılayıcı seviyeleri ²⁶ üretimini azalttığı ise, bu modelde, transgenin ifadesi epitelyal kökenli tüm hücreler tarafından elde edilebilir. Metastazı araştırmak için göğüs kanseri hücreleri de damar içine enjekte edilebilir ²⁵ (model deneysel metastaz olarak da adlandırılır). Ancak, bu yaklaşım sadece kısmen metastatik süreci özetlediği; Bu tümör hücreleri istila eder ve intravasate için gereksinimi önlediği, ve tümör hücreleri hali hazırda dolaşımda mevcut olduğu noktadan başlar.

Bizim çalışmamızda, biz ortotopik Inject kullanıniyon modeli meme kanseri ilerlemesinde ¹³ ilgi genleri çalışma. İnsan meme kanseri hücrelerinde protein aşırı ifade eden ve NOD / SCID y (NTG) farelerin meme yağ pedi içine enjekte edilir. Enjekte hücre hattında çok hızlı ve farklı genetik değişiklikler, bu patolojik ilgili sitelere de metastaz birincil tümör büyümesi meme kanseri ilerlemesinde tüm süreci kapsayan izin verir, ve aynı zamanda iyi bir deneysel model sunar: Bu yöntem birçok yönden avantajlıdır Hastalığın erken ya da geç aşamalarında terapötik tedavilerin etkisini incelemek için. Ayrıca, bu model birini kullanarak genetiği değiştirilmiş fareler veya hücreleri kullanılarak hastalığın ilerlemesinde kanser hücresi kaynaklı proteinlerin karşı stromal rolünü araştırmak. Deri altı enjeksiyonlar, uygulaması daha kolay olmakla birlikte, ortotopik modeller daha tümörijenik daha metastatik kanser hücre popülasyonuna neden olmaktadır. Böylece sonuçlar, deri altına enjeksiyon vasıtasıyla eldes yalancı negatif ya da tümör büyümesini incelemek için ortotopik modellerin kullanımını teşvik ^6,17 yalancı pozitif ya olabilir.

Protokol

Hayvan deneyleri Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi (LUMC) hayvan koruma kurulu tarafından onaylanmıştır.

Hücreler, Aletleri ve Fareler 1. Hazırlık

1. Operasyondan önce bir gün, orta hatta dördüncü meme ucundan NOD / SCID gama (NTG) fareler tıraş ve tüm fareler kabaca karşılaştırılabilir ağırlıklara sahip olduğunu doğrulamak için fareler tartmak.
2. İki cımbız ve iki düz sivrisinek forseps (Şekil 1A) bir makas otoklavlayın.
3. Işlem gününde, insan göğüs adenokarsinomu (MDA-MB-231), fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez enjekte edilecek hücreler, pH değeri 7.4 yıkama ve Hücreleri tripsinize edin. Hücrelerin üzerine 10 mi, serum ihtiva eden DMEM ortamı eklenerek tripsin söndürüldü. Serumsuz PBS içinde ya da ortam içinde ya da yeniden süspansiyona alınmasıyla serumun ayrılması için oda sıcaklığında, 7 dakika için 1200 rpm'de hücreleri santrifüjleyin. Tamamen serum izlerini kaldırmak için tekrar santrifüj. PBS hücrelerin tekrar ya daMedya.
4. Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve hücre miktarını hesaplamak. Fazla 150 ul 500.000 hücre / fareyi kullanın. PBS veya medya İsteğe, matrigel hücreleri tekrar süspansiyon.
   NOT: kullanılan hücre türüne bağımlı olarak hücre miktarını belirlemek.
5. Steril bir mikrosantrifüj tüpleri hücreleri koyun ve buz üzerinde saklayın.
6. 35, PBS, pH 7.4 ml% 70 etanol ile bir 50 ml konik santrifüj tüpüne sahip bir 50 ml konik santrifüj tüpü doldurun. Her tüpe pamuk bezlerden bekletin.

2. Ortotopik Enjeksiyon

1. Steril bir ortam sağlamak için steril bir kaput içinde ameliyat. / Kg vücut ağırlığı ila 100 mg, sırasıyla 10 mg / kg, arasında bir dozda Xylazin / Ketamin karışımı enjekte deri altından ile fare anestezisi. Bir ısıtma yastığı üzerinde fare Fix. Ayak tutam tepki eksikliği anestezi başarısını onaylayın.
   NOT: Bir cerrahi girişimler ile çok aşina değilse, cerrahi daha uzun sürebilir. Düzenlemekanestezi buna göre doz.
2. Kurumasını önlemek için gözleri, farelerin gözleri oftalmik merhem sürün.
3. Adım 1.6 hazırlanan etanol içine batırılmış pamuklu çubukla kullanarak traş alanı temizleyin. Planlanan kesi uzak dönen dairesel bir şekilde betadin ve alkol üç kez kullanarak scrubs Alternatif yapılmalıdır. Alternatif olarak, bir dezenfektan olarak iyonoforu kullanın.
4. Bir makas ile dördüncü meme başı ve orta hatta arasında küçük bir kesi yapmak ve PBS pH 7.4 ile nemlendirilmiş pamuklu çubukla takarak bir cep yapmak.
5. Meme yağ yastığı ortaya çıkarmak için bir cımbız kullanın. Beyaz renk ile yağ yastığı gözlemleyin.
6. Kendi tabanından diğer cımbız ile yağ yastığı sıkıştırın; Bu yaparak, tam kolayca enjeksiyonları gerçekleştirmek için yağ yastığı (Şekil 1B) maruz kalmaktadır.
7. Yukarı ve aşağı pipetleme hücre homojen bir karışım. Yavaşça bir insülin şırınga içine hücre süspansiyonu 50 ul aspire ve içine enjekteyatay iğne tutarak meme yağ yastığı. Yağ yastığı şişme kontrol ederek başarılı bir enjeksiyon onaylayın.
8. Yavaşça yağ yastığı bırakın.
9. Bir iğne sürücüsünü kullanarak kesi sütür. Üç saat yönünde, saat yönünün tersine ve saat yönünde iğne sürücü etrafında dikiş çevirerek atar olun. Dikiş başına iki düğüm kullanılmalıdır.
   NOT: knot aksi fareler sütür açabilirsiniz sıkı olduğundan emin olun.
10. Ameliyattan sonra, ağrıyı dindirmek amacıyla 0.05-0.1 mg / kg vücut ağırlığı, deri altından böyle Temgesic gibi, bir analjezik enjekte.
11. Onlar bilinci kazanmak ve sternum recumbence korumak kadar sahipsiz hayvanlar bırakmayın. Onlar tamamen iyileşti kadar farklı kafeslere içine tüm hayvanları yerleştirin.
12. , Sterilite korumak Otoklavlanmış kafesleri ve su kullanın. Temiz bir atmosfer tutmak için her üç günde kafesleri değiştirin.

Analiz için 3. Hasat Organları

1. AtHasat gün, 8 hafta hücrelerinin implante edilmesinden sonra, her bir fare için 3 mi Bouin çözeltisi ile 15 ml konik santrifüj tüpleri doldurun. Buna ek olarak, fare başına 5 ml formalin çözeltisi ile doldurulmuş iki adet 15 ml tüpler kullanmaktadır.
2. 10 mg'lık bir dozda, Xylazin /, ketamin enjekte edilerek hayvanlar anestezi / 100 mg / kg vücut ağırlığı deri altına kg. Hayvan ayak tutam çekilme refleksi kaybeder kadar bekleyin.
3. Bir baz iğne ile hayvan Fix. Makasla uzun, dikey orta hat kesi olun. Sağ ön bacak altında ve arka bacak üzerinde iki yatay kesiler yapmak. Tabanına cilt iğneleyerek tümörü Açığa. Bir kumpas kullanarak tümör hacmini ölçün.
4. Makas kullanılarak cilt tümörü ayırmak. Ek Bileşen RNA izolasyonu için sıvı azot içinde bir tümör parçası dondurma. Parafine aşağıdaki immunohistokimyasal gerçekleştirmek için formalin ile dolu konik santrifüj tüpüne, diğer kısmı koyun.
5. Yavaşça akciğerleri çıkar. YerleştirinBouin solüsyonu içine akciğer bıraktı. 3 gün boyunca çözelti içinde akciğer tutun. Çıplak gözle açıkça yüzeysel metastatik odaklar gözlemleyin. İsteğe bağlı olarak, hematoksilen ve eozin (H & E) boyama kullanarak Mikrometastaz doğrulamak için formalin içine doğru akciğer yerleştirin.
   NOT: Akciğer metastazı meme kanseri sık görülen rağmen, bir de metastaz analiz etmek kemik, karaciğer, beyin ve dalak toplamak isteyebilirsiniz. metastatik alanda hücreler yoğun ve morfolojik olarak farklı olan ve bu nedenle, akciğer dokusundan kolayca ayırt edilebilir.
6. Bir gün hasattan sonra, 15 ml tüpler gelen formalin solüsyonu aspire ve% 70 etanol ile değiştirin. Parafin dokuları embed ve immunohistokimyasal çalışmalar yapmak.
7. Kan analizi için, makasla göğüs boşluğuna açılır. Kalp delinerek 450 ul kan çekiniz. % 3.2 sodyum sitrat 50 ul ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü içinde kan örneği yerleştirin. Kan toplandıktan sonra, 10 mi 2,000 xg'de uydurmayın. Bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C 'de plazma numuneleri saklayın.
   NOT: Orada yaygın uygulamada ²⁰ kullanılan birçok diğer kan toplama teknikleri ve kullanılması gereken tekniği deney düzeneği ve bilim seçimine bağlıdır. Kan örneği gerekli değilse, hayvan protokolü veya kurum kurallarına göre göre hayvan euthanize.

Sonuçlar

"Ortotopik meme kanseri modeli" başarılı bir şekilde uygulanması, memenin yağlı pedine hücrelerin uygun enjeksiyon dayanmaktadır. Bu tür hücreler ya da sızıntı kesin aşılama gibi deneysel hatalar tümör boyutu veya kontrol tamponu (Şekil 2A) ile enjekte edilmiş bir meme yağ tabanına benzeyen bir yapının oluşumuna yol açar, bir tümörün da yokluğunda varyasyonlara neden olabilir. Tümör büyüme oranı enjekte edilen hücre çizgisinin doğasına bağlı olduğu, ve...

Tartışmalar

Meme kanseri hücrelerinin Ortotopik enjeksiyon kanser büyüme tüm yönleriyle incelemek için güçlü bir modeldir. Farelerin meme yağ tabanına bu hücrelerin implantasyonu dikkatli bir şekilde tümör büyümesi değişimi önlemek için gerçekleştirilmelidir. En önemlisi, her bir fare için hücreler ile aynı miktarda enjekte önemlidir. Bunu yapmak için, bir titizlikle hücrelerin canlılığını etkileyen hücrelere trypsinize gerekir. Cansız hücreler canlı hücre sayısının belirlenmesi için yara...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9