T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Özet

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Özet

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Giriş

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.¹ This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.² The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells³ with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models⁵ and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.⁶ The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.⁷ We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos⁸ and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.⁹ We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Protokol

Kültür Medya, Sitokinlerle ve Jelleşmiş Plakaların 1. Hazırlık

1. Yüksek glikoz ve sodyum piruvat ile Eagle Medium (DMEM) içinde Dulbecco modifikasyonu kullanılarak bir ES hücre ortamı hazırlayın. % 1 HEPES Tamponu,% 1 non-essential amino aist,% 0.1 gentamisin (50 mg / ml) ve% 0.1 (Fetal Sığır Serumu (FBS) Kalifiye% 20 ESC,% 1 Penisilin / Streptomisin,% 1 L-glutamin, ekleme 55 uM), β-mersaptoetanol eklenir. Süzme ile ES hücre ortamı sterilize edin.
2. Üreticinin talimatlarına göre toz Alfa Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) 1 L yaparak OP9 ortamı hazırlayın. % 20 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin ekleyin. Karıştırmak için ters. Iki adet 500 ml'lik alikota süzme ile sterilize edin.
   NOT: tozundan yapılan medya kullanımı tavsiye ve geliştirilmiş OP9 hücre bakım ve in vitro farklılaşma sonuçları elde etmek muhtemeldir. Bu yaklaşım standart bir prosedür haline gelmiştir. Ancak, biz de tha dikkatt biz bazen yeterli başarı ile önceden yapılmış sıvı α-MEM kullandık.
3. % 90 FBS,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) eklenerek ortam dondurma hazırlayın. Yavaşça karıştırınız ve süzülerek sterilize. 4 ° C'de saklayın.
4. 10 ug / ml tam ortam içinde OP9 insan rekombinant Flt-3, ligand (Flt-3 L) içinde çözülmesiyle 2,000x Flt-3, ligand (10 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama ile ilgili tedarikçinin tavsiyelerine uyun.
   Not: Flt-3L stabilitesi (4 ° C 'de 3 ay -80 ° C de 1 ay) kısadır.
5. Tam OP9 ortamını kullanarak 1,000x, IL-7 (1 ug / ml) hazırlayın. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri içine kısım saklayın. Istikrar ve depolama tedarikçinin önerileri izleyin (IL-7 -80 ° C'de 12 aya kadar dayanır).
6. LİF i ⁷ 10 adet 1:10 seyreltme ile 1,000x, lösemi önleyici faktörü (LİF) ya da (10 ug / ml) hazırlayınn, ES hücre ortamı. 4 ° C'de muhafaza kısım. Kısım şişeler üzerinde üretici tarafından sağlanan son kullanma tarihini not ettiğinizden emin olun.
   NOT: Ürün üretim tarihinden itibaren konsantre veya seyreltilmiş formu en az 18 ay stabildir.
7. Jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakalar hazırlamak ile 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 1.5 ml% 0.1 jelatin solüsyonunu ilave edin. Kaplama için en az 30 dakika izin kapakları ile oda sıcaklığında steril bir muhafaza içinde yemekler bırakın. Yemekler de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde bir gece boyunca kalabilir. Sağ cep tohumlamadan önce herhangi bir artık jelatin çözüm çıkarın. Jelatin çözüm tamamen kuyuda kurumasına izin vermeyin.

2. Hazırlık ve Besleyici Hücreleri ve Fare Embriyonik Kök Hücreleri Bakım (Mesc)

NOT:% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör tüm hücreleri inkübe edin.

1. Çözülme Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF)
   1. Donmuş bir flakon (~ 5 x 10 ⁶ Hızlı-çözülme hücre / mitomisin C ile tedavi (veya başka mitotikal tutuklandı) MEF'lerin flakon) ve onları bir 15 ml tüp transfer.
   2. Yavaş yavaş dondurma ortamından DMSO sulandırmak için damla damla olarak, çözülmüş hücrelere ES hücre ortamı 8 ml ilave edilir.
   3. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 400 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve ES hücre ortamı, 3 ml hücre pelletini.
   4. Önceden ısıtılmış ES hücre ortamı 33 ml 50 ml'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın. 36 ml nihai hacme getirmek üzere yeniden süspansiyon haline getirilmiş MEF'lerin 3 ml ilave edilir.
   5. İki jelatinleştirilmiş 6 oyuklu plakaların her bir kuyunun içine yeniden süspanse MEF'lerin 3 ml dağıtın. Hücreler takın ve onlara mESCs, tohumlamadan önce yaymak için izin vermek üzere en az altı saat süreyle tekrar inkübatör içine tabak yerleştirin. Medya her 2-3 günde bir değiştirilir ise bu mitotikal tutuklandı besleyici katmanlar, ilk ekimden birkaç gün boyunca kullanılabilir olabilir.
      NOT: Taze tutuklandı MEF'ler da kullanılabilir.
   6. Tohumlama mESCs
      1. 37 ° C su banyosu içinde dondurulmuş Mesc klon ile bir şişe hızlı çözünmesi ve 2.1.1-2.1.3 tarif edildiği gibi hücrelerini hazırlamak.
         NOT: Bir 6-çukurlu plaka bir birleşik kuyusundan Mesc 2 şişe dondurma.
      2. (Adım 2.1.5 hazırlandı) tutuklandı MEF tek tabakasıyla 6-plaka (Mesc klonu itibarıyla) bir kuyudan ortamları çıkarın ve MEF tek tabaka üstüne mESCs ve 3 ml tohum. 1,000x LİF (10 ng / ml), 3 ul ekleyin. Kuvöz içine yemekleri dönün.
   7. ES hücre bakım ve tripsin aracılı geçit
      NOT: Mesc izdiham göre değiştir günlük medya, ya da bölünmüş. Optimal, hasat ve split / yeniden-plaka hücreleri her gün.
      1. ES hücre ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile mESCs yıkayın. PBS çıkarın. % 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve 3-5 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
      2. Tripsinize hücreleri toplamak ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine transfer edin. Şiddetle m topaklannı kırmaya hücre süspansiyonu pipetleyinEKH. Tripsin nötralize etmek için hücre süspansiyonu tam ES hücre ortamı 2 ml ilave edilir.
      3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri. Süpernatantı ve 3 ml ES hücre medya pelletini.
      4. Hazırlanan tutuklandı MEF tek tabakaları ihtiva eden 6 oyuklu plakalar ortamı çıkarın. Her bir oyuğa ES hücre ortamı, 3 ml (istenilen bölme oranına göre) hücre süspansiyonu uygun miktarda ekilmiş edin. 1,000x LIF 3 ul ekleyin. 2 gün içinde geçiş için hazır olacak 6: Birleşik bir Mesc de 1 bölün.
   8. OP9 / OP9-DL1 hücrelerin bakım
      1. OP9 hücrelerin bir şişe çözülme (adımları izleyin 2.1.1-2.1.3 OP9 medyayı kullanarak)
      2. 10 cm doku kültürü çanak 7 mi OP9 ortam ekleyin. Plaka boyunca hücrelerin dağıtılması, damla damla bir şekilde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler 3 ml ilave edilir. Gece boyunca inkübatör içinde hücreleri yerleştirin.
      3. Ertesi gün hücrelerin OP9 izdiham kontrol edin. Çanak birçok ölü yüzen hücreleri içeriyorsa, remoOrtamı ettik ve taze ortam OP9 10 ml ekleyin. Neredeyse tam izdiham görülmez ise inkübatör tabak dönmek. 4 yakın birleşik OP9 monolayer: Split 1 (tripsin kullanarak).
         NOT: Tabaklar yaklaşık 2 gün içinde tekrar aynı izdiham düzeyine ulaşması gerekir. Aşırı yapışık hale OP9 hücreleri bırakmamaya özen gösterin.
      4. Genişleme hisse senetleri gibi OP9 hücrelerin erken pasajlar dondurun.
         NOT: konfluen 10 cm çanak yakın birinden OP9 hücrelerin 2 şişe dondurma. Genişletme stoklar Her bir ampul, aşağıda daha ayrıntılı olarak Mesc ko-kültür deneyleri kullanılan çalışma stoğu oluşturmak için çoğaltılabilir. Değişen sıcaklıklara olumsuz donar kalitesini etkileyebilir, çünkü daha -80 ° C'de derin dondurucuda daha sıvı azot içinde dondurulur, tüm OP9 stokları tutun.

   3. OP9-DL1 Ortak kültür Prosedür

   1. Eş-kültür preparatlar
      1. Yaklaşık bir hafta önce, bir ortak-kültürünün başlatılmasından MEF'ler, mESCs ve OP9 Hücre çalışma STO çözülmecks. OP9-DL1 hücrelerinin ko-kültür gününde 8 kadar gerekli olmadığından, ko-kültür başlangıcından sonraki ilk üç gün boyunca OP9-DL1 hücrelerini eritin. Bakım ya da gerektiği gibi tüm hücreleri dondurmak.
      2. Deneyin ölçeği dayalı gün 0 ko-kültür ile% 80 kaynaşmaya eriştikten hazır OP9 hücre tekli katmanları, 10 cm tabaklar başlangıç ​​sayısını belirlemek (örneğin, Mesc klonların sayısı ve ayırt edilmesi için ortak-kültür zaman noktalarının sayısı ile ) analiz edilebilir. 4 ve 1: bir ko-kültürü hazırlamak için, 1 ila OP9 hücrelerinin konfluent çanak yakınındaki bölme 6 iki gün önce mono tabakalar gerekli olacaktır ne zaman.
         NOT: Bir ÇIK klon başına en az bir levha gerekir. Gün 5 pasaj altı tabak tohum için yeterli hücrelerin vermelidir 0. günde (aşağıda tarif edildiği gibi), genellikle, tek bir ESC klon, tek bir plaka üzerinde tohumlandı. Her gün 5 tabak bir sonraki analiz zaman noktasını sağlayacaktır.
      3. OP9 monokatmanlar sürekli ko-kültür geçişi için gerekli olacak bu yana, bakımı her zaman HAYATIMIN almakko-kültür ile paralel olarak ilave OP9 kültür plakalarının yeterli sayıda.
   2. Gün 0: ortak-kültürünün başlatılması
      1. 2.3.1-2.3.4 gibi Mesc toplayın. Hücreleri saymak.
      2. Her bir klon için Mesc plaka başına OP9 ortam, 10 ml 5 x 10 ⁴ Mesc hazırlar.
         NOT:. Biz kullanılan olmasına rağmen, biz alternatif bir orta α-MEM,% 10 FBS oluşan ve 5 x 10 β-mercaptoethanol da farklılaşma ko-kültürlerinde kullanılmak üzere rapor edilmiştir ^-5 M ¹⁰ unutmayın
      3. OP9 yemekleri eski ortamları çıkarın ve plaka boyunca eşit hücrelerini dağıtmak için özen yemekleri Mesc süspansiyonu 10 ml ekleyin. 37 ° C inkübatör yemekler yerleştirin.
   3. 3. Gün: Medya değişiklik
      1. Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Koloniler üzere parlaklık kaybetmek ve basık görünür başlamalıdır.
      2. Yemekler ortamı kaldırın ve yavaşça taze OP9 10 ml ekleyinmedya.
      3. Inkübatör ko-kültür yemekleri dönün. Görsel kolonilerin% 80-90 görsel mezoderm-benzeri morfolojiye sahiptir ~ kadar gerçekleştirilemeyen gereken bir sonraki geçidin (gün 5) için, besleyici OP9 tek tabaka hazırlama zamanlama bilgi günlük mezoderm gibi koloni oluşumunu izlemek. 5 gün hücre transferi, aşama fazla erteleme 2 gündür.
   4. 5. Gün: ön-kaplama ile Tripsin aracılı geçit.
      NOT: optimal konfluen OP9 hücreleri ile önceden 10 cm yemekleri yeterli sayıda hazırlayın. Ko-kültürler görsel aşama 3.3.3 açıklanan özellikler gösterir yalnızca sonraki adımlara devam (ayrıca Temsilcisi Sonuçlar bakınız).
      1. Ko-kültür yemekleri ortamı çıkarın. Yıkamak için 4 ml PBS ilave edin. PBS girdap ve çıkarın. % 0.25 tripsin 4 ml ilave edilir ve ~ 5 dakika boyunca inkübatör yemekler yerleştirin.
      2. Dikkat ederek kadar, aşırı hava kabarcıkları tanıtmak için, güçlü pipetleme ile tripsinize edilmiş hücre katmanı bozabilirHomojen, çoğunlukla tek bir hücre süspansiyonu elde edilir.
      3. Tam OP9 medya 4 ml ekleyin ve pipetleme karıştırın. 30 dakika boyunca inkübatör yeni, boş bir 10 cm çanak ve yerine hücreleri aktarın OP9 hücreleri çanak uymak için izin vermek. Bu "ön kaplama" aşaması eş-kültür bir sonraki adıma aktarılmıştır OP9 hücrelerin sayısını azaltır.
      4. 40 mikron hücre süzgeçler ile 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın.
      5. Ön kaplama çanak yapışkan olmayan hücreler toplanır ve daha sonra tüpe hücre süzgecinden yoluyla geçmektedir. 6 ml PBS'de hafifçe bulaşık yıkama ve arkasında bağlı OP9 hücreleri bırakarak aynı süzgecinden geçirin.
      6. 4 ° C'de 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin hücreleri. Süpernatantı ve tam OP9 medya 3 ml pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Hücreleri saymak.
      7. Optimal Konfluent OP9 hücreleri ile 10 cm plakalardan ortamı çıkarın.
      8. Her analiz zaman noktası için, OP9 mono 5 x 10 ⁵ hücre tohum10 ml nihai hacim içinde katmanı.
      9. 5 ng / ml insan rekombinan Fit-3L ekleyin ve inkübatör yemekler yerleştirin.
   5. 8. Gün: Hematopoetik progenitör Hücre (HPC) koleksiyonu
      NOT: Bu aşama için süre içinde bu olacağı şekilde önceden OP9 veya OP9-DL1 hücre mono tabakaları ile 6 oyuklu plakaların yeterli sayıda Hazırlama ~% 80 konfluent.
      1. 40 mikron filtreli, 50 ml santrifüj tüpleri hazırlayın.
      2. Inkübatör yemekleri çıkarın ve mikroskop altında gözlemlemek. Yüksek basınçlı bir parlak kümeleri gevşek OP9 tek tabaka eklenmesi gerekmektedir. Bir pipet ile OP9 tek tabaka ve yemeğin üzerine mevcut medya yıkanması (ama aşırı rahatsız değil) mümkün olduğunca bu hücrelerin birçok toplayın. Köpük oluşumu önlemek için, her zaman bu HPC toplama / yıkama aşaması sırasında pipet ucuna ortamın en az 1 ml bırakın.
      3. Bir tüp içine 40 um süzgecinden hücreleri geçirin. , Tüm HPC aynı plaka 8 ml PBS ilave edin ve bir mikroskop altında kontrol bizyeniden toplandı. Daha kuvvetli bir yıkama ile (eğer gerekli ise) PBS Yıkama / toplama aşamasından tekrar edilmelidir. Zaten aynı Hücreleri plakadan içeren tüp içine hücreleri süzün.
      4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücreleri.
      5. 5 ng OP9 ortam (levha, 5. günde tohumlanır başına) 3 ml 'lik bir ana karışımı hazırlayın / ml Flt-3L ve 1 ng / ml IL-7.
      6. Fit-3L + IL-7 ana karışımı ile OP9 medya (işlenen her 10 cm çanak için 3 ml) süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. OP9 hücrelerine sahip bir 6-yuvalı plakanın bir oyuğuna Her levhadan toplanan hücreler aktarın.
         1. , Monositik, B hücreleri ya da eritroid soylar doğru pillerinin OP9 hücreler üzerine hücreler toplandı tohum için. T hücreleri elde etmek için, OP9-DL1 hücre mono tabakaları üzerine hücreleri tohum.
      7. Inkübatör içine 6 oyuklu plakalar yerleştirin.
   6. Gün 10: Medya değişiklik
      1. Her biri farklı klon Mesc besleyici hücre tipi Combina bir 15 ml santrifüj tüpü hazırlayınko-kültür tion.
      2. Flt-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml 'si ile OP9 ortamın bir ana karışımı hazırlayın. Her bir oyuk için 3 ml hazırlayın.
      3. Yavaşça aynı ESC klon besleyici hücre tipi kombinasyonunu içeren çoklu ortam çukurlardan birleştirerek 6 oyuklu plakanın her bir medya toplar.
      4. Her bir kuyuya OP9 ortam ana karışımı 2 ml (3.6.2) ekleyin.
      5. Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de toplanmıştır ortam. Kuyu başına OP9 medya ana karışımı 1 ml her pelet (görünür eğer çok küçük) (3.6.2 bakınız) başlangıçta adımda 3.6.3 toplanan süpernatant kaldırmak ve tekrar süspansiyon.
      6. Lütfen, her oyuğa ortam başlangıçta 3 ml her bir hazne içinde toplanmıştır hacmi getiren başka içine hücre 1 ml dağıtın. Inkübatör yemekleri dönün.
   7. Gün 12: Hayır tripsin pasaj
      Not: Bu s onlar optimal zamanında birleştirilebilmeli böylece önceden OP9 veya OP9-DL1 hücreleri ile 6 oyuklu tabaklarda yeterli sayıda hazırlayındım. Gün 12 geliştirme eritrosit, monositik ve erken evre T hücreleri akış sitometrisi analizleri için idealdir.
      1. Bir ana karışımı Fit-3L 5 ng / ml IL-7 ve 1 ng / ml 'si ile OP9 ortam (ko-kültür içinde devam edecek her çukuruna 3 ml) hazırlayın.
      2. 40 um süzgeçler (ko-kültür, her klon-ESC besleyici hücre tipi kombinasyon için bir adet) ile 50 ml'lik bir santrifüj tüpü hazırlayın.
      3. Kuvvetlice kuyuda (tek tabaka da dahil olmak üzere) tüm hücreleri parçalamak için her bir oyuğa mevcut ortamı pipetle. Tek bir hücre süspansiyonu andıran bir kıvama gelinceye kadar güçlü pipetlenmesiyle devam edin.
      4. Tüp içine süzgecinden toplanan hücreler geçirin. Kalan tüm yıkama hücreleri ve toplamak için, her bir oyuğa PBS 3 ml ilave edilir. Aynı süzgecinden hücrelere geçerler. Aynı ESC klon-besleyici hücre tipi kombinasyonu içeren çoklu kuyu hücreleri birleştirin.
      5. Kullanılan hücre süzgeç atın ve bir kuyuya bir kısım eşdeğer kaldırmak (~ 6 ml) İstenilen için(ya da başka) akış sitometrisi o gün yürütülecek analiz eder. Kullanımdan önce buz üzerinde, bu alikotları saklayın.
      6. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücreleri. Süpernatantı. Oyuk başına ana karışımı 3 ml, 50 ml santrifüj tüpünden elde edilen pelet yeniden tohumlu edilmesi. Uygun besleyici bir hücre tipi için her hücre süspansiyonu, göz başına 3 ml ilave edilir ve kuluçka makinesi içindeki yemekler yerleştirin.
   8. Gün 14: Medya değişiklik
      1. Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin.
   9. Gün 16: Hayır tripsin pasaj
      NOT: Bu aşama için önceden en uygun konfluent OP9 veya OP9-DL1 hücreleri, 6 oyuklu kapları hazırlayın.
      NOT: Flow sitometri B lenfositleri ve orta evre T hücrelerinin analizleri için günlük 16 idealdir.
      1. Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin.
   10. Gün 18: Medya değişiklik
       1. Bölüm 3.6 özetlenen adımları izleyin.
   11. Gün 20: Hayır tripsin pasaj
       NOT: Gün 20 iAkış sitometri için s ideal bir T hücrelerini gelişmekte geç sahneye orta analizleri.
       1. Bölüm 3.7 özetlenen adımları izleyin. İstenirse, hücreleri son gün 20 alternatif medya değişikliği ayırt taşımak ve hiçbir tripsin lenfosit genişleme oranı günlük izlenmesi ile, her iki gün geçitleri.

Sonuçlar

LİF mevcudiyetinde MEF'ler üzerinde yetiştirildiğinde, mESCs farklılaşmamış bir halde muhafaza edilebilir. İdeal koşullar altında, bunlar faz kontrast mikroskopisi parlak bir halosu ile çevrili olan hücrelerin yoğun kolonileri (Şekil 1) olarak görünür. Bu kültürler günlük olarak takip edilmelidir. Hücrelerin birleştiği bağlı olarak, ortam değiştirilebilir ya da hücre ayrılabilir. Komşu Mesc koloniler birbirleri ile temas noktasına gelmemeli. Farklılaşmamış mESCs ...

Tartışmalar

OP9-DL1 ko-kültür sistemi, kök hücreleri, kan hücre tiplerinin gelişimi esnasında, gen rolünü incelemek için kullanılmıştır. ^8,12,13 Ayrıca gen düzenleyici DNA fonksiyonlarını incelemek için etkin bir modeli olduğu kanıtlanmıştır hücre farklılaşması sırasında. ^9,14 zaman ve hematopozun birçok temel soruları deneylerin maliyeti önemli ölçüde tasarruf elde edebilirsiniz tüm fare modellerine alternatif olarak bu yaklaşımı kullanarak. Bununla birlikte, bu amaçla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell qualified FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
MEFs mitomycin C treated	Millipore	PMEF-CF	Any mitotically arresteded MEFs can be used
DPBS	Corning	21-031-CV
Cell strainer (40 μm)	Fisher	22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352096
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Tubes for FACS
ES R1 cells	ATCC	SCRC-1011
OP9 cells			Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells			Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab