Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu<em&gt; Helikobakter pilori</emDemir Kullanılabilirlik Değişen Koşullarda Üretilen&gt; Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

Özet

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Özet

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population^1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide³. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA^4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells^5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks^5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the “pilus”⁵. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface^9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

Giriş

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer¹. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet¹¹. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression¹². Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host’s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis¹³. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease¹⁴. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion¹⁵. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur^16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer¹. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes.

Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease^11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains¹⁴. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili.

We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle¹⁰.

Protokol

1. H. İnsan Gastrik Hücrelerine ile Demir Durumu ve Co-kültür Çeşitli Koşullar pylori Büyüme

1. H. seçin Bu çalışmalar için pylori soyu PMSS1 bir sağlam cağ patojenite adası ve işleyen bir tip IV sekresyon sistemi ifade çünkü. Aynı zamanda, bir negatif kontrol olarak izogenik bir kafes mutant (PMSSI Δ kafesi) kullanmaktadır. % 5 _CO2 varlığında 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş TSA plakaları üzerine bakteri büyütün.
   NOT: reaktifleri hazırlayın ve Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo belirtildiği gibi malzemeleri bir araya getirin. Her bir reaktifin son konsantrasyonları parantez içinde belirtilmiştir.
2. Steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak plaka bakteri kazıyın ve bileşenlerden hazırlanan modifiye brusella et suyu içine aşılamak (Malzeme ve Ekipmanları Tabloya bakınız) ve kolesterol ile desteklenmiş. 37 ° C'de gece boyunca kültürler inkübeDakika (rpm), 200 dönüş çalkalayarak,% 5 _CO2 ilave edilmiş, havada bulunan ° C.
   Not: Kolesterol bağlı olarak serum karmaşık olmasından fetal sığır serumu yerine kullanılır; Bu tür sonuçlar değişkenlik neden heme gibi besin demir sayısız kaynaklar içeren.
3. Bakteriyel kültür gününde, AGS insan gastrik epitel hücreleri, tohum (ATCC CRL-1739), 12-gözlü levhalar (oyuk başına yaklaşık 1 x 10 ⁵ hücre) poli-D-lizin muamele edilmiş, kapak slipleri üzerine.
4. Ertesi gün, tadil edilmiş, Brucella et suyu, tek başına veya 100 uM _FeCl3, 200 uM dipiridil (sentetik demir kenetleme maddesi) ya da 200 uM dipiridil artı 250 uM _FeCl3 ile desteklenmiş 0.3 bir OD600'e bakteri kültürleri seyreltin. 200 rpm'de çalkalanarak,% 5 _CO2 ilave edilmiş, havada bulunan 37 ° C de 4 saat süre ile, bu kültürleri inkübe edin.
5. 1000 xg'de santrifüj bakteri hücreleri toplamak ve i resuspending önce süpernatanlan kaldırmak içinn, taze değiştirilmiş Brucella Et suyu eşit hacimde kolesterol ile takviye edilmiştir. Kültür (OD600 = 1.0 = 5.5 x 10 ⁸ hücre / ml) ölçümü OD600 ve enfeksiyon 20 (İB) 'in bir çokluğu epitel hücrelerine bakteri ekleyin: 1 arasındadır. Bakteriyel hücre canlılığını değerlendirmek için kan agar plakaları üzerine seri dilüsyonlarını ve plaka bakteri hücreleri gerçekleştirin.
6. H. inkübe taramalı elektron mikroskobu (SEM) örnek hazırlama gerçekleştirmeden önce statik koşullarda% 5 _CO2 varlığında 37 ° C'de 4 saat boyunca pilori AGS insan mide epitel hücrelerinin ko-kültürler.

2. SEM H. Visualize'a Numune Hazırlama H. pylori Çağ-T4SS Pili

1. H. Kaldır H. pylori ve inkübatör ve dökme sıvı kültür süpernatanından AGS ko-kültürler (IL-8 ELISA ile) kaydedin. 0.05 M sodyum kakodilat buferi (pH 7.4) hafifçe üç kez yıkayın. ,% 2.0 paraformaldehit çözeltisi içinde 2,5, oda sıcaklığında 2-4 saat boyunca örnekleri saptamak% Gluteraldehit, ve 0.05 M sodyum kakodilat tamponu. Birincil tespit sonra örnekler 0.05 M sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın.
2. İki ardışık 10 dakika sabitleştirme adımlarında 0.05 M sodyum kakodilat tampon maddesi içinde% 0.1 osmiyum tetroksit ile ikinci tespit gerçekleştirin. İkinci tespit sonra örnekler 0.05 M sodyum kakodilat tamponu ile üç kez yıkayın.
3. Birincil ve ikincil tespit edildikten sonra, Tablo 1 'deki gibi etanol artan konsantrasyonları ile art arda yıkama ile örnekleri dihidrat.
4. Etanol dehidratasyon sonra sıvı karbon dioksit, sıralı üç yıkama yapar. 1073 PSI 31.1 ºC sıcaklık ve basınçta bir kritik nokta kurutma makinesi kullanılarak kritik bir noktada sonra kuru örnekleri.
5. Dağı alüminyum SEM örnek taslakları üzerine lamelleri ve uygun topraklama sağlamak ve SEM görüntüleme sırasında şarj önlemek için numune kenarında kolloidal gümüş ince bir çizgi ile boyayın.
6. Coat örnekleri 5 nm ileörnek ikincil elektron sinyal ve kenar etkisini artırmak için bir püskürtme ceket makinesi kullanarak altın-paladyum.

Yüksek Çözünürlüklü SEM Analizleri 3. Görüntüleme Parametreleri

1. Saha-Emisyon Gun Taramalı Elektron Mikroskobu (FEG-SEM) ile View örnekler.
2. 5-10 mm çalışma mesafesi yüksek bir vakum modunda görüntü.
3. 5 kV hızlandırma voltajı ayarlayın.
4. 2-2,5 spot boyutunu ayarlayın.
5. Konak-patojen arayüzü daha iyi bir görünüm elde etmek için 15-25 derece arasında örnek eğin.
6. Konak-patojen etkileşimlerinin bu alanlarda Pili oluşturan bakteriler için zenginleştirilmiş olarak, yüksek büyütme görüntüleme için epitel hücrelerinin kenarlarına yapışmış bakteri görüntüleme öncelik.

4. İstatistiksel Analizler Pili quantifications değerlendirin

1. H. analiz ImageJ yazılımı kullanılarak H. pylori Çağ-T4SS piluslar piliated Phe arzeden hücre zarları / hücre sayısının yanı sıra yüzde ölçmek içinAşağıdaki talimatlara göre notype.
2. ImageJ yazılım açık mikrografiğidir dosyaları. Düzgün genişlikte (10-13 nm) ve uzunluğu (60-150 nm) bakteriyel hücre ve konakçı hücre arasında oluşturulan yapılar olarak Pili belirlenmesi.
   Not: pilus yapısı büyük ATPaz güçler tip IV sekresyon pilus düzeneği kodlayan gende bir etkisiz hale liman bu Δ kafesini mutant soylar olarak izogenik suşları ilgilidir WT bakteriyel suşlar üzerinde mevcut olan, ancak mevcut değildir.
3. "Analiz" sekmesine tıklayarak ardından düz çizgi aracıyla bir çizgi çizerek tarafından ölçme aracı kalibre. Açılan menüden "Set Ölçeği" seçin ve kutuya etiketli "Bilinen uzaklık" içine büyütme bar değerini girin ve uygun ayarı (nm) uzunluğu birimini ayarlayın. "Tamam" ı tıklayın.
4. Pilus uzunluğu veya genişliği boyunca çizmek için düz çizgi aracını kullanarak Çağ-T4SS Pili ölçün ve sonra her Pilus ölçmek için "Ctrl-M" tuşuna basın. Ölçülen değerler ile bir diyalog kutusu gözlemlemek. Bu değerleri kaydedin veya kopyalayın ve bir elektronik tablo programı yapıştırın.
5. Uzunluğu kullanın ve genişlik parametreleri önceden Çağ-T4SS profilini uymayan ^24, göz ardı özellikleri kurdu. Sonra 10-13 nm genişlik ve 60-150 nm uzunluk eşik dahilinde değerlere dayalı pili sayısını ölçmek.
6. GraphPad Prism yazılımı kullanılarak iki kuyruklu Student t testi ile istatistiksel pili ve miktarının analiz.

5. İsteğe bağlı: IL-8 salgısını değerlendirilmesi Pilus üretimi ile ilişkilendirir için

1. Adım 2.1 süpernatanlarm kullanarak, kit ile üreticinin talimatlarına (Malzeme ve Ekipmanları Tablo bakınız) başına bir IL-8 ELISA gerçekleştirin.
2. IL-8 konakçı hücreler tarafından salgılanan analiz eder ve tek başına ortam içinde yetiştirildiğinde, WT PMSS1 göre yüzde IL-8, indüksiyon hesaplar. Böylece GraphPad Prism kullanılarak iki kuyruklu Student t testi kullanılarak istatistiksel analizftware.

Sonuçlar

Bu yazıda, demir kullanılabilirliği değişen koşulları H. modüle kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir ana patojen arayüzünde pilori Çağ-T4SS pilus biyogenez. H. tek başına ortamda kültürlenen zaman H. pylori 3 Pili / hücre ortalama oluşturur. H. H. pylori demir yetiştirilir tüketen bakteri büyümesi (Şekil 1), alt inhibitördür (sentetik kenetleyici dipiridil kullanılarak) şartları altında, bakteriler üreten bir çok Çağ-T4...

Tartışmalar

Demir, bakteriyel patojenler dahil olmak üzere yaşamın birçok formları için önemli bir mikrobesleyicidir. Mikroorganizmaları istila canlılığı kısıtlamak için bir çaba, omurgalı ana "beslenme dokunulmazlığı" ¹⁸ olarak bilinen bir süreç içinde besin demir müsadere. Buna karşılık olarak, bakteriyel patojenler çevrelerini algılamak ve demir toplama sistemleri, toksinler ve toksin salgı makine ^19,20 olarak virülans özelliklerinin detaylandırılması düzenleyen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L)	Sigma	70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L)	Sigma	70174
Yeast extract (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Sodium chloride (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	16220
Sodium cacodylate (0.05 M)	Electron Microscopy Sciences	12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	19150
Ethanol (absolute)	Sigma	E7023
Colloidal silver paint	Electron Microscopy Sciences	12630
SEM sample stubs	Electron Microscopy Sciences	75220
Coverslips	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit	R&D Systems	D8000C