Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

Özet

Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.

Özet

Gözyaşı bezi (LG) korneanın yapısını ve işlevini, görme için gerekli şeffaf bir doku korumak için gerekli sulu gözyaşı salgılar. 5 kanallar - insanda bir tek LG 3 ile oküler yüzeye gözyaşları veren her gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunur. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu okudu kulağına exorbital gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik bir şebekenin oluşturulması için tomurcuk ve kanal formasyonu birçok kere maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. Bu ayrıntılı süreci iyi gibi pankreas ve tükürük bezi gibi diğer birçok epitelyal organlarda belgelenmiştir. Bununla birlikte, LG daha az araştırılmıştır ve morfojenezini kontrol eden mekanizmalar zayıf biçimde altındadırdurdu. Biz bir model sistem olarak bu altında temsil bulma diseksiyon ve LG kültürleme ile ilişkili zorluklar bir sonucu olduğunu sanıyorum. Bu nedenle, burada diseksiyon hasat embriyonik ve doğum sonrası LG için teknikler ve doku ex vivo kültür için yöntemleri tarif eder.

Giriş

Gözyaşı bezi (LG) görme keskinliği ve sağlık, bakım ve göz yüzeyinin hücrelerinin korunması için kritik sulu gözyaşı salgılanmasından sorumludur. Batma, ışık duyarlılığı ile karakterize ve vizyonunu ¹ azalır sulu eksik Kuru Göz Hastalığı: En sık ve zayıflatıcı göz bozuklukları birinde LG disfonksiyon sonuçları. İnsanda LG gözün lateral ucunda yukarıdaki yörüngede bulunduğu yeri 3 - oküler yüzey üzerine 5 boşaltım kanalları mevduat gözyaşları. Fare büyük göz bezlerinin üç çift, çoğu çalışılan tek bir boşaltım kanalı yoluyla göze seyahat gözyaşları ile kulak (exorbital) için gözyaşı bezi (LG) bulunduğu ön ve ventral olduğunu. Diğer glandular organlara benzer şekilde, LG, yoğunlaştırılmış mezenşim içinde tek bir epitel tomurcuk birden tomurcuğu mermi ve talimat için oluk oluşumu maruz kalmakta ve epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir(Şekil 1) salgılama asinüs ve kanalların karmaşık bir birbirine birleşik ağ m ^2. Gelişimi sırasında epitel vaskülare olur yanı olarak ağır şekilde üstün servikal ganglion ³ sempatik sinirler tarafından pterigopalatin ganglion parasempatik sinirler tarafından ve daha az bir ölçüde innerve. Türleri nöronal, epitel, endotel ve mezenkimal hücreler yani bu hücrelerin her biri arasındaki etkileşimleri, işlevi ve yetişkin doku bakımı için gereklidir. Ancak, arası hücre tipi iletişim bu süreçleri kılavuzları nasıl yanı sıra LG gelişimini ve yenilenmesini koordine yatan moleküler mekanizmalar belirsizdir.

Embriyonik ex vivo kültür tekniklerinin ortaya çıkışı, çok dallanmış organ ⁴ gelişimsel ve rejeneratif yolların belirlenmesi izin vermektedir. Ex vivo kültürlenmesiyle araştırmacıya (beni organı manipüle yeteneği verirchanical, genetik veya kimyasal) tanımlanmış koşullar altında yanı sıra gerçek zamanlı organ gelişimi ve hücre-hücre etkileşimleri karakterize etmek. Farenin exorbital LG, bu tekniğin son derece müsait olduğunu ve son çalışmalar gelişimini ^2,5 düzenleyen sinyalizasyon sistemi tanımlamıştır. Ancak, LG gelişimini ve yenilenmesini destekleyen moleküler ipuçlarını anlamak için ihtiyaca rağmen, şu anda büyük olasılıkla nedeniyle organın izole teknik zorluklar, ilgili yeterli kalır. Bu yazıda, izole ve gelişim programları tanımlamak için embriyonik fare LG ex vivo kültürünü gerçekleştirmek için nasıl açıklar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerilere sıkı göre altında yapıldı. Protokol California Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), San Francisco tarafından onaylandı.

1. Fare Embriyonik Gözyaşı bezleri (LG): Hasat ve Mikrodiseksiyon

1. Bilimsel Araştırma Etik komite için Kurumsal Hayvanlar tarafından onaylanan prosedürleri takiben uygun embriyonik günde hasat embriyolar servikal dislokasyon tarafından onaylanması ardından, yükselen CO ₂ inhalasyon ile hamile CD-1 (veya transgenik) kadın aşımına euthanize. Vajinal fiş keşif e0'ın gün belirleyin.
   Not: Gözyaşı bezleri (Lgs) itibaren e14 tek tomurcuk aşamasından hasat edilebilir. Ancak, e16 (5-10 tomurcukları) embriyolar ex vivo kültür için en tutarlı sonuçlar verir.
2. V sterilize% 70 etanol kullanılarak fare Entral tarafında. Cildi çimdik ve steril cerrahi makas ile orta hatta bir kesi yapmak; deri yoluyla kesilmiş ve karın boşluğuna maruz periton. 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş Her bir uterusa ve yerine soğuk PBS (fosfat tamponlu salin) ya da DMEM F12 ortamında üstündeki mesometrium boyunca keserek 2 rahim boynuzları çıkarın.
3. Forseps kullanarak (# 5), amnion kesesi embriyolar çıkarın ve soğuk PBS içeren ikinci bir steril Petri kabı içine yerleştirin. Gözleri veya kafa alana dokunmayın dikkatli olun.
4. Bir transillüminasyonu tabanı ile bir mikroskop üzerine embriyo yerleştirin. 1.7 - embriyo adımları 1.5 gerçekleştirin. Embriyolar iseniz> E17, bu adımlar bu nedenle 1.8 adıma geçin, faydalı olabilir, ancak şart değildir.
5. Sadece alt çene altındaki gövde (aşama 1, şekil 2) 'deki Bağın gelen kafa Severga steril neşter (# 10 bıçak). Mandibula diseksiyon plaka üzerinde şimdi böylece başını döndürün. Kafa ve yaklaşık ¼ beyin (adım 2, ^1. kesim, Şekil 2) dorsal tarafına kaldırmak için bir neşter stabilize forseps kullanın - Bu kıkırdak e15 etrafında stiffens kez özellikle önemlidir.
6. Neşter gözler arasındaki burun delmek böylece başını döndürün. Gözleri ayrı yarımları (aşama 2, ^2. kesme, Şekil 2) artık demektir ki, başlığın merkezinden geçen bir kesim yapın.
7. İki # 5 forseps kullanarak, başın bir yarısını almak ve aşırı doku (Şekil 2 adım 3) çıkarın. (Gözün alt arka köşede bulunur) LG bu kaldırma işlemi kayıp değil bu yüzden başını yönlendirmek için emin olun. Fazlalığı serebral, kıkırdak ve burun çevresindeki doku ve gözün altında çıkarın. Bezi bu noktada zor görünür olduğundan, doğru aşırı doku kaldırma t sonra yönlendirilmiş gözü sağlamako LG konumunu kaybetmemek.
8. Dikkatle posterior, hem forseps ile göz alt köşesinde cildi kapmak. Dikkatle LG maruz forseps ile açık çekerek cildi çıkarın. LG görselleştirmek yardımcı olmak için doku altında ve üstünde ek aydınlatma kullanın.
   Not: LG, koyu, yoğun mezenşimin içinde bir kanal üzerinde bir tomurcuk olarak görünüm ile ayırt, bu noktada görünür olmalıdır.
9. Dikkatle LG ve ilgili mezenşimi LG veya ilişkili kanalı kapmak için dikkatli olmak, forseps kullanarak uzak çevreleyen dokudan (diyagram ve görüntüler bakın) incelemek başlar. Bezi çevreleyen dokudan serbest sonra, yavaşça LG kanalının dibinde gözünü çevreleyen epitel kavrayarak tüm bezini çıkarın. Yoğunlaştırılmış bir mezenşimin içine epitel invaginates olarak görülebilir epiteli çevreleyen mezenşimi korumak için özen gösterin.
   Not: Tissu'dan bazı ilave gerie (herhangi bir küçük kemik fragmanları, kas ve bağ doku) komşu / büyüme faktörü sinyal önlemek için gerekli olabilir.
10. Kültür, hasat 4 - 5 bezleri ve plaka başına ilişkili mezenşimin (Lgs hemen diseksiyon üzerine ekilir); RT-PCR ⁶ RNA lisis tampon 100 ul başına 14 bezlerinin en az toplamak.

2. ex vivo Kültür Plakaları hazırlayın

Bu prosedür, gelişmekte olan tükürük bezi ^7,8 için kullanılana dayanır.

1. Cam tabanlı bir 50 mm çaplı bir mikro çanak ⁷ 50 ug / ml, askorbik asit ve 50 ug / ml holo-transferrin ile birlikte kültür ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş), DMEM F12 200 ul ekle.
   Not: Daha önce embriyonik tükürük bezinde morfogenetiğine maksimize etmek için bunu buldum DMEM F12 seçildi.
2. 13 mm POLYCARB Floatmedyanın üstüne 0.1 mikron gözenekleri ile onat membran filtre.
3. İsteğe bağlı Adım: 3 mg / ml'lik bir son konsantrasyon sağlamak için DMEM / F12 ile 1 (hafifçe karıştırmak için, 200 ul pipet kullanın, santrifüj 1 dakika boyunca kabarcıklar görüldüğünde): 3-D laminin 1 seyreltin. Ekle Bu 15 ul filtre 3-D laminin seyreltilmiş.
   Not: Bu seyreltme epitel dallanma ödün vermeden, 3B durumda LG muhafaza edilmesi için uygun olduğu bulunmuştur. Bununla birlikte, LG'nin kültürü için gerekli değildir.
4. Filtrenin üzerine ya da laminin içine 5 LG - 4 yerleştirin. Kültür Lgs ex vivo olarak 24 - 48 saat (Şekil 3) veya 20 qPCR daha fazla analiz için dk ya da immüno-boyama (Şekil 4)% 4 PFA ile yapışması. Embriyonik glandüler doku QPCR analizi için, Rebustini ark bakın., 2011. Embriyonik bez dokularında imüno-analizi için aşağıdaki alıntılarda bakınız: Hoffman ve arkadaşları, (2002), Steinberg ör.T ve arkadaşları., (2005).

3. Fare Postnatal ve Erişkin Gözyaşı bezleri (LG): Diseksiyon

1. Uygun hayvan etik komitenin standartlarına göre doğum sonrası fareyi euthanize. Doğum sonrası yavrular gün 8 ya da daha genç, steril makas ile kafa kesilmesinin euthanize. Doğum sonrası gün 8 veya üzeri için,% 70 etanol ile kürk sprey.
2. LG bulmak için, fare yukarıdan aydınlatma ile bir mikroskop altında yan yanal yatıyordu. Not: doğum sonrası ve yetişkin LG karotid arter, masseter kas ve dermis (Şekil 5) ile çevrelenmiştir.
3. Küçük diseksiyon makas kullanarak, yanal LG nerede olması gerektiğini Epidermisteki küçük bir kesi yapmak.
4. Forseps kullanarak, LG maruz kulak doğru epidermis çekerek açın.
5. Yavaşça çevreleyen dokudan LG gevşetmek için forseps kullanın.
6. LG çevreleyen dokudan serbest bırakıldıktan sonra, dikkatli, kanal tarafından LG kaldırmakkanal ve göz çevresindeki epitel (Şekil 1) bağlamak nerede kavrama tarafından.
7. RT-PCR için RNA, liziz tamponu içinde LGS yerleştirin veya immün için 20 dakika boyunca% 4 PFA ile yapışması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

LG epitel dallanma morfojenezinin sürecinde gelişir. E14, e15, E16, E17, ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler bu olay göstermektedir.

Şekil 1. LG morfogenetiğine dallanma epitel sürecinde gelişir. Taze e14, e15, E16, E17 ve P2 disseke embriyonik LGS aydınlık görüntüler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kültürüne çok yönlülük ve LG ex vivo gelişimini incelemek için önemli avantajlar sağlamaktadır manipüle. Bu araştırmacı hipotezleri ve nöronal, endotelyal ve mezenkimal hücreler organı oluşturacak nasıl etkileşimde epitel değerlendirmek için yapılabilir pertürbasyonların sayıda test edebilir hızını içerir. Bu modeli kullanarak, ancak, uyarılar bir dizi bulunmaktadır. İlk olarak, izolasyon sayesinde bezi sırada artık sinirler veya kan damarlarının ^9,10 tarafında...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 without HEPES	SH3027101	Thermo Scientific
Penicillin-Streptomycin	P0781	Sigma-Aldrich
Albumin solution from bovine serum	A9576	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde 16% Solution	15710	Electron Microscopy Sciences	Diluted to 4% in 1x PBS
Phosphate Buffered Saline 10x	BP665-1	Fisher Scientific
Phosphate Buffered Saline 1x			Prepared from 10x stock
holo-Transferrin bovine	T1283	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
L-ascorbic acid (Vitamin C)	A4544	Sigma-Aldrich	25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml.
BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes	130182	Thermo Scientific	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo Microscope with substage iluminator	Stemi 2000	Carl Zeiss	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
Substage Illuminator Base for Stereo Microscope	TLB 4000	Diagnostics Instruments, Inc.
Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes	353001	Corning	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm uncoated glass bottom dishes	P50G-1.5-14-F	MatTek Corporation
Widefield fluorescence microscope	Axio Observer Z1	Carl Zeiss	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal Microscope	TCS SP5	Leica Microsystems	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm)	17-305X	Integra LifeSciences Corporation	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm)	91150-20	Fine Science Tools (USA), Inc.	Ideal for harvesting glands from embryos.
Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.	4-30	Integra LifeSciences Corporation
Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10	4-310	Integra LifeSciences Corporation
RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit	AM1931	Life Technologies
Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I	3446-005-01	Trevigen	6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12
Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice		Charles River Labs	Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).
Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm	110405	Whatman
Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice	Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr	The Jackson Laboratory	Optional mice for learning how to locate the LG.