In vivo ve in vitro Entomopatojenik Nematodlar Yetiştiriciliğinin olarak (Steinernematidae ve Heterohabditidae)

Özet

Bu sunumun amacı in vivo ve entomopatojen nematodların yetiştirmesi için in vitro teknikleri göstermektir., In vitro yöntemler zengin ağar medya kullanmak ise in vivo yöntemler, bir böceğin bu nematodların yetiştirme düşünün.

Özet

Photorhabdus heterorhabditids arasında simbiont ise entomopatojenik nematod (EPN) (Steinernematidae ve Heterorhabditidae) Enterobacteriaceae. Ksenorhabdus bakteri steinernematids nematodlar ile ilişkili aile, Gram-negatif Gamma Proteobacteria bir Mutualistik ortaklık var. Birlikte nematodlar ve bakteriler, bir yakın ve belirli ortak olarak böcek türlerinin geniş bir yelpazede öldüren da güçlü bir insektisid kompleksi oluşturur. Bu yazıda, in vivo ve yaygın laboratuar koşullarında bu nematodlarının yetiştirilmesinde kullanılan in vitro teknikler göstermektedir. Dahası, bu teknikler EPN'dir kültürlerin başarılı kurulması için önemli adımlar temsil ve ayrıca araştırma bu organizmaları kullanan diğer biyoanalizlerin için temelini oluşturur. Aposymbiotic (symbiont-serbest) nematod üretim genellikle ortak yaşam çalışmaya derinlemesine bir ve çok yönlü bir yaklaşım için önemlidir. BuProtokol antibiyotik eklenmesini gerektirmez ve standart laboratuar ekipmanı ile kısa bir miktarda yapılabilir. Muhafaza açısından hayatta kalma kullanılan türlere bağlı olarak değişebilir, ancak bu şekilde üretilen Nematodlar nispeten sağlamdır. Bu sunumda ayrıntılı teknikler P. Hazır Laboratuvarı, Arizona Üniversitesi (Tucson, AZ, ABD) çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.

Giriş

Entomopatojenik nematodlar (EPN) Steinernema ve Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterohabditidae) ve bakteriyel simbiont, Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp (Enterobacteriaceae) karasal hayvan-mikrop simbiyotik ilişkiler ^2-4,6,10,19. Ksenorhabdus ve Fotorhabdus spp acil bir model olarak kabul edilir. Ayrıca, enfeksiyon juvenil (IJ) veya ^3. aşamasında genç ^8,10,13 infektif olarak bilinen nematodların sadece serbest yaşayan aşamasının bağırsakta simbiont olarak harbored. Bakteri-nematod çifti böceklerin geniş bir yelpazede için patojen olduğunu ve başarılı biyolojik kontrol ve entegre zararlı yönetimi programlarında, dünya çapında ^6,8 uygulamaya konmuştur.

Bu yazıda in vivo ve sık sık laboratuar koşullarında EPN beslenmesinde icra in vitro teknikleri bir seçim göstermektedir. Iin vivo koşullarda yöntem nematodların yetiştirmesi için bir böcek ev sahibi tasarlamaktadırlar. Genellikle, çeşitli böcek emir (yani Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, vb.) Olgunlaşmamış aşamaları uygun ana olarak kabul edilir. Yöntemler genellikle laboratuvarda nematod kültürlerin bakım için kabul edilir in vivo. Nematodların seri üretim söz konusu olduğunda, bu yöntem uygun olmayabilir. Haşere büyük miktarlarda daha fazla zaman ve böcek yetiştirme ile ilgili ek bir maliyet gerektiren bu amaç için gerekli olabilir.

Entomopatojenik nematodlar da çeşitli medya üzerinde in vitro kültür edilebilir. Çalışmanın amacına bağlı olarak; in vitro yöntemler medyada simbiyotik bakterilerin katılmasını düşünebilirsiniz ya. Bu sunumda, EPN yayılması için iki yaygın kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. Medyanın maddeler simbiyotik bakteri a için besin kaynağı sağlamaknd nematod için bir sterol kaynağı. in vitro yöntemler bir böcek konak olmadan Advantage EPN bir yetiştirme sunuyoruz.

Uygun böcek ana mevcut olmadığında Başlangıçta, gelişmiş in vitro ortam maddesinin bir çok EPN çoğalması için kullanılmıştır. Ancak, son yıllarda, in vitro yetiştirme yöntemleri yaygın olarak EPN ve simbiyotik bakteriler ^17,19 arasındaki Mutualistik ilişkiyi anlamak amacıyla araştırma istihdam haline gelmiştir.

Bu sunumda ayrıntılı teknikler Stock Laboratuvarı, Arizona (Tucson, AZ, ABD) Üniversitesi tarafından çeşitli yazarlar tarafından açıklanan ve rafine karşılık gelir. Bu teknikler, haşere yönetimi için, bu organizmaların seri üretiminde kullanılan tekniklerin gövdesinden ayrıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Onların Symboitic Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 1. in vivo Yetiştiriciliği

1. 100 x 15 mm'lik bir plastik Petri kabı ters çevirin ve çanak kapakta filtre kağıdı (90 mm) iki diskler yerleştirin.
2. Eşit olarak, filtre kağıdı üzerinde (1.000-2.000 IJ / ml 'lik bir konsantrasyonda), IJ (infektif çocuklar) su süspansiyonundan 1 ml dağıtın.
   Not: IJs yüzeyi sterilize edilmiş olması gerekmez.
3. Çanak daha waxmoth Galleria mellonella 10 son dönem larvaları ekleyin. Hedefi, yaklaşık 100-200 IJs / larva sağlamaktır.
4. Petri kabı (Şekil 1) alt kısmı ile kapağı kapalı Petri etiketleyin. Aşağıdaki bilgileri Mansiyon: nematod türlerinin adı (biliniyorsa); kodu / atama izole; tarih enfeksiyon tuzak kuruldu.
5. Bir gevşek şekilde kapalı plastik bir torba içine tabağına yerleştirin (nem muhafaza etmek için) ve ya oda sıcaklığında ya da 20-25 ° C arasında bir kuluçka makinesi içinde karanlıkta tutun. Günlük yemekler edin
   NOT: topraktaki doğal enfeksiyon koşullarını taklit Darkness, nematod enfeksiyonu kolaylaştırır.
6. 3-5 gün sonra, modifiye Beyaz tuzak ⁷ nematod enfeksiyon belirtileri ile kadavra çıkarın.
   NOT: kadavra çürük kokusu varsa, bu kültür başarılı değildi ve / veya kirlenme olduğunu bir göstergesi olabilir. Nematod ve böcekler yeni bir parti ile yeni bir enfeksiyon odasını ayarlayın.

Onların Simbiyotik Bakteriler Entomopatojenik Nematodlar 2. in vitro Yetiştiriciliği

1. Karaciğer-böbrek Agar Yöntemi ^9,19
   1. Küçük parçalar (2 ^cm3 veya küçük) olarak karaciğer ve böbrek doğranır ve NaCl, ağar bir karıştırıcı içine koyun ve 300 ml su ve sıvı et hamuru, kalın bir macun veya püre haline gelene kadar karıştırılır. Daha sonra, 1 litrelik bir Erlenmeyer şişesine karışımı aktarın.
   2. Blender kabına suyun nihai 200 ml ilave edilir ve herhangi bir geri kalan ortam süzünBir Erlenmeyer şişesi. 121 ° C'de 15 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. Izin Otoklavlamadan sonra ağar dökülmeden önce dokunmak soğumaya.
      NOT: Bu orta et parçalarını sahip olma eğilimi gösterir, çünkü orta Pipetleme tavsiye edilmez.
   3. Elle ya da karıştırma ile Erleni dönen daha homojen bir ortam dökülür, 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine agarı ~ 20 ml dökün. Kadar gerekli ağar 4 ° C'de katılaşır ve mağaza yemekleri izin ver
      NOT: Etin Petri kabı içine dökülmüş herhangi bir büyük parçalarını kırmak için bir alev sterilize metal bir spatula kullanın.
2. Lipit ^9,19 ağar yöntemi
   1. Besleyici et suyu, agar ve maya özütü karıştırılarak bir yağ agar ortamı hazırlamak ve 2 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içine karıştırmak dökün. 121 ° C'de 15 dakika boyunca _H2O ve _MgCl2 • 6H ₂ O ve otoklav damıtılmış ekleyin.
   2. Mısır yağı ve mısır şurubu karışımı steril karışımı eklenir ve eşit bir şekilde dağıtmak için yağ damlacıklarını, genellikle ya kuvvetli bir şekilde karıştırıldı ve girdap.
      Not: UV çapraz bağlayıcı olarak gerekli hacmi koyarak mısır yağı ve şurubu sterilize edin. Yağ sıvı içine çözülür, ama bu küçük damlacıklar olduğundan emin olun olmayacaktır.
   3. 5 (veya 6) cm Petri kapları üzerine ~ 20 mi agar dökün ve ihtiyaç duyulacak zamana kadar ağar, 4 ° C'de katılaşmaya ve mağaza yemekler için izin verir.
   4. Şerit lipid agar plakası üzerinde simbiyotik bakteriler, istenen ve 24-48 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
      NOT: gecede (12-16 saat) LB altkültür 100-200 ul yayıldı.
   5. Bir gün sonra, yaklaşık olarak 0.4 mi yüzeyi sterilize nematod süspansiyonuna (yumurta ya da infektif juvenil) ekleyin ve karanlıkta ve 22 ± 3 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde, oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: nematod büyüme olumsuz bir aşırı ıslak ortam oluşturmak gibi nematod süspansiyonun fazla 0,4 ml katmayın.
   6. Günlük kültürleri izleyin. Kültürler yaklaşık 12 gün (Şekil 2) Ijs yeni nesil üretmek gerekir.
   7. Nematodlar, modifiye edilmiş beyaz yakalamak için çanak (Şekil 3A) yanlarını tarama görüldüğünde agar ile alt çanak aktarın IJs (Şekil 3B) toplanması için (Orozco ve arkadaşları. ^12). Ortamın kirlenmesini azaltmak için bir laminar akış başlığı altındaki bu adımı gerçekleştirin.
   8. Ortaya çıkması üzerine modifiye Beyaz tuzak Ijs toplayın ve herhangi bir ortamda enkaz kaldırmak için IJ süspansiyon durulayın. Deposu (soğuk ısı enkübatör ya da soğuk bir odada), 10 ° C'de steril damıtılmış su içinde, IJ ya da gerektiğinde, hemen kullanın.
      NOT: Araştırmanın amacına bağlı olarak, ya symbiont-kolonize veya aposymbiotic nematodlarla plakaları tohum.

3. in vitro Aposymbiotic arasında Yetiştirme (Symbiont-serbest) Entomopatojenik Nematodlar

1. 10-20 G. bulaştırmak İstediğiniz nematod türlerinin Ijs ile mellonella larvaları (bakınız bölüm 1). 3 veya 4 gün sonra (bu zamanda IJs olgunlaştı gerekirdiBirinci nesil yetişkinlere) kadavra toplar.
   NOT: vade ve türe göre değişir yumurta yeterli sayıda elde etmek için gerekli kadın sayısına zamanı. Daha fazla G. bulaştırmak Mellonella gerekirse larva ve erken onlar doğru gelişim aşamasında olup olmadığını değerlendirmek için 48 saat sonrası enfeksiyon gibi diseksiyonu başlar.
2. Tuzlu su çözeltisi (M9 tampon ¹⁸⁾ ile bir Petri kabı içinde tek tek her bir kadavradan yerleştirin. Bir ince uçlu forseps ile başını çekerek bir kadavra ayır.
3. (Tercihen L-şekil) ince bir iğne ile kadın (iç yumurta) en az 20 Hastaların gravida toplayın ve M9 tampon (Şekil 4A) 10 ml içeren bir saat camı koyun.
4. Aşağıdaki maddeleri göz önüne alınarak, bir çözelti hazırlayın axenizing: damıtılmış su 6.75 ml, 1.25 mi, 5 N NaOH ve 2.25 ml ticari olarak temin edilebilen ağartma çözeltisi,% 3 hipoklorit seyreltilmiştir.
   NOT: NaOH çözüm eldiven, gözlük, temel ve koruyucu uygun diğer birkıyafetleri giyilmelidir.
   Not: ağartma ışık ayrıştığından taze axenizing çözüme her hazırlayın. Axenizing çözümün birkaç toplu hazırlayın ve birden izle gözlük yumurta yüzey sterilizasyonu ve istihsalinde.
5. M9 tampon tampon çözelti ile izlemek cam dolduran ve bir pipet ile tampon yalakalık kadınlarda en az üç kez durulayın. Kadın saat camı kalır emin olun. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
6. Hemen axenizing bir çözeltisi eklenmekte ve dişi 10-15 dakika fazla bu çözelti içinde kalmasını sağlar. (Axenizing çözeltisine dayanıklı olan) yumurta sağlam kalırken parçalanmaya başlıyor nematod dokuları gözlemleyin.
7. Manuel bir iğne veya bisturi (Şekil 4B, C) ​​ile keserek, süreci hızlandırmak için kadın bedenlerini bozabilir. , Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine pipetle çözülmemiş her türlü doku ekleyerek kaçınarak yumurta çıkarın.
   NOT: m olarak kullanHerhangi bir mikrosantrifüj tüpleri gerekli yumurta toplamak için ve yumurtaların yaşama kabiliyetini axenizing çözeltisine maruz uzun bir süre boyunca azalacak şekilde, hızlı bir şekilde çalışır.
8. "Yüksek hız ayarını" kullanılarak 15 sn vorteks tüpler daha yumurta bağlı nematod dokuları kaldırmak için. Bir girdap kullanılamaz Alternatif olarak, eğer pipetlemeyin yukarı ve çözüm birkaç kez aşağı.
9. Yaklaşık 18.000 g 2 dakika boyunca santrifüj ile pelet yumurta. Yumurta yeterince pelet yapmazsan hızını artırın. Axenizing çözeltisini çıkarın ve 1 dakika boyunca 900 x g hızında steril damıtılmış su ve santrifüj ile bir kez daha mikrosantrifüj tüpü doldurmak suretiyle iki kez yıkayın.
10. Son yıkamadan sonra, steril damıtılmış su içinde 300-500 ul yumurta tekrar süspansiyon ve steril 3 cm Petri için veya steril saat camı yerleştirin. Yumurta şimdi yüzey sterilize olduğunu unutmayın, bu yüzden yumurta temizliğini korumak için steril pipetler ve / veya pippetter ipuçları ve su kullanın.
11. Onlar (Şekil 4D) sağlam olduğunu doğrulamak için bir mikroskop (30-50X büyütme) altında yumurta incelemek ve karaciğer-böbrek agar ile 5 cm plaka aktarabilirsiniz (bakınız bölüm 2.1)
    NOT: Agar aşırı ıslak yapacak gibi plakalar üzerinde yumurta süspansiyon fazla 400 ul ekleyin etmeyin.
12. Ilgili bilgileri etiket plakaları ve 28 ° C'de karanlıkta dik saklayın. Yumurta Kuluçka belirgin bir gece boyunca olmalıdır.
    NOT: Su çanak kapağı üzerine yoğunlaşabilir ancak 1 ya da 2 gün sonra buharlaşır. Şu anda, agarı nem tutma ve kurumayı önlemek için bir plastik torba içinde koyunuz.
13. Periyodik yemekleri gözlemleyin ve mantar veya bakteriyel kontaminasyon belirtisi gösteren herhangi yemekleri atın. IJs Petri kabı duvar göç görülmektedir sonra, kapağı çıkarın ve modifiye Beyaz tuzak ¹² ağar ile alt çanak aktarın. Modifie içine çanak aktarırken steril koşullarını dikkated Beyaz tuzak maruz medyanın kirlenmesini önlemek için.
14. Gerektiği gibi Beyaz Tuzakları ve hasat IJ izlemeye devam.
    NOT: Aposymbiotic nematod birçok gün ve hatta hafta Beyaz tuzak suya göç devam edecektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

In vivo yetiştirme yöntemi nematod büyüme ve üreme için ev sahibi olarak canlı böcekleri kullanır. Enfeksiyon odaları böcekler Ijs sergilemek için etkili bir yöntemdir. Bu, başka bir böcek ev sahibi hücresi, bakteriyel vektörleri symbionts nematodlara yaşam döngüsünün tek bir aşamadır. 1 bir enfeksiyon bölmesi hem de bu bölme oluşturmak için gereken malzemeler için ayarlanmış göstermektedir. In vitro yetiştirme yöntemleri sağlar EPN B...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Uygun bir ana bilgisayar kullanarak EPN in vivo yetiştirilmesinde başarılı bir anahtar faktördür. Genellikle, hem steinernematids ve heterorhabditids üretebileceği ve başarıyla büyük bal mumu güvesi Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) larvaları onların yaşam döngüsünü tamamlamak. Ancak, farklı aileleri ve / veya siparişlerin diğer böcek türleri olarak kabul edilebilir. Güncel olarak nematod türlerinin bir kaç özel bir böcek ev sahibi hücresi için özgüllüğe s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
For In vivo Infections
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Filter paper, 9 cm grade 1 cellulose	Whatman/VWR	28450-081	Grade 1 filter paper recommended
Insect hosts	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	Galleria mellonella are recommended
For Liver-kidney Agar (for 500 ml)
60 x 15 mm Petri dishes	VWR	25384-092
Beef liver, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Beef kidney, 50 g	Locally sourced; butcher or supermarket		Remaining may be stored frozen and thawed for future use
Sodium chloride 2.5 g (0.5% final concentration)	Acros/VWR	200002-434	any research grade NaCl can be used
Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
500 ml distilled H2O
For Lipid Agar (for 1 L)
100 x 15 Petri dishes	VWR	25384-088
Nutrient broth, 8 g	BD/VWR	90002-660
Yeast extract, 5 g	EMD/VWR	EM1.03753.0500
Magnesium chloride hexahydrate 10 ml (0.2 g/ml)	EMD/VWR	EM-MX0045-1
Corn oil, 4 ml	Any brand	Locally source; supermarket	Any brand of corn oil can be used
Corn syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H2O and swirl for homogeneity	Karo	Locally sourced; supermarket
Agar, 15 g	HiMedia/VWR	95026-642	any media grade agar can be used
Distilled H2O, 890 ml