Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize "Kargo Haritalama" Analizi

Özet

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Özet

Moleküler motorlar nöronların içindeki veziküler kargoları taşımak faaliyetlerini koordine hangi mekanizmaların anlaşılması tek kese düzeyde motor / kargo derneklerin kantitatif analizini gerektirir. Bu protokolün amacı, aynı yük ile ilgili motorların bileşim ve ilgili miktarları ("harita") ilişkili olduğu canlı yük hareket konumunu ve yönünü kantitatif floresan mikroskobu kullanmaktır. "Kargo haritalama" canlı canlı hareket kaydı sırasında kimyasal sabitleme takip microfluidic cihazlar üzerinde kültüre akson hareket floresan etiketli yükün görüntüleme, ve motorlar karşı antikorlar ile aynı aksonal bölgelerin sonraki immünoflüoresans (IF) boyama oluşur. Yükün ve bunların ilişkili motorlar arasındaki kolokalizasyon alt-piksel pozisyonunu atayarak değerlendirilir kırınım-li uydurma Gauss fonksiyonları tarafından, motorlu ve kargo kanalları koordinatlarıBireysel floresan nokta kaynaklarını temsil eden kişilere sınırsız bir puan farkı fonksiyonları. Sabit kargo ve motor görüntüleri sonradan izlenen yörüngeleri onları "harita", kargo hareket araziler için bindirilmiş. Veri canlı hücrelerde veziküler yüklerin taşınmasını hem kaydetmek ve bu aynı kesecikler ilişkili motorları belirlemek için IF Bu protokolün gücü canlı bir birleşimidir ve. Bu teknik, bu yöntemler tek hareketli yüklerin hakkında kompozisyonlar ortaya yok gibi, saflaştırılmış heterojen toplu vezikül nüfusun ortalama motorlu bileşimini belirlemek için biyokimyasal yöntemleri kullanmak önceki zorlukların üstesinden gelir. Ayrıca, bu protokol protein bileşimi ile tek tek hücre içi yapıların hareketini ilişkili diğer hücre tiplerinde başka nakil ve / veya değiş tokuş yollarına analizi için adapte edilebilir. Bu protokol sınırlamaları nedeniyle kültürlü düşük transfeksiyon verimliliği için nispeten düşük verimlilik vardırBirincil nöronlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir kısıtlı bir bakış alanı. Gelecekteki uygulamaları floresan etiketli yüklerin ifade nöronların sayısını artırmak için yöntemleri içerebilir.

Giriş

Hücre içi ulaşım çeşitli hücresel etki ¹ Proteinlerin, membranlar, organeller ve sinyal moleküllerinin verilmesi için tüm hücre tiplerinde önemlidir. Nöronlar son derece eleştirel çeşitli aksonal microdomains onların uzun mesafe teslimat için gerekli yüklerin içi ulaşım bağlıdır uzun, polarize projeksiyonlar hücreleri uzmanlaşmıştır. Iki büyük moleküler motor proteinlerinin aileleri - - Bu taşıma kinesinlerin ve dyneins aracılık kargolara bağlanan ve sırasıyla ileriye ve retrograd yönlerde polarize mikrotübüllerinde boyunca izleyebilirsiniz. Geriye hareket esas olarak dinein aracılık ederken, ileriye doğrultuda hareket kinesin motorlarının büyük bir işlev olarak zengin etti kolaylaştınlır. Sonuç olarak, aksonal yüklerin ileriye taşıma kinesin'in süperailesinin ^1-5 çeşitli aile üyeleri tarafından aracılık olabilir. Bazı yüklerin her iki yönde, m ısrarla hareket olsaost kargolar çift yönlü taşımak ve nihai hedeflere ^1,5-13 yolunda sık sık ters. Ayrıca, gösterilmiştir ki, Yükün aynı anda yön önlisans karşıt yüklerin düzenlenmiş hareketi ters kutupluluk motorlar ^5-7 koordine olarak nasıl soru yükselterek motorlar. Birlikte, aksonal yüklerin taşınması motorlar ve bu da çeşitli adaptörleri ve düzenleyici bağlama ortakları ¹⁴ bağlıdır kendi özel biyokimyasal faaliyetleri, bileşimin düzenlenir uyumlu bir süreçtir.

Sadakatle Belirli bir kargo için aksonal taşıma mekanizmasını tanımlamak ve bu ulaşım yatan düzenlenmesini ortaya çıkarmak için, onların canlı taşıma sırasında bireysel yüklerin ile ilişkili motor proteinlerin ve onların düzenleyici bağlama ortaklarından kompozisyonunu belirlemek için her şeyden önemlidir. Diğer yöntemler, örneğin biyokimyasal yaklaşımlar, ortalama mot tahminleri sağlamakya da saflaştırılmış heterojen vezikül popülasyonları üzerindeki kompozisyonlar, ancak bu tahminler türünü veya tek hareketli kesecikler ilişkili motorların miktarlarda ortaya çıkarmak değil. Aynı zamanda, in vitro olarak, önceden monte edilmiş mikrotübüller boyunca vezikül taşıma yeniden yapılandırılması tek vezikül seviyesinde ¹⁵ motorun bir tipinin miktarının ölçülmesi sağladı. Bununla birlikte, bu deneyler, doğrudan bu veziküllerin taşıma vasıfları olan motorlara miktarı korele olur ve hücre düzenleyici faktörler yokluğunda taşıma ölçülen değildi.

Endojen olarak ölçüm (IF) verileri, motor proteinleri ifade, bağışıklık tek tek hareket veziküllerin motor bileşimi (tip ve motorlar göreceli miktarı) belirler ve nöronlarda aynı veziküllerin canlı taşınması için bu parametreleri ilişkilendirir, burada sunulan bir protokol ^16. Bu yöntem IF-to-live kargo hareketi verilerinin hassas haritalama gerektirir. Bu growin ile gerçekleştirilmektedirmikroakışkan cihazlarda g hipokampal fare nöronları protokolleri ^17-19 kurdu aşağıdakiler. Bu cihazlar, sabit ve canlı ışık mikroskobu modaliteleri akson ve tek hareketli yüklerin tanımlanması ve korelasyon ("haritalama") (Şekil 1) için izin verir. Kültürlü nöronların, taşıma kymographs çizilir ayrıntılı hareket bilgilerini almak için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntülü floresan etiketli kargo proteinleri ile aktarılır. Görüntüleme sırasında, nöronlar paraformaldehit ile sabitlenmiştir ve daha sonra endojen motor proteinlerinin karşı antikor ile boyanmıştır. Sabit kargo ve motor görüntüleri hareketi ¹⁶ yörüngeleri canlı kargo onları "map" (colocalize) canlı hareket kymographs üzerine bindirilmiş. Motor proteinlerinin dernek ile yüklerin canlı hareketini korelasyon, kolokalizasyon "Mo adlı bir özel yapılmış MATLAB yazılım paketi kullanılarak analiz edilirtor kolokalizasyon ^"16,20. Floresan etiketli kargolar ve motorlar üst üste kısmen olabilir kırınım-sınırlı noktasal özellikleri oluşturmak. Puncta örtüşen konumunu gidermek için, yazılım ilk otomatik olarak hassas XY alt-piksel konumunu belirlemek için, bireysel floresan puncta temsil eden her bir nokta yayılım fonksiyonu Gauss fonksiyonları uyuyor koordine ve yoğunluğu ^21-23 genliği. Motorlar ve yük pozisyonları Daha sonra ko ^16,20 belirlemek için birbirleri ile karşılaştırılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, daha doğrusu diğer yöntemlerle ²⁴ ile karşılaştırıldığında floresan puncta arasındaki ko atar.

Bu yöntemin gücü canlı hareketi yörüngeleri (örneğin, yön ise bu tespitin anda hareket edilmiştir) kyt edilmiş olan sabit hücrelerin tek tek yük motorlarda ko değerlendirmek için yeteneğidirorded. Bu yöntemle, kinesinler ve dyneins (PrP ^Cı -Hücresel) çift yönlü hareket eden ya da akson ¹⁶ sabit olarak kalan bir nöronal olarak zenginleştirilmiş yük, normal prion proteinini yapmak vesiküller eş zamanlı olarak ilişkilendirmek için bulunmuştur. Bu analiz kargo ile ilişkili iken anterograde (kinesin) ve retrograd (dinein) motorlar iki yönde veziküllerin hareket etmek veya sabit kalması amacıyla faaliyetlerini koordine edildiği PrP ^C vezikül hareketinin düzenlenmesi için bir çalışma modeli formülasyonunu izin . Bu yöntemin diğer bir gücü herhangi diğer ilgi protein (ler) ile birlikte, hemen hemen herhangi bir hücre tipi içinde hareket birçok floresan işaretli Yükün ko / ilişkiyi karakterize etmek için potansiyel, geniş uygulanabilmesidir. Bu nedenle, bir çok canlı / sabit bir ilişki potansiyel geçici protein yük etkileşimleri saptanması için izin verebilir, hareketli parçalardan etiketli birçok bireysel flüoresan istenen bir p fazla analiz edilebilirzaman dönemdedir. Geniş uygulanabilirliği ve bu yöntem hitap edebilecek sorular tipi göz önüne alındığında, bu protokol nöronlar veya diğer hücre tiplerinde bu eğitim kaçakçılığı ve ulaşım dahil olmak üzere hücre biyologlar geniş bir kitleye ilgi olacaktır.

Protokol

Tüm deneyler onaylı protokolleri takip ve araştırma hayvanların insancıl bakımı için kurumsal kurallarına göre yapılmıştır. Yenidoğan farenin dekapitasyon yoluyla kurban edilmiştir.

Hücre Kültürü için mikroakışkan Cihazlar 1. Hazırlık

1. Harris ve ^{arkadaşları, 17-19} tarafından tarif edildiği gibi hipokampal nöronlar büyümesi için polidimetil siloksan (PDMS) mikroakışkan cihazlar hazırlayın. Aşağıda kargo haritalama protokole uyarlanmıştır bazı değişiklikler vardır.
   Not: mikroakışkan aygıtları da (Malzeme listesi) ticari olarak temin edilebilir, bir üretim tesisi, böylece erişim gerekli değildir.
2. Olanağına% 100 etanol ile üç kez su ve üç kez, ardından aseton ile üç kez yıkanarak No 1 ½ kapak bardak (24 x 40 mm) hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklayın lamelleri. Bu tedaviler lamelleri cel ekilmesin- ile etkileşebilir enkaz temiz olduğundan emin olun yardımcıls, kirlenme ve hayatta.
   NOT: Aseton ve etanol inhalasyon, yutma, yanıcı ve göz teması (irritan) cilt teması (tahriş edici), durumunda tehlikeli. Resmi yönetmeliklere göre imha ediniz.
3. Ne zaman, kullanmak mikroakışkan cihaz başına 60 mm hücre kültürü çanak bir cam kapak yerleştirin ve kuru hava kirlenmesini önlemek için bir biyogüvenlik kabini içinde 45 dakika boyunca ortaya izin vermek için hazır.
4. Cihazları ustaları dışarı kesilir ve zımbalar rezervleri oluşturmak için kesilmiş sonra (Şekil 1A, B), sterilizasyon için 45 dakika için bir UV lambası ile donatılmış bir biyogüvenlik kabini içinde mikroakışkan kanalları yan-up ile koyun.
   NOT: en fazla 2 saat süreyle UV tedavi altına cihazları bırakmak PDMS bütünlüğünü etkileyebilir.
5. Mikroakışkan kanallar aşağı bakacak şekilde 60 mm plastik hücre kültürü çanak içinde her cam kapak üzerine bir cihaz yerleştirerek cihazlarını monte. Üst o hafif bir basınç uygulayınCihazın F, kapak camın için cihazın bir daimi olmayan bir sızdırmazlık temin etmek üzere (mikrokanallar dokunmaktan kaçının). Bir kapak ile, her 60 mm hücre kültürü çanak örtün.
6. Bir mikropipet kullanılarak, suyun akmasına izin vererek, üst iki mikroakışkan rezervuar (Şekil 1A, 1 ve 2), hücre kültürü dereceli su eklemek suretiyle aygıtları hidrat. Mikropipet, suyu buharlaştırmak ve mikro-akışkan haznesi 1 (200 ul) ve 2 (100 ul) içinde 1 mg / ml poli-L-lisin ekleyin. Hacim diferansiyel mikro (Şekil 1A, B) içinden akması için poli-L-lisin sağlayacaktır.
7. 60 mm'lik hücre kültür kapları içinde cihazları 37 ° C inkübatör içinde devrilmesine emin olmak için, bir 150 mm plastik hücre kültürü kabı içine cihazları içeren üç ila 60 mm hücre kültür kaplarına yerleştirin ve bir kapak ile yemek kapsamaktadır. % 5 _CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N inkübe edin. Tipik olarak kanal% 90'dan daha fazla cihaz başına kullanılabilir ve mutlakaherhangi bir hava kabarcığı ya da fiziksel tıkanma içermez.
8. Ertesi gün su ile poli-L-lisin yerine ve en az 1 saat boyunca kuluçka makinesi içinde cihazı bırakın. Bu yıkamanın üç kez tekrarlayın. Suyu çıkarmak ve her cihaza (2% B-27 takviyesi ve 500 ıLl glutamax içeren) Neurobasal-A besi ekleyin. % 5 _CO2 içeren bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N bırakın.
9. Aşağıda tarif edildiği gibi bir sonraki gün, hipokampal hücreleri plaka.

Mikroakışkan Cihazlar Fare Hipokampal İlköğretim Nöronlar 2. Kaplama

Not: Yeni doğmuş farelerin kültürlenmiş hipokampal nöronlar hazırlanması daha önce Jüpiter ²⁵ yayınlanmıştır. Aşağıda mikroakışkan cihazlarda levha fare hipokampal nöronlar için adapte edilmiştir bazı değişiklikler olduğunu ve Transfeksiyonlar için uygun olmuştur.

1. Fare beyni diseksiyon, daha önceden sıcak Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 fetal bovin serumu(FBS; antibiyotikler olmadan), A Karışımı (125 mg DL-sistein, 125 mg büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve fosfat tamponlu salin (PBS), 500 ml, D-glikoz 3,125 g, filtre, bir 0.22 um filtre ile steril edilmiş) bir 37 ° C su banyosu içinde: ve bir çözeltisi (50 DNase I'inin mg ve 100 ml Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) filtresinde 1.2 M MgSO ₄ çözeltisi, 0.5 mi, 0.22 um'lik bir filtreden steril bir DNase) deoksiribonükleaz.
   1. % 5 _CO2 içeren bir 37 ° C inkübatör içine önceden sıcak Neuro temelli-bir büyüme ortamı pH dengelenmesi için akmaktadır.
2. Oluşturulan protokollerle ²⁶ göre 1-3 gün eski yenidoğan farelerden hippocampi teşrih. Buz üzerinde (10 mM HEPES pH 7.4, 50 mM glükoz, 100 E / ml penisilin ve / ml streptomisin, 100 ug içeren HBSS), 10 mi diseksiyon tampon ihtiva eden bir 15 ml konik bir tüp içinde hipokampları tutun. 15 ml konik tüp başına 4 Hipokampuslardan kadar koyun.
3. Kalan protokol gerçekleştirmek steril koşullarda olduğunuBir biyogüvenlik kabini içinde s.
4. Mixture A, girdap 5 ml papain 45 birimleri seyreltin ve papain toz çözünene kadar 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir. DNase I çözeltisi 1 ml ilave edilir. 0.22 mikron şırınga filtre ünitesi sayesinde karışımı süzün.
5. 15 ml konik tüp içeren Hipokampuslardan gelen Dikkatlice aspire HBSS '. Ekleyin, 10 ml soğuk (4 ° C) HBSS hipokampi ve bunları tüpün dibe sağlar. Dikkatle 15 ml konik tüp dan HBSS aspire.
6. Ben 4 Hipokampuslardan kadar karıştırılır ve 37 ° C'de 20-30 dakika süreyle inkübe 1 mi Papain / DNase ekleyin. Konik tüpü karışımı ile hippocampi yıkanmak için her 5 dakikada eğin. Alternatif olarak hafifçe çalkalama (~ 100 rpm) ile 37 ° C su banyosu çalkalayıcısına hipokampları yerleştirin.
7. Aspire Papain / I karıştırma ve% 10 FBS ihtiva eden, önceden ısıtılmış DMEM (37 ° C) hipokampi iki kez yıkayın, DNase.
8. İkinci yıkamadan sonra, 2 Hipokampuslardan,% 10 FBS ihtiva eden, önceden ısıtılmış DMEM ml ve pipetleme el çiğnemek hipokampları ekleyukarı ve nöronlar ayırmak için 1 ml pipet kullanarak 10-12 kat ~ aşağı.
9. Bu non-ayrışmış nöronlar konik tüp altına yerleşmek için izin verecek gibi çiğnemek ~ 1 dakika dinlendiriniz. Tüpün alt kısmında yerleşmiş olan büyük doku transferi kaçınarak, yeni bir 15 ml konik tüp ayrışmış nöron içeren süpernatant aktarın.
10. 2 dakika süreyle 1000 xg'de hücreleri Spin ve dikkatle hücre pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. Hafifçe pipetleme 80 ul Neuro temelli-bir büyüme ortamında süspansiyon hücreleri.
11. Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 'orta çıkarın. Mikroakışkan rezervuar 1 hücrelerin 20 ul (~ 275.000) uygulayın ve onları dolaşmasını sağlar. 20 dakika boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C inkübatör yerleştiriniz.
12. Hücreler, kapak camın yapışmış sağlamak için mikroskop altında bakın. Tüm depoları kapalı dön Neurobasal-A besi ekleyin. % 5 CO ile 37 ° C inkübatör hücreleri ile cihazını geri _2.
13. Aygıtları her ~ (glutamax olmadan) Neurobasal-A içeren% 2 B-27 takviyesi ile 2-3 gün ve kapalı üst rezervuarlar önlemek için buharlaşma kontrol edin. Nöronlar sonra kaplama ~ microfluidic kanallardan 2-3 gün aksonları uzatmak başlar. Konu nöronlar kaplama sonra genellikle 7-10 gün transfeksiyona.

Mikroakışkan Aygıt Yetiştirilen Hipokampal Nöronlar 3. Transfeksiyonu

1. Cihaz başına, 30 ul, Neuro temelli-A 1.2 ul Lipofektamin 2000 bir karışımı ve 30 ul Neuro temelli-A içerisinde 0.5 ug floresan yük füzyon plazmidinin bir karışım oluşturmak ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. DNA karışımına Lipofektamin karışımı ilave edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. DNA% 4 B-27 takviyesi içeren Neurobasal-A 60 ul ekleyin / Lipofektamin karıştırın ve tüp hafifçe karıştırın.
2. 'Mikroakışkan rezervuar 2 ve 2'den tüm ortamları çıkarın ve dikkatli bir orta int dökülüp olmadan% 2 B-27 takviyesi içeren Neurobasal-A ile kuyu doldurmakdiğer bölmelere O.
3. Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 'bulunan ortamı çıkarın. DNA'nın 120 ul ekleyin / Lipofektamin mikroakışkan rezervuar 1 karıştırın ve akıtın. 3-4 saat için% 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör cihazı dönün.
4. 'Mikroakışkan rezervuar 1 ve 1 tüm ortamları çıkarın ve 24 saat Neurobasal-A içeren% 2 B-27 takviyesi ile değiştirin (ya da hazır olana kadar görüntüye). Tipik olarak, mikro yoluyla büyümek 5-7 aksonlar yaklaşık hipokampus kültürlü hücrelerde ²⁶ için yayınlanan verimliliği ile tutarlı% 1-3 transfeksiyon etkinliğini temsil eden koşullar altında transfekte.

4. "Kargo Mapping" Analizleri

1. Kargo hareketinin Canlı Görüntüleme
   1. 37 ° C inkübatör ve CO ₂ kontrol odası ile donatılmış bir ters Epifloresans ışık mikroskobu görüntüleme gerçekleştirmek.
   2. Bir MICR yetiştirilen hipokampalinden ile lamel monte edinMikroskop sahneye ofluidic cihaz. Nöron ölümünü önlemek için, daha uzun bir süre, 1 saat boyunca mikroskopla örnekleri korumak için süratle çalışır.
   3. Yüksek çözünürlüklü bir hedefi (100 X) kullanarak, mikroakışkan bölmelerin kanalları boyunca uzanan ve transfekte akson bulundu edildiği kanalların sayısını kaydetmek transfekte edilmiş hücrelerin aksonlar bulabilirsiniz. Bir el taksitli sayacı kullanarak kanal sayısını.
      1. Canlı hareket ve daha sonra ko analiz optimal kayıt için, çoğu kesecikler bu görüntüleme odak gerçekleştirilebilir, böylece kanaldan nispeten düz bir büyümeye aksonlar seçin.
   4. Bir tane 1 ml'lik plastik bir transfer pipeti ile rezervuar 2 ve 2 'den sıvı ortamı en iyi çıkarın. Kymographs üzerinde hareket yörüngeleri sabit görüntülerin ardından hizalamayı kolaylaştırmak için, görüntüleme (Şekil 1B, C) ​​sırasında görüş alanı ile mikrokanalların sağ kenarına hizalayın.
   5. Yerleştiğinde kolaylaştırmakgörüntüleme sırasında örneklerin g, iki kişi ile canlı görüntüleme gerçekleştirmek. Canlı görüntüleme tek bir kişi tarafından gerçekleştirilen Alternatif olarak, eğer, sürüklenme düzeltme ile donatılmış bir mikroskop sistemi kullanın.
   6. (Şekil 2 ve Malzeme Listesi efsanesi belirtilen YFP-PrP ^C görüntüleme için mikroskop özellikleri ve ayarları) time-lapse analiz edilen kargo taşıma dinamikleri özgü özellikleri ile görüntüleme canlı kargo hareketi başlatın.
   7. Yeterli canlı hareketi verileri toplanmıştır sonra, bir kişi PBS içinde önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid hücreleri düzeltmek için 0,04 g / ml sükroz içeren 'rezervuarları 2 ve 2 doldurmak zorunda. Bu canlı görüntüleme odağı bozacak gibi, mikroakışkan cihaz dokunmaktan kaçının. Fiksatif ilave edilirken diğer kişinin odağı ayarlamak var. Hareketin acil durdurma gözlendiğinde sabitleme başarılı. Sonra 1 ve 1 'rezervuar Fiksatif ekleyin.
      NOT: Geçici photobleakargo floresan ching da gözlenen olabilir, ancak motor proteinlerin IF boyama (bir sonraki adımı) tamamlandıktan sonra floresan devam.
      NOT: Paraformaldehyde cilt ile temasında, solunduğunda zararlıdır ve yutulduğunda. Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş edicidir. Resmi yönetmeliklere göre imha ediniz.
2. IF ko analizi için motor proteinlerinin aktif boyanması
   Not: tek tek hareket eden yük ile bağlantılı motor proteinlerinin nispi seviyeleri (antikor lekeleme ile tespit edildiği üzere), nicelendirilmesi için, doğrulamak ve antikor-antijen bağlanma doymuş olduğundan emin olmak için antikorlar titre edilir. Bu, söz konusu protein, ya nakavt edilmiş olduğu nöronlar ya sersemleyen kullanılarak antikorun özgünlüğünü belirlemek suretiyle yapılır, ve gerçekleştirerek, antikor konsantrasyonları artan analizi. Negatif kontroller için, nöronların Primer antikor yokluğunda ikincil antikor ile boyandı. Daha detaylıAntikor doğrulama tanımı Encalada et ^{al., 16,} ve Szpankowski ve ^{diğ., 20} bulunabilir.
   1. Mikroskop sahneden mikroakışkan cihaz yetiştirilen hipokampalinden ile lamel çıkarın. Mikrokanallardır canlı ve sabit görüntüleri eklemek için bozulmadan kalması gerekir gibi, lamel mikroakışkan cihazı çıkarmayın. Bir nemlilik bölmesi içinde, aşağıdaki adımları.
   2. Mikrokanalların içine çözümlerin akışını sağlamak için, en az 30 ul ', 2, ve 2' rezervuar 1, 1 arasında bir tampon hacim farkı korumak. sonraki tüm basamaklarda. Örneğin, 'mikroakışkan rezervuar 1, 1, ve 70 ul ortam hacminin' mikroakışkan rezervuar 2, 2 100 ul medya sesini ekleyin.
   3. Mikroakışkan cihazın odalarından Fiksatif çıkarın ve PBS yıkar arasında 10 dakika bekledikten hücreleri üç kez yıkayın.
   4. % 0.1 Triton X-100, Dilu ekleyerek hücreleri geçirgenleştirmektüm haznelere, 5 dakika boyunca PBS içinde monte edilir.
   5. Bütün barajlar çözüm çıkarın ve PBS ile yıkayın. Yıkamanın yıkamalar arasında 10 dakika bekledikten üç kez tekrarlayın.
   6. Tüm haznelerden çözeltisini çıkarın ve PBS içinde% 10 normal eşek serumu ve% 3 proteaz serbest ve immünoglobulin G (IgG) içermeyen BSA ihtiva eden tampon bloke uygulanır ve oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edilir.
   7. 5 dk çökeltileri kaldırmak için 20,000 xg birincil antikor stok solüsyonu Spin. Bloke edici tampon içinde, uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir antikor. Antikor çözeltisi ile mikro-akışkan cihazdan bloklama tamponunu değiştirin. 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N C'de 2 saat boyunca örnekleri inkübe edin.
   8. Tüm haznelerden çözeltisi çıkarın ve yıkamalar arasında 10 dakika bekleme, üç kez PBS ile yıkayın.
   9. 5 dk çökeltileri kaldırmak için 20,000 xg ikincil antikor stok solüsyonu Spin. Bloke edici tampon içinde, uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir antikor. İkincil antikor solüsyonu PBS ile değiştirin. Kuluçkaya yatmakoda sıcaklığında 1 saat süre ile örnekler.
   10. Tüm haznelerden çözeltisi çıkarın ve yıkamalar arasında 10 dakika bekleme, üç kez PBS ile yıkayın.
   11. Doğrudan rezervuara bağlayan kanalların açıklığı içine montaj ortamı pipetle 10-20 ul montaj orta ~ PBS ile değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat -, 20 dakika boyunca ortam kuru olarak monte olsun.
   12. Boyama iki gün (en fazla bir hafta) olan ışıkla bilmek ışıktan korumalı 4 ° C'de saklayın cihazlar ve görüntü aksonlar.
   13. Boyama tamamlandıktan sonra, mikroskop sahneye mikroakışkan cihaz yetiştirilen hipokampalinden ile lamel monte edin. Adım 4.1.1-4.1.7 görüntülü transfekte akson bölgesini bulun.
   14. Yüksek çözünürlüklü hedefi (örneğin, yüksek bir sayısal diyafram yağ veya su objektif) kullanılarak, kargo, motor 1, motor, 2: üç kanalın her biri için Z-yığın görüntüleri (300 nm adım) edinin.
       NOT: aksonlar genellikle mükemmel düz büyümek yok gibi Z-yığınlarının kazanılması önemlidirTüm floresan puncta Mikrokanallarda ve bu nedenle değil, aynı odak düzlemi vardır.
3. Kargo Haritalama
   1. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak yük hareketinin kymograph oluşturur. Rietdorf ve Seitz (EMBL) tarafından geliştirilen ImageJ eklentisi kymographs üretmek için tavsiye edilir (indirmek için bakınız Malzemeler Listesi).
      NOT: ImageJ Sağlık ^27,28 National Institutes geliştirilen bir kamu alanı, Java tabanlı görüntü işleme programı (indirme Malzeme Listesi için bakınız).
   2. (Malzemeler, tespitin noktası (Şekil 2A, B) kymograph yörüngeler konumu üzerine onları atma piyasada mevcut grafik programı kullanılarak elle (adım 4.2.14 oluşturulan) floresan kargo sabit görüntüleri hizalamak Liste). Elle ilk kymograph üzerine sabit kargo görüntüyü atma ve elle belirli bir yörünge karşılık kargo puncta seçerek hizalamakymograph. En iyi hizalama sonucu almak için, eşleştirilmiş kargo için en iyi odakta Z dilim kullanın. Çeşitli Z, dilim kullanılabilir.
   3. XY koordinatları ve kurulmuş bir algoritma kullanarak her floresan puncta için yoğunluğu genlikleri temsil noktası yayılma işlevine 2D Gauss uyacak şekilde belirlemek, her Z-yığını içinde görüntü (adım 4.2.14 üretilen kargo motor 1 ve motor 2) için üç kanal ^16,20,21 (Şekil 2D) her birinde her bir nokta kaynağı.
      NOT: Jaqaman, Danuser ve meslektaşları ^21-23 tarafından geliştirilen Gauss uydurma algoritması içermektedir XY koordinatlarını, ^16,20 geliştirilen "Motor kolokalizasyon" adında bir özel inşa MATLAB yazılım paketi, elde etmek. Kullanımı için yazılım paketi ve ayrıntılı talimatlar talep üzerine temin edilebilir.
   4. Kymograph üzerinde mobil veya sabit bir yörünge üzerinde haritalanmıştır tek tek yük puncta her biri için, T seçmeko "Motor kolokalizasyon" programı sonuçlarından koordinatları ve yoğunluk aralığı (bu kargolar tek tek Şekil 2B'de etiketli) xy. Farklı odak düzlemleri üzerinde bulunan daha fazla kargo Haritayı adım 4.2.14 edinilen birkaç Z-yığın görüntüleri) kullanın.
   5. Bireysel XY benzeri Z dilim (Şekil 2B) 'de, motor kanalın her biri için elde edilen değerler ile eşlenmiş kargo için koordinatları Karşılaştırması. Belirleyin ve kargo 300 nm yarıçapı içinde XY motorlu koordinatlarını seçin. Yük ve aynı odak düzlemi içinde sinyal var motorlar için, 300 nm yarıçapında bulunan puncta belirlemek için "Motor kolokalizasyon" yazılım paketi kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1 hipokampal nöronlar büyümek için kullanılan mikroakışkan cihazın bir bakış gösterir (Şekil 1A, B). Nöronlar kanalların uzunluğu aksonal bölmeye tüm yol geçen dendritik projeksiyonlar engellerken mikro büyüklüğü aksonal bölmesine hücre gövdeleri (soma) difüzyonunu önlemektedir rezervuar 1'de plakalanır. Kültürde ~ 2-3 gün sonra, nöronlar aksonal bölmesine (Şekil 1B, C) ​​içine Mikrokanallarda karşısında aksonları u...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol canlı nöronların göreli türü ve ilgili motor proteinlerin miktarı ile bireysel floresan mikrotübül tabanlı hareket eden kargo parçacıkların hareketinin yönlülük korelasyon sağlar. Daha önce, aksonal veziküler yüklerin toplam motorlu kompozisyon biyokimyasal olarak arıtılan veziküllerin ve organellerin ^9,15 heterojen toplumlarda denendi. Ancak, hücre içi kargo tek bir türü için karakterize motorlu kompozisyon, çünkü homojen vezik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine	Sigma	P5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x)	Life Technologies	11965092
FBS (Fetal Bovine Serum)	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A Medium (1x)	Life Technologies	10888022
B-27 Serum Free Supplement	Life Technologies	10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)	Life Technologies	35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution)	Life Technologies	24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x)	Life Technologies	14190250
Penicillin/Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture	Fisher Scientific	MT46000CM
Papain	USB Corporation	19925
DL-cysteine HCl	Sigma-Aldrich	C9768
BSA (bovine serum albumin)	Sigma-Aldrich	A7906
D-glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DNAse I grade II	Roche Applied Sciences	10104159001
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027
Formaldehyde Solution 16% EM Grade	Fisher Scientific	50980487	Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
HEPES	Sigma	H-3375
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-0121
BSA fatty acid and IgG free	Jackson Immuno Research	001-000-162
Acetone	Fisher Scientific	BP2403-4
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-100
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm	Corning	2980-244
Axis microfluidic device, 450 µm	Millipore	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon
Coolsnap HQ camera	Roper Scientific
60 mm cell culture dish	Fisher Scientific	12-565-95
150 mm cell culture dish	Fisher Scientific	12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17	Santa Cruz	sc-13362	specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325	Santa Cruz	sc-9115	specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody	Life Technologies	A10042	recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A31573	recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody	Life Technologies	A11057	recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A21447	recommended dilution 1:200.
Plugins and Macros
ImageJ			http://imagej.nih.gov/ij/index.html.
ImageJ Kymograph Plugin			http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.