Farelerde Yerel Anafilaksi Ölçme

Özet

Mast hücreleri ve bazofillerin aktivasyonuyla karakterize alerjik tepkiler, IgE çapraz bağlanması ve proenflamatuar aracıların salınması ile tahrik edilmektedir. Alerjik tepkilerin bir kantitatif olarak değerlendirilmesi allerjen vasküler geçirgenlikte değişiklikleri izlemek için Evans mavisinin kullanılması sureti ile elde edilebilir.

Özet

Alerjik tepkiler, mast hücreleri ve bazofiller ve vazoaktif ve proenflamatuvar medyatörlerin, bunu takiben de aktivasyonu sonucudur. Bir hassaslaşmış bireyde bir alerjene maruz kalma küçük eritemden hayatı tehdit eden anafilaksi farklılık klinik semptomlara neden olabilirler. Laboratuvarda, çeşitli hayvan modelleri alerjik yanıtları sürüş mekanizmalarını anlamak için geliştirilmiştir. Bu yazıda, lokalize alerjik yanıtları ölçmek için damar geçirgenliği değişiklikleri ölçmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Yerel anafilaksi tahlil, ilk 1920'lerde bildirildi ve Kojima ve arkadaşları tarafından yayınlanan tekniği adapte edilmiştir. 2007 yılında ^1. Bu testte, OVA duyarlı farenin araç ile sol kulak ve OVA ile sağ kulakta zorlanmaktadır. Bu Evans Mavisi damardan enjeksiyonu ile takip edilir. On dakika sonra enjekte Evans mavisi, hayvanda damar dışına olan boya ötenazi yapılmış ve birkulaklara formamidde gecede ekstre edilir. Ekstre boyanın absorbans daha sonra bir spektrofotometre ile ölçülür. Bu yöntem güvenilir bir lokal allerjik yanıtın görsel ve ölçülebilir tezahürü sonuçlanır.

Giriş

Tip I hipersensitivite, mast hücrelerinin ve bazofillerin yüzeyi üzerindeki IgE, antijen ile indüklenen çapraz-bağlanma ile aracılık eder. Bu hücre degranülasyonunu ve histamin, triptaz ve trombosit aktive edici faktör gibi vazoaktif ² ve proenflamatuvar medyatörlerin salınmasına yolaçar. Degranülasyonunun sırasında önceden oluşturulmuş aracıların yayımlanmasının ardından, mast hücreleri sentez ve daha fazla damar geçirgenliği ³ artış sağlayan prostaglandin ve lökotrienler bırakın. İlk klinik yanıt hızlı bir şekilde oluşur ve "acil reaksiyonu" olarak adlandırılır. Deride, bir pervaz ve şişlik tepki antijenin dakika içinde kolayca görülebilir olduğu anlamındadır. Meydan dozuna bağlı olarak, bir "geç faz tepkisi" bir kaç saat sonra görmek mümkündür. Geç faz şişlik dokulara ² içine lokalize ödem ve lökosit işe kaynaklanmaktadır. Histamin, genellikle katılan önemli arabulucu olarak kabulani alerjik tepkiler, 1 (HR1) kaplar ve histamin reseptörü 2 (HR2) düz kasında eksprese ifade histamin reseptörü üzerine etki eder. Kombine etki, inflamasyon ⁴ bölgesinde kan akışını ve damar geçirgenliğini artırır.

Alerji hayvan modellerinde çeşitli alerjik astım, sistemik anafilaksi ve yerel anafilaksi modelleri dahil alerjik iltihabı dahil mekanizmaları, incelemek amacıyla geliştirilmiştir. Intravenöz boya uygulama yayınlar 1920'lerde ⁵ geri Bu teknik Bayan açıklayan, neredeyse bir yüzyıl için hayvan modellerinde lokalize alerjik tepkileri ölçmek için kullanılır olmuştur. Tavşanlar ve kobay ani hipersensitivite reaksiyonları test etmek için kullanılan ilk hayvan modelleri vardı ve en hassas yanıtlar genellikle kulakta ^5,6 bulundu. Tahlil daha sonra sıçanlarda ⁷ ve farelerde ⁸ kullanılmak üzere onaylandı.

Tarihsel olarak,Deney çeşitli yöntemler önceki boya enjeksiyon, boya enjeksiyondan önce antijen enjeksiyonundan antijen enjeksiyonu ve boya ve antijenin eş zamanlı olarak enjeksiyonu da dahil olmak üzere, kullanılmıştır. Alerjik yanıtların ölçülmesi için bir vasıta olarak intravenöz uygulama boya pasif ve aktif ölçmek için ikinci ve pasif reaksiyonlar ^5,9 ters edilebilir çok yönlü bir deneyidir. Sayısız boyalar Tripan Blue, Pontamine Sky Blue, Evans Blue, Geigy Mavi 536 ve Hindistan Mürekkep ^5,6,9 dahil alerjik yanıtları, değerlendirmek için kullanılmıştır. % 0.5 Evans mavisi çözeltisi halen deri alerjik yanıtı ölçmek için kullanılan standart bir boyadır.

Meydan anafilaktik cevap kısa süreli olduğu; maksimum yoğunluğu, 10 içinde ulaşılır - boya enjeksiyonunun 15 dakika ve boya ne olursa olsun, kullanılan ⁹ hayvan türlerinin, cebine fazla 30 dakika tatbik edilirse, herhangi bir tepki görülebilir. Boya ekstravazasyon Kantitasyonu özgünıy mavi boya ^7-9 ile gösterildiği gibi kabarıklık büyüklüğü ölçülerek elde edilmiştir. Buna ek olarak, granüle mast hücre sayımları, reaksiyon ortamının cilt dokusunun kesilmesi ve ⁷ mavi toluidin ile lekeleme ile tayin edilebilir. Mast hücreleri, yüksek afinite IgE reseptörü eksprese FcεRI ana yerel hücre popülasyonu olarak mast hücre degranülasyonu, genellikle, deri altı, IgE aracılı alerjik karşılıkları için bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır. Doku içine boya ekstravazasyonunu ölçmek için spektrofotometrik teknikler 1990 yılında sıçan ¹⁰ ve fare ¹¹ pasif deri anafilaksi (PCA) için geliştirilmiştir.

Aşağıda yerel anafilaksi Deney protokolü. Kojima ve bunlar ¹ ila uyarlanmış ve allerjik tepkileri ortaya çıkarmak için antijen olarak tavuk yumurtası (OVA) kullanır edildi. Bununla birlikte, istenirse OVA başka antijenler de kullanılabilir. Tahlil sonra vasküler Geçirgenlik değişiklikleri izlemek için Evans Mavi boya kullanırHücre IgE çapraz bağlanması ve histamin salgısını mast nedeniyle meydana y.

Protokol

1. duyarlı Fareler

1. 20 mg / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar 1x PBS OVA seyreltilmesi ile bir OVA stok çözelti hazırlayın. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de cryovials ve mağaza alikotları aşağı dondurun.
2. Oda sıcaklığında 20 mg / mL OVA stoklar bir veya daha fazla alikotları getir. Bir kapağa sahip olan bir 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüpü içinde, 1 mg / ml 'lik bir son konsantrasyona PBS içinde 1x OVA seyreltin. Vortex kısaca karıştırın.
3. : 1 oranında orta hızda ayarlanan bir girdap 1 mg / ml OVA içeren polistiren tüpü tutarken, bir 1 üretmek üzere tüp vorteks devam ederken, iyice homojenleştirilmiştir Imject Alum (40 mg / ml) damla damla, bir eşit hacim kazandırmak immünojene Şap.
4. Girdaba boru ve boru üzerinde bant kapağını yerleştirin. Düşük ayarda vorteks açın ve OVA 30 dakika boyunca Alum'un tutunmasını sağlar.
   1. Zaman büyük miktarda OVA / Alum hazırlanması ve fareler hassaslaştıncı arasında geçmesine izin vermeyin. Hassaslaşması OVA / Şap preparatın sonra doğrudan tamamlanmış edilemezseOda sıcaklığında iyonu deposu OVA / şap. Kullanmadan önce, 1 dakika vorteksleyin.
5. OVA / Şap karışımı ile 1 ml insülin şırınga yükleyin. 27 gauge'lik bir iğne kullanılarak şırınga kapağı.
6. OVA 'nın 50 ug Alum ve 2 mg fare başına bir doz için, BALB / c farelerinin periton içine OVA / Alum 100 ul enjekte edilir.
7. Negatif kontrol için, PBS uygulanan farelerin başka bir grup duyarlı. OVA çıkararak Yukarıda listelendiği gibi aynı şekilde Alum ve PBS'nin 1: 1 karışımı hazırlayın.
8. 3 enjeksiyondan toplam 3 hafta boyunca haftada bir kez tüm fareleri (OVA ve PBS kontrol) duyarlı. Son enjeksiyondan sonra, yerel anafilaksi deneyini gerçekleştirmeden önce en az 2 hafta bekleyin.

2. Yerel Anafilaksi Deneyi

1. Oda sıcaklığına OVA stok çözüm getirecek. (: 1X PBS OVA 4 seyreltme 1), 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü olarak, PBS ile 5 mg / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar 20 mg / ml stok OVA seyreltin. Vortex kısaca karıştırın.
2. RC ^{2 fareler anestezi/ Sup> Kemirgen Anestezi Sistemi (veya benzer buharlaşmış dağıtım sistemi). Izofluran ile doldurun, ve O ₂ hava akımını açın. Indüksiyon odasında Yeri farenin ve Anesthetization başlatmak için% 5 izofluran kumanda düğmesini ayarlayın. Farenin tamamen uyuşturulduktan sonra, hareketlilik eksikliği ile gösterilen, derin Anesthetization korumak için% 3 izofluran kumanda düğmesini ayarlayın. Bu prosedürde anestezi amacı, hayvan hareketsizleştirmektir. Kulak ve kuyruk ven enjeksiyonları hayvana ciddi ağrı veya sıkıntı yok.
   NOT: İsofluranın insan üreme sistemi üzerinde olumsuz etkileri olabilir. Atık gazın etkisiz hale getirmek için iyi havalandırılan bir odada kullanmak ve indüksiyon odasına bir atma bidonu eklemek için emin olun. Izofluran kullanırken hamile iseniz, maruziyeti en aza indirmek için bir karbon filtre maske takmalıdır.}
3. Yük bir 31 G iğne ile kapatılmış bir 3/10 cc'lik bir şırıngaya insülin 5 mg / ml OVA 10 ul. 10 ul başka bir 3/10 cc şırınga insülin yük1x PBS ile yıkandı.
4. Diseksiyon mikroskobu kullanarak, OVA 50 ug bir meydan okuma doz için bir anestezi fare sağ kulağına OVA 10 ul enjekte. Diğer dozlar, örneğin, 20 ug olarak da kabul edilebilir.
   1. 15 ml konik tüp etrafında seloteyp bant (yapışkan tarafı yukarı) wrap, enjeksiyon için kulak stabilize etmek. Teybe sağ kulağının dorsal yüzü sabitleyin. Kulak, iki yaprak arasındaki iğne konik tarafı yerleştirin. Yavaşça herhangi bir kan damarlarını vurmak için özen, kulak doku merkezi haline OVA enjekte.
5. Yukarıda tarif edilen aynı yöntem kullanılarak, bir negatif kontrol olarak, sol kulağa 10 ul PBS enjekte edilir.
6. 3 dakika bekleyin.
   1. Bu süre içinde, bir süzgeç içinde fare ve 1 dakika kan damarlarını genişletmek için bir ısı lambası altına veya sıcak su banyosu içinde kuyruk tutun.
7. Yavaşça kuyruk v içine% 0.5 Evans mavisi 200 ul enjekte bir 27 G iğne ile kapatıldı 1 ml'lik şırınga kullanarak insülinfare ein. Tüm 200 ul önce damar yapısını tahrip olabilir Rapid enjeksiyonu uygulanır. Bu durumda, kuyruk karşı tarafında ven içine boyanın geri kalan hacim enjekte çalışır.
8. 10 dakika bekleyin.
9. Fareyi Euthanize ve forseps ve cerrahi makas kullanılarak hem kulaklarını çıkarın.
   1. Basınç kulak merkezinde enjeksiyon sahaya uygulanır; emin, forseps ile kulak kenarları al. Yakın kesim ile mümkün olduğu kadar çok kulak doku çıkarın, ancak boydan boya olmayabilen, kulak tabanında kıkırdak mevcut olan sırt. Kürk küçük miktarlarda kesilerek çıkarılmış kulak üzerinde mevcut olabilir; Bu, deneyin etkilemez.
10. Kısım bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine formamit 700 ul. Kulak başına bir tüp (fare başına iki tüp) hazırlayın.
    NOT: Formamide, teratojenik, mutajenik ve tahriş edicidir. Eldiven, koruyucu gözlük ve yüz koruyucu giyin. Bir tutarken Hamile kadınlar dikkatli kullanmalıdırs formamıd fetotoksik olabilir.
11. , Formamıd tüpler kap ve 63 ° C'ye ayarlanmış kuru bir ısı banyosu gecede inkübe kulakları ekleyin. Kulaklar hala kuluçkadan sonra biraz mavi görünebilir; Ancak boyanın çoğunluğu formamid içine ekstre edilir.
12. 96 oyuklu bir plaka için, iki kopya halinde, her bir numune 300 ul ilave edin. Bu numune içerisinde mevcut olması halinde kürk aktarılmasını önlemek. Kuyu içinde mevcut hava kabarcığı vardır ki bunlar absorbans okumasını etkileyecek şekilde sağlanması.
13. 96 gözlü plaka, iki kopya halinde, formamid 300 ul ilave edin. Bu kuyular, blok olarak kullanılacaktır.
14. 620 nm'de absorbans ölçümü için bir spektrofotometre kullanılır. Her örnek okuma Çıkar formamiddir kuyular.
    Not: Bütün deneyler Kuvvetler Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri altında yapıldı.

Sonuçlar

Başarıyla tahlil geçirmiş hayvanların deri ve mavi görünür gözleri vardır. PBS duyarlı hayvanlar bu nedenle hem kulaklar beyaz (Şekil 1A) kalmalıdır, PBS veya OVA da tepki olmamalıdır. OVA hassas hayvanlarda PBS meydan alan kulak (sol) tamamen beyaz veya enjeksiyon bölgesinde lokal bir şekilde hafifçe mavi olarak olmalıdır. OVA alan kulak (sağ) bir boya uygulama için (Şekil 1B) sonra 10 dakika boyunca aşamalı olarak koyu mavi olmalıdır.

Tartışmalar

Alerjik hastalıkların sayıda belirteçleri havayolu meydan ortamda bronkoalveolar sıvı dolaşması histamin Th2 sitokin üretimi ve hücre işe seviyelerindeki değişiklikler dahil olmak üzere, alerji yapıcının aşağıdaki alerjik cevaplar, gücünü değerlendirmek için kullanılır. Bu parametrelerdeki değişiklikleri izleme alerjik reaksiyonlara eğitim için önemli olmakla birlikte, biyolojik belirteçlerin her zaman klinik alerjik hastalığı ile ilişkili değildir. Bu protokol açıklanan yerel ana...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform