Azaltılmış Damlacık-yüzey etkileşiminden yararlanarak Dijital Mikroakiskan içinde Bioanalytes ulaşımı optimize etmek

Özet

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Özet

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of “lab-on-a-chip” platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.

Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.

Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

Giriş

Sıvı ile çalışan cihaz boyut küçültme "lab-on-a-chip" platformlar gelişimi için büyük önem taşımaktadır. Bu doğrultuda, son iki yıl çeşitli uygulamalar ile, Mikroakiskan alanında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. ^1-5 kapalı kanallarda (kanal Mikroakiskan) sıvı taşınması ile zıt, DMF elektrotlar diziler üzerinde damlacıklar yönetir. Bu tekniğin en cazip yararları biri sıvıları taşımak üzere hareket edebilen parçaların olmaması ve hareket anında elektrik sinyallerini kapatarak durdurulur.

Ancak, damlacık hareket evrensel bir "lab-on-a-chip" platformu için kesinlikle istenmeyen bir özellik, damlacık içeriğine bağlıdır. Proteinler ve diğer analitlerinin içeren damlacıklar kımıldamaz hale, cihaz yüzeylere sopa. Muhtemelen, bu DMF uygulamaların kapsamının genişletilmesi için önemli bir sınırlama olmuştur; ^6-8İstenmeyen yüzey tıkanmayı en aza indirmek için alternatifler, potansiyel olarak damlacık içeriğini etkileyebilecek damlacık ya da çevresi ile ilave kimyasal türlerin eklenmesini içerir.

Daha önce, bir grup ilave katkı maddeleri (alan-DW cihazlar olmadan), DMF içinde hücreleri ve proteinlerin taşınmasını sağlamak için bir cihaz geliştirdiler. ⁹ bu damlacık haddeleme çıkaran bir elemanın geometrisine sahip mum is, ¹⁰ dayalı bir yüzey birleştirilmesi ile elde edilmiştir ve daha fazla damlacık yüzey etkileşimi azaltmak, damla üstünde yukarı doğru kuvvete yol açar. Bu yaklaşımda, damlacık hareket yüzey ıslaklığı ile ilişkili değildir. ¹¹

Aşağıda tarif edilen ayrıntılı yöntemin amacı, ilave katkı maddesi olmadan proteinleri, hücreleri ve bütün organizmaları içeren damlacıkların taşıma yeteneğine sahip bir DMF cihazı üretmektir. Saha-DW cihazlar damlacık kimyager büyük ölçüde bağımsız çalışan tam kontrollü platformları için önünügelmelidir.

Burada, aynı zamanda bu simülasyonlar cihazın çalışması için gerekli yüksek gerilim rağmen gösteren, damlacık boyunca gerilim düşüşü damlacık içinde bioanalytes üzerinde ihmal edilebilir etkilere işaret, uygulanan voltajın bir küçük bir bölümünü oluşturur. Aslında, Caenorhabditis elegans (C. elegans), biyolojide çalışmaların çeşitli için kullanılan bir nematod ile ön testler, gerilimler uygulandığı gibi solucanlar rahatsız yüzmek olduğunu göstermektedir.

Protokol

NOT: Aşağıda açıklanan prosedürlerde, laboratuvar güvenlik kurallarına mutlaka uyulmalıdır. Özel öneme sahip yüksek gerilim (> 500 V) ve taşıma kimyasallar ile ilgili güvenliğidir.

Mum İs ile İletken Yüzey 1. Kaplama

1. Dikdörtgenler halinde kesilmiş bakır metal (0,5 mm kalınlığında 75 x 43 mm). , Yaklaşık 30 saniye boyunca bakır dağlayıcıda batırılarak her bakır yüzeyin temizliği yaklaşık 20 saniye musluk suyu ile yıkayın ve kağıt ile kurulayın.
   NOT: Yöntem 1 altında kullanılıyorsa, makinenin içine sığacak şekilde 75 x 25 mm boyutları değiştirin.
2. (Yaklaşık 40 mikron kalınlığında) yaklaşık olarak eşit kurum kaplama elde etmek için, 30-45 saniye boyunca bakır tabaka altında yanan parafin mum süpürün. Alev içine ~ 1 cm tabakayı tutun. Kırılgan kurum yüzeyine dokunmayın.

2. Kaplama ile Kurum Tabakasının Korunmasına

NOT: is tabakası çok kırılgan olduğunuVe korunması için kaplanabilir. İki basit alternatifleri (yöntemleri 1 ve 2) Burada önerilen, ancak daha sağlam protokoller şu anda geliştirilme aşamasındadır.

1. Yöntem 1
   1. Metal buharlaştırıcı veya püskürtme sistemine örnek yükleyin. Sistemin çalışma prosedürleri izlenerek, bölmeyi tahliye ve kurum katman (150-200 nm) üzerinde altın depozisyonu başlar. Cihazın oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
   2. Dip kaplama, kimyasal bir bölme içine 10 dakika süre ile (% 95 etanol, ACS / USP olarak% 1 h / h) 1-dodekantiol çözelti içinde metalize tabaka. Daha sonra, 60 ° ye yakın bir açı ile tutucularına, hafifçe ancak etanolün büyük damlacıklar ile yüzeyini yıkamak. Gecede, cihazlar kurumaya bırakın.
2. Yöntem 2
   1. Taban madde mum alevden sıcakken kimyasal bir kaput, derhal kurum ile kaplanmasından sonra, bir tarafında fluorlu bir miktar sıvı damlalarını bırakmak vesubstrat ve 90 ° yakın bir açıya tabakayı eğin. Daha damlalarını bırakmak ve onları tüm kurum yüzey üzerinde çevirelim.
      NOT: damlacık bir nokta üzerine düştüğünde, kurum uzakta o bölgeden yıkanmış olur. Mümkün olan fluorlu yayılmış sıvının damlacıklar kadar bildirin.
   2. Kimyasal bir kaput içerisinde sıcak bir plaka (15 dakika boyunca 160 ° C) üzerindeki alt-tabaka pişirin.
   3. Alt-tabaka kullanımdan önce gece boyunca oda sıcaklığında bekletin. Süresiz saklayın.

3. Üst Elektrotlar Fabrikasyon (Abdelgawad ark uyarlanmıştır. ¹²⁾

1. Grafik tasarım yazılımları kullanarak elektrotları çizin. Her bir elektrot 0.3 mm genişliğinde, 2 mm uzunluğunda ve elektrot arasındaki fark 0.3 mm'dir. Rehber (aşağıya bakınız, konnektörüne oturana) arasındaki boşluk 2.3 mm (Şekil 1).
2. Monarch formatında (3.87 x 7.5 inç) bir esnek bakır laminat (kalın 35 mikron) Trim. Diğer boyutları kullanın iyazıcıyla uyumlu f. Renkli yazıcının elle besleme tepsisine laminat yükleyin.
3. Bakır levha üzerine baskı yaparken, dağlama sırasında baskılı desen koruyan, bakır tabaka üzerine siyah mürekkep yoğun bir tabaka sağlamak için "zengin siyah", ya da "kayıt siyah" kullanmak için emin olun (detaylar için Abdelgawad ve ark. ¹² bakınız) olun . Gecede, tamamen basılı tabaka kurumasını bekleyin.
4. Kimyasal bir kaput içinde, (40 ° C) bakır dağlayıcıda 50 ml ile bir beher ısınmak. Beher içinde baskılı laminat Dip ve bu, hafifçe yaklaşık 10 dakika boyunca çözelti içinde sallayın. Dağlama zaman bakır dağlayıcıları çözümüne bağlıdır. Her birkaç dakikada, korozyon kontrol ve desen sağlam olup olmadığını görmek.
5. Dikkatle su ile laminat yıkayın ve kimyasal kaput aseton ve etanol ile kaplama çıkarın. Bir kez daha yıkayın ve yavaşça kağıt havlu ile laminat kurulayın.
6. Dikkatli bir GLA için elektrotlar ile laminat takmakss slayt (75 x 25 mm kalınlığı ~ 1 mm), çift taraflı bant kullanarak. Hava cepleri kaçının.
7. Bant kullanarak elektrotlara perfloroalkoksi PFA bir film takın. Bu damlacık ile elektrotların yanlışlıkla temas önlemek için hizmet eden dolayı kısa devre zararlar üst elektrotlar.

4. (Şekil 2'de devre) elektronik arabirim

1. Evrensel bir devre kartına röleleri ve kapasitörler C lehim.
2. Elektronik devreler için bir kaynaksız breadboard üzerinde 10 röle sürücüleri kalanını birleştirin.
3. Tel kumanda panosunda bir kanala her röle sürücü girişi.
4. Dikkatlice bir bağlantı yerine (Şekil 3) üst elektrotlar oturtun. Tel Şekilde gösterildiği gibi bir üst elektrot her röle sürücü çıkışı. Elektriksel gürültüyü en aza indirmek için, röleleri teller bir çift arasında bir topraklı konnektör temas olduğunu unutmayın.
   NOT: konnektör t kontrol ayarlanabilir bir platform üzerinde otururüst ve alt (kurum-kaplamalı) alt tabaka arasındaki o mesafe (0.1-0.5 mm).
5. Daha sonra 2345, 3456, vb; 0.8 sn, actuate 1234, yani hareket (yönünde 1 elektrot kayması, aynı anda 4 elektrotlara yüksek voltaj (HV) uygulama (yaklaşık 0.8 sn) için zamanlama kontrol etmek için bir programı kullanın ., 0.8 her bir grup için sn ve daha sonra geriye doğru ters yönde çok damlacık hareket de).

5. Damlacık Görselleştirme ve Taşıma

1. CCD kamera ile kombine 96x büyütme montaj - damlacık hareketini kaydetmek için, bir 24X oluşan görselleştirme sistemi kullanırlar. S-video kullanarak kameraya video kaydedici bağlayın.
2. C ihtiva eden, 4 ul damlacık Pipet kurum kaplanmış alt-tabakanın altındaki ortam elegans'da.
3. ~ Damlacık üzerinde 0.3 mm için üst elektrotlar getirin. Damlacık daha kolay işlem için, beşinci elektrotun altında ortadan yakın olmalıdır.
4. Elektronik arayüzü ve yüksek gerilim (500 V _RMS) açın ve hareket başlayana kadar damlacık üst elektrot mesafeyi ayarlayın. Üst elektrotlar damlacık dokunmasına izin vermeyin.
5. Elektrik darbeleri yanıt cihaz üzerinde başarılı damlacık transferlerin sayısını kaydederek verileri toplayın. Başarılı bir deney, en az 700 damlacık transferi ile karakterize, yani her elektrik nabız sonra bir transferi.
6. Damlacık 5-10 darbeleri yanıt artık hareket etmiyor kadar, sürekli veri toplamak.
   NOT: Yüzey aşağılamak başladığında, hareket yakın damlacık üst elektrotlar getirerek restore edilebilir.

Sonuçlar

Daha önce, DMF içinde proteinlerin hareketini sağlamak için alan-DW cihazları kullanılmıştır. Özellikle, sığır serumu albümini (BSA) ile damlacıklar daha önce başka yazarlar tarafından (katkı maddesi olmadan) rapor 2.000 kat daha yüksek bir konsantrasyonda taşınmış olabilir. Bu damlacık ve yüzey arasındaki azaltılmış etkileşim nedeniyle oldu; Şekil 4 (. Bakınız Freire ve ark ⁹ deneyler hakkında daha fazla bilgi için) floresan etiketli BSA ...

Tartışmalar

Protokolün en önemli nokta doğrudan damlacıkları hareketli başarı ile ilişkili kurum tabakanın korumasıdır. Kurum katmanı (yukarıdaki yöntem 1) metallenmesi fabrikasyon başarı% 100'e yakın verir. Bununla birlikte, maksimum işletim süresi yaklaşık 10 dakikadır; muhtemelen, damlacık fraksiyonlar metal katmandaki delikler içinden kurum ıslatma edilir. Florlu sıvı ile kurum tabakayla kaplanması kolay ve hızlı bir alternatif olduğunu ve en az kaynak gerektirir, ancak fabrikasyon yüzeylerde...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4