JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva mutant fenotip yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar.

Özet

Drosophila melanogaster sinir sistemi işlevini çalışmak için güçlü bir deneysel model sistem. Sinir sistemi işlev bozukluğuna yol açan gen mutasyonu genellikle Sadece varlığını sürdürebilmiş larvalara ve uygun bir metin ya da tamamen tarif tek bir fotoğrafik görüntü ile temsil zordur lokomosyon bozuk fenotiplere sahiptir yetişkin üretir. Bilimsel yayın mevcut modları, ancak, el yazması eşlik ek malzeme olarak dijital video medya sunulması destekler. Burada bir yanal açıdan hem Drosophila larva ve yetişkin fenotipleri yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar. Sapkın lokomotif davranışları gözlem ve ince ayrımları ve varyasyonları analiz sağlar çünkü bir yan görünümden larva ve ergin lokomosyon Video avantajlıdır. Biz başarıyla görselleştirmek ve aberran ölçmek için tekniği kullandıkt tımar dahil yetişkin mutant fenotipleri ve davranışlar yanı sıra, üçüncü larva davranışları sürün.

Giriş

Yaygın meyve sineği Drosophila Melanogaster'in sinir sistemi 1-3 işlevi çalışmak için güçlü bir deneysel model sistem. Evrimsel yapısı ve insan ile sinir sistemi fonksiyonunun korunması, hem de genetik manipülasyon kolaylığı ve genetik araçlar geniş bir dizi Drosophila insan nörodejeneratif hastalıklar 4 modellemek için, ilk organizma sağlar. Sinir sistemi işlev bozukluğuna yol açan gen mutasyonu genellikle bozulmuş harekete karşı canlı mutant larva ve yetişkin Drosophila neden olur. Sinir sistemi bozuk mutantların hepsinde gözlenen fenotipleri lokomosyon, anormal koordinasyon ve erişkinlerde spastik hareketlerinin oranı yanı sıra, gövde duvarı arasında kas kasılması peristaltik eksikliği, ve larvaların kısmi felç azaltılmasıdır. Bu fenotipler yüksek verimli genetik ekranlar ve mutant larva 5 lokomosyon tahlillerinin geliştirilmesinde istismar edilmiş, Lokomosyon bozukluğu miktarının ve sinir sisteminin fonksiyonu için gerekli olan genleri tespit etmeyi amaçlayan 6 ve yetişkin 7-10 Drosophila. Bu yaklaşımlar larva ve ergin lokomotif davranışları ölçmek için son derece yararlı olmakla birlikte, her spesifik anormal davranışları hakkında nitel bilgi iletmek için başarısız. Mutant üçüncü instar larvası bir davranış tahlilinde, değiştirilmiş lokomosyon parametreleri sergileyebilir sırasında bu tarama döngüsü sırasında ritmik kasılmalar peristaltik değişimlerden koordinasyon genel eksikliği ya da arka gövde kısmi felç sonucudur, örneğin, belirsiz olabilir duvar kas. Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva lokomotif fenotipleri yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar. Lateral perspektiften alınan dijital video Locomotiv ince ayrımlar doğrudan gözlem ve analiz sağlarBir daha bilgilendirici yan görünüm oryantasyon e davranışlar.

Protokol

1. Stereo Mikroskop Sistemi

Not: Bu protokol kolayca video edinme yeteneği ile dijital kameraya bağlanmış neredeyse herhangi bir stereo mikroskop sistemi adapte olmasına rağmen, detayları (Malzeme / Ekipman Tablo) laboratuarımızda kullanılan sistemde sağlanmaktadır.

  1. Bir ticari dijital kameraya bağlanmış bir trinoküler stereo mikroskop kullanarak dijital video edinin.
  2. Çift stereo mikroskop trinoküler noktasına ticari dijital kamera için, stereo mikroskop phototube liman ½x C-montajı kaldırmak ve 1X C-montaj ile değiştirin.
  3. 1X C-mount dijital fotoğraf makinesi kuplörünü (43 mm diş) monte edin.
  4. Kamera kuplöre Dağı iki adım aşağı yüzük, 48 mm, 58 mm ve 43 mm 48 mm, dijital kamera için objektif adaptör kiti dijital kamera Kuplörün gelen bağlantıyı köprü.
  5. Objektif adaptör kiti dijital kamera monte edin.
  6. Yaklaşık 12X kombine büyütme (saniyede 30 kare, 640 x 480 piksel) için mikroskop büyütme ve dijital kamera setinin optik zoom ile video edinin. Not: Stereo mikroskop büyütme trinoküler limanın yeni yeniden 1X C-mount göre telafi edilmelidir.

2. Görüntüleme Drosophila Üçüncü Instar Larva

  1. Bant işaretleyici kapağın yan yaklaşık kaplayacak şekilde bir dijital kamera ile bağlanmış bir stereo mikroskop siyah aşaması plakasına kalıcı işaretleyici ⅓ kamera LCD gözlenen görüş alanının dikey ¼. Onlar renk kodu için kullanılan ve görüntülü larva genotipleri ayırt edilebilir renk bir ürün yelpazesine gelir çünkü larva görüntüleme gerçekleştirmek için aşama olarak işaretleyici üstleri kullanın.
  2. Ince bir nokta ile işaret üst yüzeyinde dijital kamera LCD gözlenen görüş alanını ayırır;işaretleyici.
  3. Görüntü bir Üçüncü dönem larva seçin. Üçüncü instar larvaları seçilmesi için kriter vücut uzunluğu, yaşam döngüsünün larva aşamasında, ön ve arka spiracles varlığı sırasında besin kaynağından ortaya çıkması ve ağız cihazının 11 çene kancalar yapı. Larva suda iyice yıkayarak temiz olduğundan emin olun.
  4. Bir fiber optik aydınlatma sistemi için ışık üstten kalıcı bir kalem üst sahnenin aydınlatılmasını. Optimal aydınlatma sağlamak için ışığın açısını ayarlayın.
  5. Kalıcı bir kalem üst kenarında Odak mikroskop. Dijital video edinme başlayın.
  6. Görüş alanında doğru bakan larva (Şekil 1) ön ile sadece görüş alanı dışında, yaklaşık 75 ° uzaklıkta dikey eksenden markör kapağın yan tarafında larva yerleştirin. Not: işaretleyici kapağın yan tarafında bulunan larva Yerleştirme th kayıt hareketine izin verir kamerayıBir yandan görünüşünü e larvası. Onlar işaretleyici kapağın yan düşmek yok bu yüzden su ile nemli larva tutmaya yardımcı olur. Bakım bu alanın karşısındaki süründüğü gibi aşırı miktarda larva uyacaktır gibi çok fazla su kullanmak değil, ancak olunmalıdır.
  7. Yavaşça kurcalamak ve görüş alanı üzerinde tarama için zorlamak için küçük bir fırça ile larva eşya. Larva nadiren işbirliği ve onlar düz alan üzerinde tarama önce genellikle başlangıç ​​noktasına birçok kez iade edilmesi gereken sabırlı olun.
  8. Tutanak yaklaşık 10-15 kesintisiz dijital video görüntüleri ve mahsul dk ve dijital video düzenleme yazılımı ile tüm gereksiz görüntüleri alım sonrası kaldırın.

3. Görüntüleme Yetişkin Drosophila

  1. Bir tek 1.5 ml spektroskopik polistiren küvette bir tek yetişkin Drosophila yerleştirin.
    Not: yetişkin Drosophila CO 2 anestezi hemen Behav önceHastada protokol analizleri sonuçları 12 bozabilir. Yetişkin Drosophila davranış testinde 13 gerçekleştirmeden önce CO 2 Anastetize kurtarmak için bir 24 saatlik dönem verilmesi önerilir.
  2. Küçük bir pamuk ile küvetin ucunu. Pamuk büyük kap alanı işgal etmek yeterince sıkı doludur emin olun ve küvetin hacminde bölmeye sinek hapseder.
  3. Stereo bir mikroskop beyaz aşaması plaka küvet koyun ve dijital kamera LCD gözlenen görüş alanı ile küvetin hacminde bölmesi hizalayın.
  4. Bir fiber optik aydınlatma sistemi için ışık üstten küvet aydınlatır. Optimal aydınlatma sağlamak için ışığın açısını ayarlayın.
  5. Odak mikroskop ve dijital video edinme başlar.
  6. Tutanak yaklaşık 30-45 kesintisiz dijital video görüntüleri ve mahsul dk ve tüm gereksiz kaldırmakdijital video düzenleme yazılımı ile görüntüleri alım sonrası.

Sonuçlar

Biz başarıyla kazanmak ve stathmin genin fonksiyon kaybı (Şekil 2) 14 ile ilişkili larva davranışsal fenotip ölçmek için bu tekniği kullandık. Stathmin gen çözünür tübülinin havuzlarından Tübülin dimerlerini bölmeler bir mikrotübül düzenleyici proteini kodlar ve Mikrotübülleri bağlanır ve bunların sökme 15,16 teşvik etmektedir. Stathmin periferik sinirlerin fonksiyonu 14 aksonların mikrotübül bütünlüğünün muhafaz...

Tartışmalar

Sinir sistemi işlevini incelemek için bir model sistem olarak Drosophila melanogaster 'in gücü, büyük ölçüde mevcut güçlü genetik araçları yakınsama ve geliştirilen güçlü davranışsal testlerin geniş bir dizi kaynaklanmaktadır. Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva lokomotif fenotipleri yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniğini sunuyoruz. Başarıyla tanımlama ve posterior felç şi...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması var olduğunu beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

Yazarlar Video anlatım sağlamak için teknik yardım ve destek, James Barton için Alexandra Opie'yi kabul etmek istiyoruz ve beraberindeki video görünmesi için Ramona Flatz ve Joellen Sweeney. Bu çalışma MJ Murdock Charitable Trust (JED Hibe No 2012205) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Trinocular Stereozoom MicroscopeOlympus CorporationSZ6145TR½ C-mount was removed and replaced with 1X C-mount
1X C-mountLeeds Precision InstrumentsLSZ-1XCMT2
Digital Camera Coupler (43 mm thread)Qioptiq Imaging Solutions25-70-10-02
58 mm to 48 mm Step Down RingB&H VideoGBSDR5848
48 mm to 43 mm Step Down RingB&H VideoGBSDR4843
Lensmate Adapter Kit for Canon G10LensMateOnline.com
Canon PowerShot G10 Digital CameraCanon U.S.A., Inc.
1.5 ml Spectroscopic Polysterene CuvetteDenville ScientificU8650-4

Referanslar

  1. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , (2010).
  2. Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
  3. Mudher, A., Newman, T. . Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , (2008).
  4. Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
  5. Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
  6. Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
  7. Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
  8. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
  9. Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
  10. Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan's paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
  11. Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
  12. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
  13. Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , (2004).
  14. Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
  15. Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
  16. Cassimeris, L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol. 14, 18-24 (2002).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 92DrosophilaDavrankoordinasyonemeklemehareketsinir sistemin rodejenerasyonularva

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır