Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Özet

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Özet

Drosophila pupa gelişme doğasında süreçleri vardiya ve canlı hücre görüntüleme sırasında izlemek için bireysel hücre davranışı zorlaştıran şekilde göz epitel bozabilir. Bu süreçler şunları içerir: Retina döndürme, hücre büyümesini ve organizma hareketinin. Pupa zorlu bir tek odak düzlemi birkaç ommatidia fazla in-odak görüntüleri elde etmek için yapmak, görüntüleme için hazırlanan Ek olarak, ince darbelere ve dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler genellikle tanıtıldı kıvrımlar. iş akışı Drosophila pupa göz gelişimi sırasında hücresel süreçlerin kolay analizini sağlayan, Çareleri burada bu konuları sıraladı. Bu duruma uygun şekilde kademeli pupa kolayca en laboratuvarlarda monte edilebilir bir görüntüleme teçhizat düzenlenmiş Ubikuitin DE-kaderin:., GFP ve GMR-GAL4 -sürümlü UAS-α-katenin GFP göz epitel ¹ hücre sınırlarını görselleştirmek için kullanılır ^-3. Dekonvolüsyon sonraBirden fazla odak düzlemleri yakalanan floresan görüntülere uygulanan maksimum projeksiyon görüntüleri her zaman noktası için oluşturulan ve görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak geliştirilmiştir. Hizalama algoritmaları izlemek için tek tek hücre davranışı kolaylaştıran, hızlı bir şekilde gereksiz hareket stabilize etmek için kullanılırlar.

Giriş

Bileşik Drosophila göz aksesuar pigment hücrelerinin ^4,5 olan bir petek-kafes ile ayrılmış olan ~ 750 ommatidia kalıplaşmış düzenleme ile karakterizedir. Yerel hücre hareketleri, hücre büyümesinin, hücre şeklinde değişikliklere, ve apoptoz: Bu pigment hücreleri etkinlikleri koordine kombinasyonu ile desenli. Bu epitel Canlı görselleştirme biri bir fizyolojik ilgili ve soğukkanlı üç boyutlu bağlamda bu olayları destekleyen moleküler mekanizmaları çalışma sağlar.

Daha önceki protokollarda ^6,7 tersine, burada anlatılan teknik görüntüleme işlemi çıkartılabilir olamaz yabancı doku hareketini stabilize edilmesi için etkili bir yöntem içermektedir. Görüntüleme boyunca, büyür dönen bir doku ve vardiya - Bu yöntem gelişmekte Drosophila pupa göz epitel hücre davranış çalışmaları geliştirir. Ayrıca hareket istikrar tekniği de içindeBurada tarif yabancı hareket meydana başka bağlamlarda hücreleri üzerinde çalışmak için yararlı olacaktır.

Göz özgü sürücü GMR-GAL4 ^1-3 kontrolü altında GFP: GFP yanı sıra UAS-α-katenin: Drosophila retina alanında hücre sınırlarını görselleştirmek için, transgenik sinek hatları ubi-DE-Kadherin ifade oluşturulur edildi. İki GFP-etiketli membran belirteçlerin kullanımı düşük yoğunlukta ışık hücre sınırlarının görselleştirme sağlar. Bu yüksek enerjili dalga boylarına tekrarlanan maruz kalma, artan sağlayan kare hızı ve film süresine doku hasarı ve photobleaching en aza indirir. UAS DCR-2, aynı zamanda, ikinci bir uçucu hattı ⁸ dahil edildi RNAi transgenlerinin etkinliğini geliştirmek için.

Önceki protokollerden üçüncü güncellemesinde, kolayca en laboratuarlarda monte basit bir görüntüleme teçhizat açıklanmıştır. Bu cihaz özel bir görüntüleme r olması gerektiğini ortadan kaldırırig bir üniversitenin 'makine dükkanı' veya benzer hizmeti tarafından oluşturulan. Bu görüntüleme kulesi görüntü diğer pupa dokulara ^9,10 için kullanılan benzer.

Doğrudan 17-42 saat puparium oluşumu (hr APF) sonra ~ den göz dokusuna katkıda morfogenetik olayları değerlendirmek için kullanılabilecek basit bir canlı hücre görüntüleme protokolü burada sundu. Spesifik olarak, bu protokol, pupa gelişimi esnasında gen ekspresyonunu modifiye sonuçlarını belirlemek için bir olanak sağlar.

Protokol

Şekil 3 deney prosedürünün bir özetini gösterir.

1. Doku Hazırlanması

1. C iki kez aşağıdaki çapraz kurmak ilgi konusu bir genin değiştirilmiş ekspresyon sonuçlarını, tespit etmek ve 25 ° C'de korumak için: UAS transgen (erkek) X, GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (bakire kadın) NOT: Kontrol doku çapraz UAS-lacZ edinmek için GMR-GAL4'e erkekler; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP kadın. β-galaktosidaz retina hücre davranışında kusurları yaratır.
2. RNAi transgenlerin etkinliğini artırmak için, çapraz UAS RNAi GMR-GAL4, UAS-DCR-2 erkek; UAS-α-cat: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b bakire kadın.
   Not: ektopik DCR-2 gözlenmiştir ifade retinae hücre davranışında sıra kusurları (veriler gösterilmemiştir). Teyakkuz Bu yaklaşım kullanarak, eğer tavsiye edilir.
3. S1.5 ml mikrosantrifüj tüpler seçilen beyaz uygun genotiplerin ön-pupa ve yer. Pupa DCR-2 ifade ederse, erkek veya kadın pupa seçin: UAS-DCR-2, X kromozomu üzerinde bir ekleme, ifadesi erkeklerde güçlüdür. Pupa pupa halinde pigmentasyonu önce 0 saat APF de cinsiyetli olmalıdır - erkek gonadlar pupa (posterior yaklaşık üçte biri) yan tarafta büyük saydam küreler gibi görünür.
4. 25 ° C'de temiz bir plastik ucu-kutusunda, pupa içeren mikrosantrifüj tüpleri inkübe. Pupa yer ucu kutu içine damıtılmış su içinde ıslatılmış bir doku, 10 cm ² parça, kurumayı önlemek için.
   NOT: ucu-kutusunda nem çok yüksek olursa pupa durum daha sonraki adımlarda incelemek için hantal ve zor olabilir.
5. Uygun bir süre için inkübe edilir. Yaklaşık 17 saat APF, 20 saat APF veya 24 saat AP de görüntüleme için pupa hazırlamak, göz desenlendirme ile ilişkili hücre davranışlarını yakalamak içinF. spesifik hücre davranışları en iyi şekilde gözlenen ne zaman daha fazla tartışma için Temsilcisi Sonuçları gör.
6. Siyah sylgard diseksiyon çanak üzerine taze çift taraflı bant bir parça yerleştirin. Çift taraflı bant (Şekil 1A) yapıştırılmış pupa başkanı ile, kadar pupa, dorsal yüzü yerleştirin .try çift taraflı bant pupa toraks ve batın bölgeleri bağlı değil. Forseps ile dikkatlice kaldırın ve pupa kafa maruz kapakçık çıkarın. Bir göz çevresini maruz pupa halinde kenarı boyunca gözyaşı.
7. Yavaşça yapışkan bant pupa çıkarın. Pupa yapışık kalırsa, yapışma zayıflatmak için pupa halinde ve bant arasındaki kavşak distile su küçük bir hacim uygulayın.

2. Montaj

1. Kurutma kağıdından küçük 15 ^mm2 çerçeve inşa ve middlethat bir delik çapı 5,5 mm (Şekil 1B) 'dir. Damıtılmış su ve yer daldırınBir mikroskop lamı merkezi. Vazelin düzgün bir halka sıkmak, 30 cc şırınga kullanarak kurutma kağıdı çerçevesini çevreleyen. Vazelin halka pupa genişliğinden daha ve halka çapı bir kapak kayma genişliğinden daha marjinal az olduğunu marjinal yüksek olduğundan emin olun.
2. Vazelin boncuk (Şekil 1D) tarafından desteklenen yüzü üzerinde, .Carefully pupa düzenlemek kurutma kağıdı (Şekil 1C) içine sokulur deliğe doğrudan slayt üzerine vazelin küçük bir boncuk ekleyin.
3. Vazelin halkasının üstüne bir lamel yerleştirin temas göz neuroepithelium (Şekil 1D) Yukarıdaki epitel böylece. Yavaşça vazelin karşı lamel mühür ve pupa göz bölgesi ve kapak arasında bir küçük düz temas yüzeyi oluşturmak için hazırlık sıkıştırmak.

3. Floresans Görüntüleme

1. Image kullanarak pupa hazırlıkfloresan mikroskop. Her 7 dk yakalama adherens kavşak bölgesinde göz neuroepithelium apikal etki yoluyla seri bölümleri.
   NOT: a) Uygun bir seri kesitler genellikle 4-5 0.2 mikron z-adımlardan oluşur z-yığını başına bulunmaktadır. b) hafif darbelere ve kıvrımlar dahil epitel topolojisinde, düzensizlikler, doku büyük bölgelerin içinde odak görüntüleri elde etmek için bu zorlu hale getirebilir. Görüntüleme yaparken, bir odakta olması için ilgi alanı bölümünü bulabilirsiniz, ve bir komşu bölge dışı odak olmak. Pupa göz ve lamel arasında distile su küçük bir damlacık da dahil olmak üzere pupa göz morfolojilerinden erken aşamalarında hafif düzensiz topoloji karakteristiği bazı akut doku kat değil ortadan kaldırabilir. Bu durumlarda odakta dilimleri tüm alan için edinilen kadar z-yığını uzatarak doku oversample. c) Her 7 dk önemli Redu olmadan 3 saat 4 için canlı görüntüleme etkinleştirmeniz gerekir seri bölümleri yakalamagörüntü kalitesini bozabilir GFP floresan yoğunluğu ction. Daha kısa zaman aralıkları-görüntüleme toplam süresini azaltabilir.
2. 3-4 saat için görüntüleme devam edin. Pupa büyüme ve hemolimf pompalama retina ve konumunu taşır yana birçok floresan mikroskoplar geçerli bir otomatik odaklama ve zaman işlevini kullanmak etmeyin uyanık yeniden odaklama her 14-21 dakikada gereklidir. Yavaş veya göz morfojenezini durak olabilir 4 saat ötesinde görüntüleme NOT.
3. Arka plan azaltmak ve seri bölüm resimlerin kontrastını artırmak için uygun Dekonvolüsyonun yazılımını kullanın. Her z-yığın dosyası için, (Malzeme Tablo) LAS AF yazılımında aşağıdakileri gerçekleştirin: Araçlar paneline gidin, 3D Dekonvolüsyon seçin ve Uygula'yı tıklatın.
4. Her deconvoluted yığın dosyası için maksimum projeksiyon (MP) görüntü oluşturun: Araçlar paneline gidin, 3D Projeksiyon seçin ve Uygula'yı tıklatın.
   NOT: Maksimum Projeksiyon algoritması üniforma oluşturmak için başarısız olabiliroversampled olan doku ly odakta görüntü. Out-of-odak bölgelerini bileme için bir tekniktir adım 5.2'de özetlenmiştir.

4. Pupa Rescue and Fenotip Doğrulaması sonrası görüntüleme

1. Forseps lamel kaldırmak ve gıda temiz bir şişeye aktarın pupa kullanarak: eserler tanıtıldı veya görüntüleme sırasında zarar pupa, dikkatli görüntüleme teçhizat gelen pupa kaldırmak olup olmadığını ele almak. Oda sıcaklığında saklayın veya 25 ° C yetişkin sinek çıkıncaya kadar.
2. Dikkatle yetişkin göz fenotip incelemek ve özgün sinek çapraz çıkan erişkin sinek gözlerine karşılaştırın.

5. Görüntü İşleme

1. Otomatik Görüntü Ayarı:
   NOT: Canlı Drosophila doku vardiya ve görüntüleme süreci boyunca büyüyecek. Sonuç olarak, görüntülerin merkezleri Drosophila dokusunda aynı noktaya uygun olmayabilir ardışık zaman noktalarında toplandı. Ek olarakTüm retina disk ~ 21 ve 23 saat APF arasında yaklaşık 30 ° döner. Bireysel hücre davranışlarını vurgulamak ve organizma büyüme nedeniyle dağıtıcı unsurları azaltmak, bu elle yapılabilir, her milletvekili image.While, burada kullanılan resim düzenleme yazılımı hizalamak için süreci hızlandırmak yerleşik algoritmaları vardır (Malzeme Tablo).
   1. Stack içine ana menüde, açık Scripts basıp Yük Dosyaları Dosya sekmesinde.
   2. Yük Katmanlar paneline MP görüntü dosyalarını içe ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun.
      NOT: Bu seçenek seçilirse, yazılım görüntü verilerini bozan bir hizalama algoritması kullanabilirsiniz.
   3. Tüm MP dosyaları Katmanlar bölmesine yüklenen sonra, tüm görüntüler erken zaman noktası katman yığınının üstünde olacak şekilde kronolojik sırayla olduğundan emin olun. Katmanlar, doğru düzen, sürükle değildir ve onlar sipariş kadar onları bırakın Eğerdoğru.
   4. Ana menüde Düzenle sekmesinden Otomatik Hizala Katmanlar seçin. Konumlandırmak seçin ve Tamam 'ı tıklatın.
   5. Otomatik Hizala algoritması ilgili bir odak noktasına çerçeveleri yönlendirmek için başarısız olursa, Taşı aracını kullanarak küçük ayarlamalar yapmak.
2. Kompozit Bileme:
   NOT: Bir başlangıç ​​milletvekili görüntünün Out-of-odak bölgeleri 'kırpma' LAS AF yazılım gelen deconvoluted yığını ile bilenmiş edilebilir. Bir yığın dosyası Kırpma bir el Maksimum Projeksiyon algoritması tabi z-yığını aralığını sınırlamak için olanak sağlar.
   1. (Süreç sekmesi altında) Araçlar panelinde Kırpma işlevi bulun. Elle onlar başlangıçta out-of-odak bölgesi içinde sadece yapışma kemer kapsayan şekilde ilk ve son dilim kısıtlamak. Bu bölge için optimize edilmiş yeni bir yığın dosyası oluşturmak için Uygula'yı tıklatın.
   2. TIFF dosyası olarak yerel optimize yığını ve ihracat için yeni bir Maksimum Projeksiyon oluşturun.
   3. The resim düzenleme yazılımı (Malzeme Tablo), Stack içine (ana menüde Dosya sekmesinde bulunur) açık Script seçin ve Dosyaları Yükle.
   4. Yük Katmanlar paneline belirli bir zaman noktası için başlangıç ​​MP görüntü dosyası ve yerel optimize MP dosyasını alma ve Tamam seçeneğini seçin. Otomatik Kaynak Görüntüler seçeneğini hizalayın girişimi seçili olmadığından emin olun.
   5. Katmanlar bölmesinde iki katmanı seçin ve ardından bir muntazam retina alanı içinde odak veren, otomatik iki görüntü uygun bölgeleri maskelemek için (ana menüde Düzenle sekmesinde bulunur) Otomatik Karıştır Katmanlar seçin. TIFF dosyası olarak bu kompozit görüntü kaydetme.
   6. Tekrar tüm bırakıyorsa MP görüntüler için 5.2.5 ile 5.2.1 adımları.
3. Ek Ayarlar: Döndürme, kırpma ve ayarlama Film Katmanlar Düzeyleri:
   1. Tüm katmanları seçili retinanın dorsal-ventral eksen hizalanmış böylece, görüntüleri döndürmek için Transform aracı (Edit> Free Transform) kullanınFilm çerçevesinin y-eksenine.
   2. Gerekirse, istenen boyut ve şekline görüş alanını azaltmak için Kırpma aracını kullanın.
   3. Hücre zarı ve hücre gövdesi arasındaki kontrastı artırmaya yardımcı olmak için (bireysel kare) seviyesi ayarını kullanın.
   4. Üslup amaçlar için ve her çerçevenin ilgi noktaları vurgulamak için yanlış renk tanıtmak, belirli bir hücre davranışlarını vurgulamak için.
4. Animasyon: Bir Film içine Görüntüler dönüştürün:
   1. Ana menüde Windows sekmesinden Animasyon bölmesini açın. Animasyon bölmesinin sağ üst köşesinde bulunan menüden Katmanlar Kareleri yapın seçin.
   2. Tabakalar yığının altından başlayarak sırayla animasyon bölmesine eklenir unutmayın. İlk kare, tüm seçin ve ardından Animasyon bölmesi menüsünden Kareleri Ters seçin, kare sırasını tersine çevirmek için.
   3. Çerçeve başparmak altındaki açılır menüyü kullanarak her kare için bir çerçeve gecikme süresini seçinTırnak.
      Not: 1 Bu yazıda sunulan 4 Filmler çerçeve gecikmesi 0.8 sn.
   4. Ve ana menüye, açık İhracat Dosya sekmesinde video Render seçin. Dosya Seçenekleri altında QuickTime Dışa seçin ve istenen video biçimini seçin. Seçenekler Özel olarak Frame Rate set Render altında, 15 bir kare hızı girin ve Render tıklayın.

Sonuçlar

Pupa göz Canlı görüntüleme neuroepithelium desenlendirme katkıda hücre davranışlarını gözlemlemek için başarılı bir strateji. Belirli proteinlerin rolü kolayca göz gelişimi sırasında protein düzeylerini değiştirmek transgenleri ifade ile tespit edilebilir. Bu GMR-GAL4 yapmak için morfogenetik oluktan arkasında transgen ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu ilk iki larva dönemi boyunca göz alanını kurmak önceki olayları bozucu değil avantajı sunuyor. Ayrıca birçok ...

Tartışmalar

yabani tip geliştirme (yukarıda) açıklaması RNAi desenleme olayları veya aşırı ekspresyonu genotip karşılaştırmalar için temel oluşturur. Hücre davranışları ilgi protein tarafından düzenlenir hangi kesin belirlerken canlı doku gelişiminin Karşılaştırmalar paha biçilmezdir. Bundan başka, burada tarif edilmeyen, canlı hücre görüntüleme bir desen göz olaylarda ilgi konusu bir genin rol kalitatif ve / veya kantitatif tanımlama yapmak mümkün kılar. 30-32 saat APF en pigment hücreleri i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems