Deneysel Servikal Spinal Kord Yaralanmalarında Sinir Öncü Hücreler ve Öz-montaj Peptitler sinerjik Kullanımı

Özet

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

Özet

Omurilik yaralanmaları (SKY) hastalar ve aileleri için ciddi nörolojik bozukluk ve, psikolojik, ekonomik, ve sosyal sonuçlara neden. Klinik, SCI fazla% 50 servikal omurga ¹ etkiler. Birincil yaralanma sonucu olarak, enflamasyon, apoptoz, ve demiyelinasyon dahil olmak üzere ikincil mekanizmaların bir kademeli sonunda intramedüler kavite ^2,3 doku yara ve gelişmesine yol meydana gelir. Her iki hücre nakli, entegrasyon ve yenilenme fiziksel ve kimyasal engelleri temsil eder. Bu nedenle, inhibitör ortamı şekillendirme ve hücre transplantasyonu ve yenilenme için bir destekleyici ortam yaratmak için boşluklar köprü umut verici bir tedavi hedefi ^4. Burada, bir anevrizma klibi ile servikal SKY bir ezilme / sıkıştırma modeli tarif edilmektedir. Tam transeksiyonu veya kordonun yırtılmalar nadirdir çünkü bu model, daha klinik açıdan diğer deneysel modellere daha. Ayrıca compariso içindeÖzellikle hasar Sırt taraf sütunlar, omurilik çevresel sıkıştırma avantajlı görünen ağırlık damla modeli, n. Klip kapanma gücü ve süresi farklı yaralanma şiddetini elde etmek için ayarlanabilir. Bir halka yay hassas kalibrasyon ve klip kuvvet süreklilik kolaylaştırır. Fizyolojik koşullar altında, sentetik kendinden montaj peptitler (SAP) nanoliflerden halinde kendi kendine birleşebilen ve böylece, SCI ⁵ uygulama için hitap etmektedir. Onlar kord hasarı minimize lezyon içine doğrudan enjekte edilebilir. SAP intramedüller boşlukları köprü ve böylece, rejeneratif tedaviler için hasarlı kablosunu donatmak için iskele kurulması biyouyumlu yapılardır. K2 (QL) (QL6), diğer peptidler ile karşılaştırıldığında Dong et l. ⁶ tarafından tanıtılan yeni SAP olduğunu, QL6, ⁶ .14 gün SKY sonrası nötr pH β-tabakalar halinde 6K2 kendine araya akut evre, SAP'lerin sonra lezyon ve nöral öncü hücreler (NPC) merkezine enjekte edilir Inje vardırbitişik sırt sütunlara cted. Hücre yaşamını desteklemek amacıyla, transplantasyon, 7 gün boyunca ozmotik mikro pompa, büyüme faktörlerinin sürekli subdural tatbikat ile bir araya getirilmektedir.

Giriş

Spinal kord yaralanmalarının% 50'den fazlası servikal omurga ile ilişkilidir. Klinik olarak iki ana patofizyolojik mekanizma tanımlanmıştır ayarı: initial omurilik ezilme ve kemik kırıkları, kanamalar veya doku şişmesi nedeniyle sürekli sıkıştırma.

anevrizma klibi kontüzyonu / sıkıştırma modeli taklit hem patofizyolojik mekanizmalar: klibi yakalamaya Bir ezilme üretir ve kırpma süresi, kemik kırıkları, kanamalar veya doku neden olduğu klinik ortamlarda sıkıştırma son önemli uzun şişme olduğunu yemeden, sıkıştırma bileşeni temsil eder. kullanılan anevrizma klibi kesin ve tekrarlanabilir kırpma kuvveti garanti altına alan bir halka yay ile değiştirilir. Özellikle yarı-kesisi veya kontüzyon modeli, bu anevrizma klibi modeli taklit iyi klinik ortamlarda göre. Toraks yaralanması olan hastalar servikal inj ile parapleji, hastaların çoğunda muzdarip ikenuries tetraplejik ve tamamen bağımlıdır. servikal kord anatomik yapısı, ancak, göğüs veya lomber kıyasla önemli farklılıklar gösterir ve bu nedenle, bu protokolde özellikle ele almaktadır.

intramedüller boşlukların ve doku skar gelişimi kurtarma ve rejenerasyon için engellerdir. Bu engelleri iskele malzemesinin kullanımını aşmak için umut verici bir yaklaşımdır. Kendi toplanan peptidler lezyon üssü doğrudan enjekte edilebilir. Orada boşluğu köprüleme nano-lif iskeleleri içine monte ve inflamasyon ve doku korkutuyorsun azaltarak inhibitör ortamını iyileştirmek. Katı maddeler, implantasyon esnasında omurilik önemli hasara neden olsa da, akışkan peptidler ve güvenli bir ek ağır zarar vermeden enjekte edilebilir.

Kök hücre nakli öncesinde kendinden montaj peptitler ile inhibitör çevrenin iyileştirilmesi, dolayısıyla, hücre destek integration, servikal spinal kord yaralanması sonrası farklılaşma ve nihayet, fonksiyonel iyileşme.

Protokol

NOT: Aşağıdaki deneysel protokol Üniversitesi Sağlık Ağı (Toronto, Kanada) hayvan bakımı komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve hayvan bakım Kanadalı konseyi tarafından hazırlanan deney hayvanlarının kullanımı kılavuzda oluşturulan politikalar doğrultusunda dir .

1. Servikal Anevrizma Klip Kontüzyon / Sıkıştırma Modeli

1. Cerrahi otoklav cihazları ve% 70 alkol banyosunda aletleri koyarak tüm surgcial prosedür sırasında steril koşullar tutun önce.
2. (1: 1) bir oksijen kombinasyonu (O _2), azot oksit _(N2 O), Wistar sıçanları (250-270 g), uyuşturan ve 1.8-2.2% İzofluran ve bir gaz anestezi ekranı üzerinden spontan solunum desteği. Anestezinin indüksiyonu için 1 dakika için,% 5 İzofluran ile başlar ve daha sonra azaltır. Bir acı uyaran (örneğin. Pençeleri at) vererek cerrahi, anestezi derinliği kontrolü başlamadan önce. Yağlı merhemler Uygulagözlerde kuruluk önlemek için ve sonraki enfeksiyonları önlemek için.
3. Bir ısıtma yastık (37 ° C) üzerine sıçan koyun ve bir stereotaktik çerçevenin içine kafasını düzeltin.
4. Servikal omurga etrafında cerrahi bölgeyi Tıraş ve povidon iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin.
5. Torasik vertebra gövde 2 (T2) belirgin processus ulaşan servikal vertebra (C2) den omurga üzerinde bir orta hat kesi yapmak.
6. Doğrudan orta hat üzerinde vertebra kasların dış tabakası kesti bir kranyokaudal yönde (kanamayı önlemek için) ve daha ileri processus spinosus ve laminalar ulaşana kadar dobra dobra derin kas katmanları incelemek. Ekartörleri yerleştirin.
7. Laminektomi için hedeflenen seviyelere gözlemlemek için vertebra gövdesi T2 belirgin prosesus spinosus yönlendirmek. Kimlik ve seçilen lamina mikro-cerrahi hazırlıktan sonra, laminalar ve processus spinosus gevşetmek için ligamenti flavae kesti. Son olarak, Comuriliğe bir kemik kesme yanal ile lamina ile ut ve omurilik kendisi herhangi bir sıkıştırma kaçınarak, yavaşça o çıkarın.
   NOT: En yaygın seviyeleri C5 / 6, C6 / 7 veya C7 / T1 vardır. perioperatif mortalite oranı yaralanma seviyesi rostral daha artar. Paravertebral venöz sinüs kanama yaygındır ve sünger ile dikkatli sıkıştırma ile ele alınabilir.
8. Kablosunu travmatize klibi takmadan önce, (özellikle seviye C5 / 6) kırpma onları yedek sinir köklerini ortaya çıkan tespit.
9. Pürüzsüz klip indüksiyon sağlamak amacıyla, bir kanca ile vertebralarda dorsal tarafına ventral dura gevşetin ve klip için bir koridor hazırlamak.
10. Son olarak, açık klibi eklemek ve bir kafa travması ulaşmak için kapattı (hızlı kapatma) ek verelim. Klip kapanma gücü ve klip kapatma süresi travmanın şiddetini ve sıkıştırma derecesini belirler. Yaygın olarak kullanılan 15-35 g ve clippi arasında klip kuvvetleri vardırörneğin 1 dakika ng süresi. (Şekil 1).
11. Klibin uzaklaştırılmasından sonra, 2 kat kasları adapte yarayı kapatmak.
12. Anestezi durdurun ve sternum yatma için yeterli bilince kavuşur kadar sürekli gözlem altında hayvan uyandırma izin. Son olarak, bir tek kafese koymak sıçan ve post-operatif tedavi yönergeleri izleyin.
13. Hayvanlar yaralanma bu tip şiddeti ile mücadele olduğundan, ameliyat sonrası tedavilere özel dikkat gerekir:
    1. (3 gün ve 5 gün, sırasıyla ve klinik semptomlara göre için Buprenorphine ve meloksikamın) ağrı kesiciler yönetme.
    2. 3 gün için ek tuz çözeltisi deri altına vermek (günde 2 kez 5-10 mililitre (mi)).
    3. 2 gün önce içme suyu antibiyotik sağlayın ve 7 gün sonrası ameliyat kadar (örn moksifloksasin)
    4. Mesane fonksiyon kurtarma sabit oluncaya kadar Mesaneyi günde 2-3 kez sıkınly belirgin.
    5. Bir günde en az bir kez nörolojik açıkları ve işletilen hayvanların fizyolojik durumunu gözlemlemek.

2. (14 gün yaralanma sonrası) SAP'larını ve NPC enjekte

1. 1.1 açıklandığı gibi anestezi neden olur. 1.3, bir stereotaktik çerçeve içinde sıçan başını düzeltmek dikiş veya yara klipleri kaldırmak ve yara ve povidon iyot ve% 70 alkol ile cerrahi alan dezenfekte edin.
2. Dikkatle, Ekartörleri eklemek, paravertebral kaslar teşrih dura gelen mikroskobik skar dokusu kaldırmak ve lezyon sitesini yeniden maruz.
3. % 1 bir konsantrasyonda SAP'larını hazırlanması (a / h) bir hücre dışı matris jel yapmak. QL6 SAP'ler fizyolojik olarak uyumlu bir pH değerine sahip ve enjeksiyondan önce tamponlanmalıdır gerek yoktur. Omurilikte SAP'lerin görselleştirme için, QL6 (QL6-FITC) bir floresan türevini kullanın.
4. 2 porsiyon, her dağıtılan lezyonun merkezine içine SAP (5 mikrolitre (ul) enjekteOrta hat 2.5 ul ikili. Bir mikro cam kapiller (100 mikrometre (mikron) dış çapı (OD)) ile stereotaktik çerçeve bağlı bir Hamilton şırınga kullanın. Keskin bir iğne ucu ile dikkatlice dura açın ve travmatize omuriliğe cam kılcal stereotaktik 2 milimetre (mm) takın.
5. Hacim 1/3 enjekte ettikten sonra, 1,5 mm derinliğe kadar iğne kaldırmak ve sonra daha 1/3 1 mm. Tüm hacminin enjekte edildikten sonra ve şırınga uzaklaştırılmasından önce, jel oluşumu stabilize etmek için 5 dakika bekleyin.
6. NPC oluşturmak için, yetişkin farelerin DsRed (ya da, yeşil YFP pozitif fareler) kullanın ve izole ve paraventrical bölge ^4,18,21 onları yetiştirmek.
7. Hücre süspansiyonu 90% canlı hücrelerin ~ varlığını gösteren Tripan Mavi boyama ile NPC canlılığını değerlendirmek. Büyüme ortamı (50 x 103 canlı hücre / ul) hücreleri seyreltin ve daha sonra hücre nakli için bunları kullanın.
8. Dört 2 ul olun (8 ul toplam volume, 2 mm rostral ve yaralanma yerinde kaudal de bilateral 4 x 10 ⁵ NPC) İntraspinal enjeksiyonları içeren. Dura açılışından sonra, Hamilton mikro cam kapiller omurilik dorsal yüzeyinin altında 1.5 mm eklemek ve hücre süspansiyonu 2 ul enjekte. Yaklaşık 0.5 ul / dk (dk) bir enjeksiyon hızı seçin.
9. Her bir enjeksiyonun ve kordon üzerinden kılcal uzaklaştırılmasından önce sonunda, yeni hücre hacmine uygun olarak uzanan en az 1 dakika sağlayan doku bekleyin. (Şekil 2)

Subdural 3. implantasyonu Büyüme Faktörü Uygulama için pompalar

1. Hücre yaşamını destekleyen bir büyüme faktörü olan beyin omurilik sıvısı (CSF) zenginleştirmek için, 0.5 ul / saat arasında bir seyreltme oranı, 0.04 kateter çapa sahip olan, 7-14 gün boyunca, alt-durally büyüme faktörleri seyreltilmesi mikro-ozmotik pompalar kullanımı cm OD, 100 ul bir hazne hacmi.
2. Tercih büyüme faktörleri seçin(Örneğin, beyin türevi büyüme faktörü (BDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF)), pompa 6-10 saat önce implantasyonu dolgu ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde pompalar dengeye getirin.
3. Hemen NPC enjeksiyondan sonra, pompayı yerleştirmek için bir deri altı girinti hazırlamak. Tercih yerleri pompa kendisinin neden büyük yerel rahatsızlık kaçınarak torakoskopik karın bölgesi lateral kenarlar vardır.
4. Büyüme faktörlerinin en yüksek konsantrasyonu elde etmek için, kateterin açık ucu lezyon yerinde yakın biter emin olun. Bu nedenle, komşu üst veya alt düzey bir konteyner-laminektomi gerçekleştirmek. SCI C7 / T1 ise, örneğin, C5 küçük bir laminektomi gerçekleştirmek.
5. , Deri altı oyuk içine pompayı koymak gerekli uzunlukta kateter kısaltmak, ve herhangi bir hareket-ilişkili çıkık kaçınarak paravertebral kaslar birkaç dikişlerle (6.0) ile sabitleyin.
6. Sivri uçlu (C5, örneğin) dura açtıktan sonraBir iğne, subdural uzaya kateter tanıtmak ve herhangi bir direnişle karşılaşmadan ve kablosunu zarar vermeden bir kuyruk yönde kayma sağlar. Örneğin C6 Atlanan lamina kateter tespit ve istikrar gibi ek noktasını vermektedir.
7. Kateter sorunsuz çalışır ve pas olmadığından emin olun.
8. Dikişler ya da klips ile yakın bir tabaka ile kas ve deri. (Şekil 3)
9. Anestezi durdurun ve sternum yatma için yeterli bilince kavuşur kadar sürekli gözlem altında hayvan uyandırma izin. Son olarak, bir tek kafese onları geri koydu ve post-operatif tedavi yönergeleri izleyin.
10. Olsa bile, hayvanlar bu zaman noktasında kısmen kurtarıldı olabilir, özel ameliyat sonrası tedavi sağlayın:
    1. (3 gün ve 5 gün, sırasıyla ve klinik semptomlara göre için Buprenorthine ve meloksikamın) ağrı kesiciler yönetme.
    2. 2 gün önce kadar su şişeleri antibiyotik sağlayın7 gün ameliyat sonrası (örn moksifloksasin).
    3. Gerekli eğer hala, mesane sıkma devam edin.
    4. Sıçanlar susuz görünürse, ek deri altı sıvıları verin.
    5. Bir günde en az bir kez çalıştırılan hayvanların nörolojik fonksiyonu ve fizyolojik durumunu gözlemleyerek tutun.
    6. 2 gün önce NPC enjeksiyon immünosupresyon tedavisi yönetme ve 7 gün sonrası transplanation (minosiklin) ve kurban kadar (Sandimmune) kadar sırasıyla.

4. Doku Değerlendirmesi

1. Gözlem süresi sonunda (örn., Omurilik yaralanması sonrasında 4 hafta) derin anestezi (% 5 İzofluran 2-3 dakika için) olarak hayvanların kurban ve 4, soğuk ve 150 ml, 50 ml soğuk (4 ° C), tuzlu su ile transkardiyal bunları serpmek 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% paraformaldehid.
2. Omurilik çıkarın ve 24 saat süre ile, 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehid içinde koydu.
3. 48 saat boyunca donmaya karşı koruma sağlamak için,% 25 sükroz solüsyonunda omurilik koyun.
4. <30 um bir kalınlığa sahip uzunlamasına cryosections sağlar.
5. Bir arka plan kullanım DAPI (: 1,000 1) sağlayan tüm hücre çekirdekleri immünohistokimyasal boyama için. DsRed pozitif NPC kırmızı görünür, QL-6 FITC yeşil görünür, hem de böylece özel lekeli olması gerekmez. (Şekil 4).
6. Tarama elektron mikroskopi (SEM) için örnekler, 2 saat süre ile 4 ° C 'de, glutaraldehid emmek 5 dakika boyunca etanol,% 10 artış adımda yavaş yavaş bunları kurutmak ve 1 saat boyunca basınçlı bir sıvı _CO2 sifon koyun sağlar. Bir püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak altın ile kaplayın iskelelerinin. Hitachi S-3400N taramalı elektron mikroskobu görüntüleri çekin. (Şekil 5)

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen prosedür gerçekleştirirken,. SAP iskele boşluğu köprü ve önleyici bir ortamının iyileştirilmesi, daha az doku korkuturuz NPC sağkalımda bir artış sağlar elde Şekil 4 olacak elde edilen bir sıçan omurilik bir uzunlamasına kesitini göstermektedir yaralanma sitesi SKY sonrası 6 hafta ve QL6 SAP enjeksiyonu ve NPC transplantasyon sonrası 4 hafta. QL6 peptidler başarıyla merkez üssü toplu, kordon içine enjekte ve yarı gölge postero-kaudal dağınık ...

Tartışmalar

Bu protokol sıçanlarda bir servikal yaralanma modeli gerçekleştirmek için okuyucu sağlamak ve servikal SKY sonrası daha iyi iyileşme teşvik SAP'lerin ve NPC ile kombine tedavi yaklaşımı kullanmak için geliştirilmiştir.

Özellikle böyle (hemi) -transection modeli veya kilo düşüşü ve sarsıntı modelleri, klip kontüzyonu / sıkıştırma modeli büyük patofizyolojik travma mekanizmaları hem temsil gibi diğer servikal travma modelleri, göre - ezilme ve basınç ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysmal clip	SharpTech
Surgical microscope	Leica
Micro injection system	World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments
Hamilton syringe	Hamilton company
Subdural pumps	Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument	Fine Science tools
Isoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP	Baxter
7.5% Povidone iodine	Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0.4% Trypan blue	Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)	Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF)	Sigma