Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Özet

Bireysel dopamin nöronlarının izolasyon ya da doğrudan veya dolaylı olarak immunohistokimyasal ile ventral tegmental alan lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanılarak gösterilmiştir. Kızılötesi lazer kullanarak cam slayt doku izolasyonu ve bir kızılötesi ve morötesi lazer kombinasyonu kullanılarak membran slaytlar arasındaki parametreler tartışılmıştır.

Özet

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), bir mikroskop lamı üzerine tek tek hücre veya doku kesitlerinin bir doku hassas anatomik bölgelerine konsantre bir popülasyonu izole etmek için kullanılır. Immünohistokimya ile birleştirildiğinde, lcm spesifik bir protein işaretleyiciye dayanan tek tek hücreler türleri izole etmek için kullanılabilir. Burada, lcm tekniği ile doğrudan tirosin hidroksilaz immünohistokimya ile LCM için kullanılanlara bitişik bir bölümü üzerinde dolaylı tirosin hidroksilaz immünohistokimya kullanılarak, ventral tegmental alan bölgesini içeren dopamin nöron izolasyonu için etiketli dopamin sinir hücrelerinin belirli bir nüfus toplanması için bir işlem açıklanmaktadır. Bir kızılötesi (IR) yakalama lazer hem de kullanılan bireysel nöronlar yanı sıra cam slaytlar ve analiz için bir LCM kapağı üzerine ventral tegmental alanı kapalı teşrih. % 100 etanol ve ksilen dokuya tam dehidrasyon kritiktir. İR yakalama lazer kombinasyonu ve ultraviyole (UV) cutting lazer PEN membran slaytları kullanırken bireysel dopamin nöronları veya ventral tegmental alanı izole etmek için kullanılır. Bir PEN membran slayt o, hızlı doku büyük parça topluyor hücreleri yakalama ve toplama daha iyi tutarlılık sunuyor, bir cam slayt üzerinde önemli avantajlara sahiptir slayt doku tamamen çıkarılması dehidratasyon ve sonuçları daha az güvenen. Bir cam slayt doku geniş alanlar çıkarılması mümkün olmasına rağmen, önemli ölçüde daha fazla bir zaman alır ve genellikle arkasında bazı kalıntı doku bırakır. Burada gösterilen veriler, yeterli miktarda ve kalitede RNA kantitatif PCR ölçümleri için de bu prosedürlere göre elde edilebileceğini göstermektedir. RNA ve DNA da geliştirilmiş anatomik ve hücresel çözünürlük yararlanabilir microRNA, protein ve DNA epigenetik değişikliklerin LCM, izolasyon ve ölçümü ile toplanan en sık izole dokudan moleküller ve hücreler olmasına rağmen LCM kullanılarak elde edilmiştir.

Giriş

Tüm doku hücrelerinin bir heterozigot topluluğundan oluşmaktadır. Bu glial hücreleri (oligodendrositler, mikroglia ve astrositler) çeşitli çevrili çeşitli morfolojik ve / veya nörokimyasal farklı nöron oluşan beyin dokusu için özellikle uygundur. Ek olarak, korteks veya beyin sapı çekirdeklerinin alanlar olarak beyinde farklı bölgeler, belirli bir işleve sahiptir. Analitik teknikler (örneğin Q-PCR, mikrodiziler, RNA, DNA sekanslama proteomik) ile bir araya nedenle, özelliği belirgin bir şekilde çeşitli biyolojik süreçlerin anlaşılmasını artırabilir, hücre ya da çok küçük bir anatomik olarak farklı alanlarının özel popülasyonlarının izole edilmesi için. LCM RNA, mıkroRNA, DNA ve proteinler gibi çeşitli moleküller, daha fazla analiz için çok daha homojen bir kaynak temin eden bir mikroskop lamı üzerine dokusundan çok farklı anatomik alanlar veya belirli hücrelerin izole edilmesi mümkün kılan bir teknolojidir.

t "> LCM ilk tanıtıldı yana, birkaç farklı yaklaşımlar dokudan ^1-3 hücreleri microdissect için kullanılmıştır. erken yaklaşımlar bir kızılötesi (IR) lazer ve bir termoplastik film ve olmayan bir kullanarak bir slayt dokuya direkt eki dahil bir tüp içine, bir hücre ya da doku ve toplama ayırmak için lazer kesme bir ultraviyole (UV) ile iletişim yöntemi. Daha sonra, lcm başarılı dokularda ve hücre tiplerinde çeşitli kullanılan gösterilmiştir alt analizi için çeşitli moleküllerinin izole edilmesi ile uyumlu olacak şekilde enzimatik aktivite ^1,4-7, RNA, mıkroRNA, DNA ve proteinler de dahil olmak üzere. Burada lcm bir kesme UV lazer ve hücreler ya da doku çevresinde kesme ve sabitlenmesi için bir yakalama kızılötesi lazer kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gösterilmiştir LCM kap olarak bulunmuştur. Bu LCM sistemi plastik filme hücreleri bağlayan ve t kaldırır hücre ya da ilgi konusu doku üzerinde bir kapak ile bir plastik film eriyik IR yakalama lazer hem kullanırkapağın kaldırılması ile de doku (Şekil 1). Buna ek olarak, İR lazer ile bir arada, bir UV lazeri cut-out için doku veya sonra kızılötesi lazer (Şekil 2) ile lcm kapağa doku bağlanması ile izole edilmiş bir zar ile kaydıraklar üzerinde monte dokudan çıkar hücreleri mevcuttur. Bu tekniklerin kısa bir bakış, Şekil 1 ve 2'de bulunmaktadır.

Ya doğrudan fluoresan immünohistokimya ve belirli bir proteinin ifadesine dayalı bir doku bölgesinin izolasyonu için kullanılır dolaylı immünohistokimya güdümlü tekniği kullanılarak belirli hücreleri izole etmek için bu teknik üzerinde çeşitli varyasyonlar tarif edilmiştir. Spesifik olarak, substantia nigra ve ventral tegmental alan ve taze, dondurulmuş beyin dokusu RNA daha sonra tecrit izolasyondan dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu gösterilmiştir. RNA, ölçülen moleküllerin en çok kararsız olduğu için, st (DNA ya da protein ile karşılaştırıldığında)RNA bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için eps dahil ve veri elde RNA miktarı ve kalitesi üzerinde gösterilir.

Protokol

NOT: farelerin beyin dokusu Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uygun olarak kullanılan, ve çalışma protokolleri Mississippi State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Slaytlar ve Doku 1. Hazırlık

1. Silan-hazırlık slaytlar veya polietilen naftalat (PEN) membran cam slaytlar kullanın.
2. RNA izolasyonu için, RNaz dekontaminasyon çözelti içinde daldırma slaytlar, daha sonra RNase içermeyen su ile 3 kez yıkanır, 30 dakika için RNase içermeyen etanol ve vakumda kurutun kademeli bir dizi dihidrat.
3. Bir sirostat kullanılarak 10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin ve hazırlanan RNazsız kızaklar üzerinde monte. RNA kalitesini korumak için kesit sırasında donmuş bölümleri tutun.
   NOT: Doku yaklaşık 4 mm uzakta slayt kenarlarına çok yakın olan doku kaldıramazsınız LCM olarak slayt kenarlarından olduğundan emin olun. Order PEN membran slayt doku kaldırmak doku sol, üst ve alttan 4 mm ve slayt bağlı olmayan zarın boyutları slayt sağ tarafında 7 mm olmasını sağlamak için.
4. Silan-hazırlık slaytlar veya PEN membran slaytlar ya direk immunhistokimya, bölüm doku kullanarak bireysel hücre popülasyonlarının izolasyonu için. Dolaylı immünohistokimya destekli teknikler kullanılarak doku bölgelerin izole edilmesi için, LCM için kullanılacak PEN membran sürgü ve / veya silan-preparatif sürgü ya da immünohistokimya ve diğer bölümleri için bir Silan preparatif slayt bölümlere bir set monte edin.

Lazer Yakalama 2. Doku Hazırlık - İmmünoeaktif Hücreleri Doğrudan Lazer Yakalama Hızlı Tirozin Hidroksilaz İmmünhistokimya

1. Hidrofobik kalemle doku anahat ve kurumasını bekleyin.
2. Aseton-metanol doku saptamak (1: 1), 10 dakika boyunca -20 ° C'de çözelti.
   NOT: OuR deneyimi aseton-metanol tespit tek başına aseton veya metanol çok daha tutarlı bir immünohistokimya ile sonuçlandığını göstermiştir.
3. Fosfat içinde durulayın slayt% 1 Triton (RNase içermeyen) ile tuzlu su (PBS) ilave edilmeden.
4. 400 U / ml RNasin 100: tirozin hidroksilaz antikor ile% 1 Triton ile 100-200 ul PBS ile kapak bölümleri 1 seyreltilmiş. 5-10 dakika süreyle inkübe edin.
5. Iki kez kısaca PBS içinde durulayın ve PBS-% 1 Triton.
6. 100 PBS-% 1 Triton 400 U / ml RNasin ve 50 ng / ml DAPI ile: 1 seyreltilmiş Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş keçi anti-tavşan IgG, 100-200 ul doku örtün. 5 dakika boyunca inkübe edin.
7. PBS içinde 2 kere yıkayın, sonra RNazsız etanol serileri içinde 30 saniye dihidrat (% 75 -75,% -95% -95% -100% -100%).
8. 1 dakika, 5 dakika boyunca Ksilen iki yıkama içinde inkübe edin.
9. Hemen önce LCM için kullanmak ve kurumaya izin Ksilen slaytları çıkarın.

Lazer Yakalama 3. Doku Hazırlık - Tirozinİmmünoeaktif Bölgeler Dolaylı Lazer Yakalama Hidroksilaz İmmünhistokimya

1. Bölümlere bitişik bölümler ile işlem, bir slayt Silan hazırlık ve / veya immünohistokimya PEN zar parçalan üzerine yerleştirildi.
   NOT: Burada kullanılan Prosedürler önce ⁵ bildirilenlere benzerdir. Gösteri görüntüler için, diaminobenzidin (DAB) Chromagen reaksiyon ilgi tirozin hidroksilaz nöronlar görselleştirmek için kullanıldı.
2. LCM için kullanılan slaytlar için, 4 ° C'de,% 100 aseton içinde 5 dakika boyunca sabitleyin.
3. RNazsız etanol serileri içinde doku kurutmak (% 75 -75,% -95% -95% -100% -100%) 1 dakika her biri için.
4. 1 dakika, 5 dakika boyunca Ksilen iki yıkama içinde inkübe edin.
5. Hemen önce LCM için kullanmak ve kurumaya izin Ksilen slaytları çıkarın.

4. Lazer Yakalama Mikrodiseksiyon Sisteminin Kullanılması

NOT: LCM uygulama programı 10 Alet çubukları ve kontrol 2 pencere varmikrodissek- prosedürü. Aracı Barlar: 1. Mikroskop, 2. Yakalama Lazer, 3. Kesim Lazer, 4. Eğitim, 5. Navigasyon, 6. Malzemeler, 7. Yakalama Gruplar, 8. Mikrodisseksiyon, 9. Yazı, 10. Ek Açıklama. Windows: 1. Canlı Video ve 2. Yol Haritası.

1. LCM sistem yazılımı Malzeme araç çubuğunda "Açık Kapı" sekmesini seçerek kapıyı açın.
2. Mevcut üç yuvaları Yük kayar. Bu gösteri için, tirozin hidroksilaz immunohistokimyasal yük bir slayt DAB, bir Silan-hazırlık slayt ve bir PEN membran slayt hızlı floresan tirozin hidroksilaz immünohistokimya için etiketli her ile görüntülendi. Tipik bir deneyde, doğrudan lazer yakalama için floresan tirosin hidroksilaz ile etiketlenmiş tirosin DAB kullanılarak hidroksilaz ve slaytlar için etiketli referans slayt ya etiketlenmemiş aseton sabit bölümleri kullanabilir.
3. Mevcut yuvaya LCM kapakları yükleyin.
   NOT: Makro ve HS LCM kapaklar kullanıma hazır. LCM kapağı türü de kullanmak içinhücreler ya da doku miktarı sayısı basımınızın toplanacak. Makro slaytlar HS kapaklar birkaç yüz toplayabilir ise birkaç bin hücrelere kadar toplamak için listelenir. Makro slaytlar fazla doku toplama sağlar ancak liziz tamponu 50 ul gerektirir. Adaptörleri ile kullanıldığında HS kap, RNA daha orantılı kurtarma sağlar lizis tamponu sadece 10 ul gerektirir.
4. Kapıyı kapatın.
5. Tüm slayt bir çalışma görünümünü sağlar Yol Haritası penceresini etkinleştirmek için slayt yükleyin, bu (Şekil 3) ilgi bölgenin seçimi için izin verir. Ilgi alanına gitmek için Canlı video penceresinde Yol Haritasını görüntüleyin.
6. Malzemeler araç çubuğunda, slayt yuvasının yukarıdaki kutuyu işaretleyerek PEN membran slaytlar tespit. Kap özelliklerini sağlamak için, sağ Malzeme araçları çubuğunda kapaklar üzerine tıklayın ve "Cap arz özellikler" i seçin. Kapaklar konumunu gösteren onay kutularını ve ya Ma seçincro veya HS kapaklar.
7. Floresan lamba açmak ve floresan lamba ısınmak için izin Mikroskop araç çubuğunda "Floresan" sekmesini seçin. Sırasıyla, Alex Fluor 488 ve DAPI görselleştirmek için Mavi ve UV filtreleri kullanın. Floresan etiketli hücreleri görmek için resmin hassasiyetini artırmak için "Kamera Ayarı" sekmesini kullanın.
8. Malzemeler araç çubuğunda, sağ kapağın üzerine tıklayın ve ilgi slayt taşıyın. Canlı Video penceresinde görünen bölgeyi seçmek için Yol Haritası Bir yere çift tıklayın. Bir Yol Haritası bölgeyi (çift sol tıklama) ve daha sonra sağ tıklayarak ve seçme seçerek slayt etrafında kapağı Taşı "merkez bölgede yer kapağını."
9. IR yakalama lazer kullanmadan önce, amacı ve gücü için ayarlayın. Uzakta dokudan slayt bir bölgede kapağı yerleştirin. Yakalama Lazer araç çubuğunda, "Enable" ı seçin. Güç (3-100 mW), Pulse ayarlayın (100-1000000 μ; Sn) ve lazer # Hits. Kapak dokusu olmadan slayt bir kısmı üzerinde olduğunda IR lazer Yangın ve lazer yeterince LCM kap membran erir olmadığını görmek için kontrol edin.
   NOT: kapağı polimer membran eriyor Bu denir ıslatma temas cam slayt böylece. Karanlık bir halka açık halka (yeterli ve yetersiz erime örnekleri için Bkz: Şekil 4) merkezi ile slayt kaynaşmış yeterli ıslatma görülebilir. Islatma yeterli değilse, bu elde edilene kadar, tekrar güç ve nabız, ateş ve test ayarlayın. Buna ek olarak, lazer birden yangınları da kullanılabilir.
10. IR lazer yoğunluğu ayarlanır zaman, sağ tıklayın ve lazer amacı "Yakalama lazer burada" seçeneğini seçin.
    NOT: Bu adım IR yakalama lazer dokusu hedefleniyor bilgisayar söyler. Lazer amaçlayan bu adım önemlidir ve kapak hareket her zaman tekrarlanması gerekir ya da nesnel değiştirilir.

Silan-hazırlık Slaytlar kapalı Bireysel Dopamin Nöronlar 5. Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

1. Hücreleri yakalamak için ilgi bölgeye taşıyın.
   NOT: izole dopamin nöronlarının örneği burada gösterilmektedir.
2. Bir Silan-hazırlık slayt kapalı bireysel hücrelerin yakalamak için, Mikrodiseksiyon araç çubuğunda ardından "tek nokta" simgesi "LCM" sekmesini seçin.
3. Mikroskop araç çubuğunda, uygun filtreler seçmek için floresan filtreleri sekmeleri ile floresan ve parlak alana arasında geçiş yapmak için "Shutter" sekmesini kullanın ve büyütmesini değiştirmek için hedefleri sekmeleri kullanın. Ilgi hücreler Canlı video penceresinde görünür sonra, hücrelerin yaklaşık boyutu ilgi hücreleri işaretlemek için kullanılan nokta boyutunu ayarlamak. Daha sonra karşı tarafta tıklayarak takip lekeli bir hücrenin, bir tarafında tıklayarak Yakalama Lazer araç çubuğunda Nokta sekmesini tıklatarak bunu.
   NOT: Bu hesaplarspot çapı ve değerini gösterir.
4. "Tek nokta" simgesi seçili iken onlara tıklayarak ilgi hücreleri işaretleyin. Her hücrede bir nokta işaret yerleştirmek için bunu yapın. Burada, Mavi filtre ve 10X objektif dopamin nöronları görselleştirmek için kullanılır. Tekrar test ve adım 4.9 ve 4.10 açıklandığı gibi altındaki hiçbir doku olduğu yerde kapağı IR lazer hedefliyoruz.
5. Otomatik olarak seçilen tüm işaretli hücreleri ateş edecek Mikrodiseksiyon araç çubuğunda ve IR lazer sekmesini - hücreler işaretlendikten sonra, "kesme ve yakalama git" seçeneğini seçin. Gerekirse Ayrıca, ilgi herhangi bir noktasında (Şekil 5D) manuel IR lazer ateş.
6. Hücreler LCM kapağı üzerine ele geçirildi olmadığını kontrol etmek için uzağa bölümünden ve slayt açık bölge üzerine kapağını taşıyın. Ilgili hücreler sürgü (Şekil 5B, D) çıkarılır ve LCM kapak (Şekil 5C, K) bağlı olduğundan emin olun. Belge inciMikroskop araç çubuğunda "Yakalama görüntü" sekmesine tıklayarak süreçtir.
7. Doku toplama bittiğinde, kap sağ tıklayarak kapağı çıkarın ve ardından "Taşı" seçeneğini "Boşaltma."

PEN Membran Slaytlar kapalı Bireysel Dopamin Nöronlar 6. Lazer Yakalama

1. IR ve UV lazerler her ikisini de kullanarak PEN membran slaytlar kapalı bireysel hücrelerin yakalamak için, seçeneğini "Kes ve Yakalama" Mikrodiseksiyon araç çubuğunda sekmesini. Ilgi hücreleri işaretlemek için "tek nokta" sekmesini seçin. Her hücre anahat "Kes çizgi" sekmesini kullanın. Adım 4.9 ve 4.10 açıklandığı gibi kızılötesi lazer sınamak emin olun ve düşünce kesmek için gerekli olan minimum yoğunluğunu PEN membran ve doku belirlemek için UV lazer testi (Şekil 4 ve 5)
2. Mikrodiseksiyon araç çubuğundaki "Yakalama ve Kes" sekmesini seçin. Bu tekniği kullanarak bireysel hücrelerin toplarken, olmakOnlar LCM kapağı yapıştırılmış edilmeden önce kesip eğer öncelikle bu küçük parçalar UV lazer takip IR lazer yangın emin kaybolmuş olabilir.
   NOT: Bu işlem aynı zamanda ilgi noktada IR lazer ateş elle yapılabilir ve hücreler ayrı ayrı UV lazer ile özetlenen.
3. Hücreler ayrılmış ve kapak (Şekil 6) bağlı olup olmadığını saptamak için adım 5.7, yukarıda anlatıldığı haliyle ilgi konusu hücrelerin toplanmasından sonra, lcm kapağı hareket ettirin.
4. Doku toplama bittiğinde, sağ kapağı tıklayarak ve seçerek kapağı çıkarın, sonra "Taşı" "Boşaltma."

7. Silan-hazırlık Slaytlar gelen ventral tegmental alan yakalama

1. Ilgi bölgeyi tanımlamak için, immünohistokimya için işlenmiş slayt kullanın.
   NOT: ventral tegmental alan izole edilir, bu gösteri (Şekil 7A) için.
2. Bir LCM kapağı yükleyin ve adım gibi lazerler testi4.9 ve 4.10 s.
   NOT: Genellikle, bir makro LCM kap kullanılır, ancak bir HS kapağı da (Şekil 8 bakınız) kullanılabilir.
3. Mikrodiseksiyon araç çubuğunda "LCM" sekmesini seçin, Silan-hazırlık slayt doku bölgesini (yani, ventral tegmental alan) izole etmek, ardından "çokgen-dış" sekmesini seçin. Canlı Video penceresinde ilgi bölgeyi Anahat. Toplama alanın büyüklüğüne bağlı olarak, düşük büyütme (2X Amaç) de ilgi bölgeyi anahat. Toplanması için, ancak, enstrüman 10X objektif şekilde ayarlayın ve yakalama için 10X objektif altında IR lazer önce nişan kullanır.
4. Mikrodiseksiyon araç çubuğunda - "yakalama ve kesim git" sekmesini seçin.
   NOT: Bilgisayar otomatik olarak tüm seçilen alanda (Şekil 7F, ben) boyunca IR lazer ateş edecek. LCM membran alanı boyunca yeterince erimiş değilse, lazer adam ateş olabilirually veya tüm işlem tekrarlanır.
5. Doku toplandı ne kadar iyi belirlemek için doku kapalı LCM kapağını hareket ettirin.
   NOT: Bu yöntemi kullanarak bir geçiş tipik slayt (Figure7G bakınız) arkasında bazı doku bırakır. Bu durum ortaya çıkarsa, seçim tekrarlayın ve yukarıdaki adımı yakalamak. Bu adımı tekrarlanması (Şekil 7J) toplanan doku miktarını artırabilir.
6. Doku toplama bittiğinde, sağ kapağı tıklayarak ve seçerek kapağı kaldırmak ardından "Taşı" "Boşaltma."

8. PEN Membran Slaytlar gelen ventral tegmental alan yakalama

1. Yukarıdaki gibi PEN membran slaytta dokudan ilgi bölgeyi seçmek için bir rehber olarak immünohistokimya için işlenmiş slayt kullanın.
2. Mikrodiseksiyon araç çubuğunda "Kes ve Yakalama" sekmesini seçin. "Kes Çizgi" sekmesini seçin ve immunohistoche kullanarak ilgi bölgeyi anahatmistry bir rehber olarak slayt etiketli.
   NOT: Program otomatik kap doku eklemek için IR lazer noktalar katacak. Daha kapağa doku sabitlemek için ek noktalar eklemek için "tek nokta" sekmesini kullanın.
3. 10X objektif test ateşi altında ve 4.9 ve 4.10 açıklandığı gibi IR ve UV lazer hedefliyoruz. UV lazer slayt ve bu kesim bilgisayar ekranında yere karşılık geldiğini zarı nüfuz edebilir ki sınayın. Zar ve doku kesmek için yeterli olan, ancak doku (Şekil 5) zarar vermez UV lazer gücü kullanarak.
4. Mikrodiseksiyon araç çubuğunda - "yakalama ve kesim git" sekmesini seçin.
   NOT: Bilgisayar otomatik olarak sonra kapağı ekleyin slayt PEN membran ve doku (Şekil 7C) kesmek için UV lazer ateş doku içinde tüm etiketli noktalar IR lazer ateş edecek. Ek IR erimiş noktalar yeterli tis takmak gerekebilirelle de eklenebilir LCM kapağı için dava.
5. Doku kısmında (Şekil 7C) çıkarılır ve kapağın (Şekil 7C) bağlı olup olmadığını belirlemek için doku kapalı lcm kapağını hareket ettirin.
6. Doku toplama bittiğinde, sağ kapağı tıklayın ve ardından "Taşı" seçeneğini, kapağı kaldırmak için "Boşaltma."

RNA izolasyonu 9.

1. Çekilen hücre veya doku RNA toplamak için, 37 ° C 'de 30 dakika süre ile, RNA liziz tamponu içinde LCM kap membran inkübe edilir.
   Not: HS kapaklar, bir adaptör başlıkta liziz tamponu sadece 10 ul kullanımına izin veren bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü verdiği mevcuttur. Makro kapaklar liziz tamponu içinde 50 ul gerektiren ve 0.5 ml mikrosantrifüj tüpüne doğrudan bağlanmaktadır.
2. İnkübasyondan sonra, 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine lizis tamponu döndürün.
3. O tüm hücrelerin tam parçalama sağlamak içinr dokusu, lizis tamponunda kapağı ve yer LCM kap zarının kapalı kabuğu.
4. RNA bütünlüğü test etmek için, kullanım RNA LCM RNA bütünlüğünü ölçmek için sonra slayt üzerinde ve geri kalan dokulardan izole edilmiştir.
   NOT: LCM ile elde edilen sınırlı numune RNA, bu LCM izole RNA RNA bütünlüğünü test etmek için genellikle pratik değildir dolayı, ancak, kalan dokudan RNA nedeniyle esnasında tespit, immünohistokimyasal ve zaman herhangi bir RNA bozulması iyi bir gösterge sağlar LCM prosedürü.

Sonuçlar

Şekil 6 ve 7'de ayrı ayrı mikrografıdır dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu için yeteneklerini gösterir. sürekli LCM üretilen en küçük spot büyüklüğü bir hücreyi izole etmek kapakları gibi mevcut anatomik çözünürlük 5-10 mm. spesifik hücre tiplerinin izolasyonu için tek sınırlama, hücrelerin görselleştirmek yeteneğidir. LCM tek dopamin nöronları izole yeteneğine sahip olmakla birlikte, komşu etiketlenmemiş hücre parçaları kirlenmesi, büyük olasılıkla ortaya çıkar. Bu nedenle, son numune dopamin sinir hücrelerinin bir konsantre yığını, dopamin sinir hücrelerinin saf nüfusu. Bu teknoloji ayrıca, ventral tegmental alan izolasyonu ile gösterildiği gibi, örneğin, beyin içinde ayrı çekirdekler ya da bölgeler dokusunun küçük alanlar izole yeteneğine sahiptir. Önceki yayınlar beyin dokusunda bu kullanım göstermiştir yanı sıra normal dokudan ^5,11 patolojik doku izole etmek.

, sunulan prosedürler RNA bütünlüğünü korumak için optimize edilmiştir. LCM aşağıdaki kalan RNA kalitesini belirlemek üzere, RNA, LCM aşağıdaki slaytlar üzerinde dokudan, silika esaslı spin sütunları kullanılarak, izole edilmiş ya da aseton içinde hızlı bir tirosin hidroksilaz floresan immünohistokimya prosedürü veya tespit sonrasında. RNA kalitesi ölçülmüş ve ticari olarak temin edilebilen tüm beyin RNA, RNA için değerler (Şekil 9) ile karşılaştırılmıştır. RNA kalitesi tüm beyin RNA ile karşılaştırıldığında aseton sabitleme (RIN 2.6), ardından imünohistokimya sonra düşük bütünlük LCM için kullanılan doku RNA örneklerinden (RIN mevcut değil), indirgenerek nispi azalma ile görülebileceği gibi, (RIN 8.2) S18 zirveye kıyasla rRNA S28 tepe yüksekliği. Bununla birlikte, RNA, 18S ve 28S bantları muhafaza ve gen ekspresyonu Q-PCR kullanılarak ölçülebilir.

LCM yoluyla elde edilen nöronlar, dopamin sinir hücrelerinin (50, 100 ve 200 dopamin nöronları) için elde edilen bir RNA miktarını ölçmek için, Silan hazırlık slaytlar kapalı ventral tegmental alan izole edilmiştir. RNA, silika esaslı spin sütunları kullanılarak izole edildi ve RNA miktarı ölçülmüştür. Oluşturulan standart bir eğri bağlı olarak, bir 17.3 toplam 24.8 pg ve 50.9 ug / ul 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin sırasıyla (Şekil 10A) izole edilmiştir. Q-PCR, ters transkribe edilmiş dopamin sinir hücrelerinin, bütün beyinler, RNA ve RNA bir konsantrasyon aralığı ve daha önce tarif edildiği gibi ⁵ Q-PCR kullanılarak ölçülmüştür β-aktin geninin RNA miktarını ölçmek. Bu ölçümlere dayanarak, 3.55, 6.82 ve 20.58 ug / ul 'lik bir konsantrasyon 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin sırasıyla (Şekil 10B) için hesaplanmıştır.

Dopamin nöronları izolasyonu tüm v izolasyonuna karşılaştırır nasıl göstermek içinentral LCM ile tegmental alan dopamin nöron özel genler içerir (Nurr1, tirosin hidroksilaz ve dopamin taşıyıcı) örneklerin bu iki farklı tipler, Q-PCR ile ölçülmüştür ve β-aktin ekspresyonu (Şekil 11) ile karşılaştırılmıştır. Alt CT _değerleri, ilgi konusu genin bir üst konsantrasyonu oluşturulacak için, ΔC _t azalma β-aktin göre dopamin nöron genlerinin ekspresyonunda bir artışa işaret eder. Bu, bireysel dopamin nöronlarının izolasyon dopamin nöron spesifik genlerin ifadesini yoğunlaşmaktadır nasıl gösterir. Ventral tegmental alan örneklerinde, dopamin nöron spesifik genler β-aktin ifade ama dopamin nöron genleri ifade etmeyen de tahsil edilecek diğer hücrelere (non-dopaminerjik nöronlar ve glial hücreler) olarak seyreltilir.

kızılötesi (IR) yakalama lazer kullanarak Şekil 1. lazer yakalama. küçük plastik LCM kap, bir cam slayt (Adım 1) monte edilmiş doku üstüne yerleştirilir altında bir zar bulunmaktadır. Doku veya hücre belirlendiğinde, bir IR yakalama lazer alttaki doku / hücre (Aşama 2) üzerine zar küçük bir çukur eritmek için LCM kapağı ile harekete geçirilir. LCM kapak kaldırıldığında, doku mikroskop lamı çıkarılır ve LCM kapağa bağlı kalır.

Kızılötesi (IR) yakalama lazer ve ultraviyole (UV) lazer kesme kullanarak Şekil 2. Lazer yakalama. Dokusunun büyük alanları kazanmak veya UV lazer kullanarak hücrelerin kurtarma kolaylaştırmak amacıyla, doku, bir membran ile bir slayt üzerine monte edilir dış köşesinde (PEN membran slaytlar) boyunca slayt bağlı. LCM kap t üzerine yerleştiriliro doku ve IR yakalama lazer kap membran eritmek ve LCM kap doku eklemek için kullanılır (Adım 1 ve 2). UV kesici lazer daha sonra sürgü membran ve kapak doku slayt çıkarıldı ve LCM kapağın (Aşama 5) üzerinde kalır çıkarıldığında, böylece doku (Aşama 3 ve 4 olabilir) kesilmesi için kullanılır.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Sistemi Yol Haritası 3. Şekil. Bu Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Sistemi bir seferde 3 kaydıraklı için yer vardır. Slaytlar mikroskop içine yüklendiğinde, her slayt için düşük büyütme Yol Haritası görüntüleri oluşturulur. Yol haritası görüntü üzerinde bir alanı seçme o bölgeye Canlı Görüntü penceresini taşır. Gösteri amaçlı, fare mesencephalon 3 kaydıraklı üzerine 10 mikron bölüme bölümlere ayrılmıştır. Birinci sürme tirosin hidroksilaz immunoreactivi için etiketlendity bir Chromagen (A) olarak diaminobenzidinin kullanarak. Bölümler Silan hazırlık slaytlar (B) veya PEN membran slaytlar (C) ya da monte edilmiştir. Bu slaytlar ikisi de hızlı floresan tirozin hidroksilaz immunhistokimya ile etiketlendi. (C) 'de oklar cam slayt PEN membran bağlanmasını göstermektedir. Bu sınır dışında hiçbir doku LCM ile toplanabilir.

Şekil 4. IR yakalama lazer kullanarak. IR yakalama lazer LCM kap doku eklemek ve doku geri kalanından çıkarmak için LCM kap membran eritmek için kullanılır. IR yakalama lazer altta yatan doku ve cam slayt irtibata yeterince LCM kap membran eritmek için yeterli güçte olmalıdır. Lazer membran eritmek için yeterli zaman görüntü üzerinde gösterirslayt (iki noktalar sol). Erimiş membran cam slayt değdiğinde, bir kalın siyah anahat (sağ nokta) görülebilir. lazerin yoğunluğu Güç (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 mikro saniye) ve lazer arasında Tıklama değiştirerek ayarlanabilir. Buna ek olarak, ayrıca membranın eriyik aynı noktada İR lazer atış tekrarladı. IR lazer amacı her zaman LCM kap taşınır ayarlanması ya da nesnel değiştirildiğinde gerekiyor. Ölçek çubuğu = 100 mikron.

Şekil 5. lazer kesim UV kullanma. UV kesme lazer PEN membran ve dokuya kesmek için kullanılır. Zarından kesilmiş ve UV lazer dokuya zarar çünkü doku tespit edilmesi gerekmektedir için gerekli minimum yoğunluğu Kullanımdan önce. Yukarıda, farklı UV lazer şiddetlerde üç noktalar (Oklar) ile gösterilir 10 mikron bölümden, kalın bölümler için orta nokta ve çok yüksek UV lazer yoğunluğu gösteren sağ nokta için yeterli sol nokta boyutu. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil IR lazer kullanarak tirozin hidroksilaz İmmünoreaktif nöronların 6. Doğrudan izolasyon. Dopamin nöronları tirozin hidroksilaz (A) hızlı floresan etiketleme sonra gösterilmektedir. İR lazer bu nöronların (D) üzerinde LCM kapak zarı erime çalıştığı zaman, kapağın çıkarılması sürgü (B, D), kapalı bu hücreleri seçer. LCM kapağı (C, F) bağlı olarak bu nöronlar sonra görüntülenebilir. Ölçek çubuğu = 250 mikron.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil IR ve UV lazerler kullanarak PEN membran slaytlar gelen tirozin hidroksilaz İmmünoreaktif nöronların 7. Doğrudan izolasyon. Tirozin hidroksilaz etiketli nöronlar üzerinde (A) gösterilmektedir. Bu nöronlar IR lazer kullanarak LCM kapağı takılı ve UV lazer (B) kullanarak PEN membran slayt kesilebilir. Ölçek çubuğu = 250 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Dolaylı Şekil 8. tirosin hidroksilaz immüno reaktivitesi ile ventral tegmental alan izolasyonu. ventral tegmental alan dopamin nöronlarının Yer standart immünohistokimya teknikleri kullanılarak (A ve E) ile bir bölümünde görselleştirildi. Bu immünohistokimya etiketli bölümde, boyanmamış bitişik bölümleri (B, F), ventral tegmental alan bulmak için bir şablon olarak kullanıldı. UV lazer kullanarak, ventral tegmental alan kızılötesi lazer ile lcm kapağa bağlanır ve UV lazer (C ve D) ile sürgü kesilmiş ve HS LCM başlığı (D) bağlı olarak gösterilmiştir edildi. Sadece kızılötesi lazer kullanarak Silan-hazırlık slaytlar izole ventral tegmental bölge de bir makro kap (FK) bağlı olarak gösterilmiştir. Birden fazla girişim bu bölgede (G ve J karşılaştır) bir doku en toplamak için gereken dikkat etmek gerekir. Ölçek çubuğu = 500 mikron.pload / 52.336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 9. RNA kalitesi. Örnek elektroferogramlar ve ticari olarak temin edilebilen tüm beyin RNA (A) ve RNA aseton tespit ve LCM (B) sonra, kesitlerden izole edilebilir veya hızlı fluoresan tirosin hidroksilaz immünohistokimya ve LCM (C) bağlantılı jel ve görüntüler. RNA kalitesi tüm beyin RNA ile karşılaştırıldığında, imünohistokimya için işlemden bölümlerde azaltılmasına rağmen, elektroferogramlar rRNA S18 ve S28 tepe noktası mevcudiyetiyle göre çok sağlam RNA göstermektedir. Tüm beyin RNA yoğunluğu 8.2 RIN ile 6,487 pg / ml idi. Aseton işlem görmüş doku, RNA konsantrasyonu, 2.6 bir RIN ile 5,036 pg / ml idi. RNA, immünohistokimya saat sonra elde edilen Reklam 4,474 ug / ul ve RIN bir konsantrasyonu mevcut değildi.

Şekil 10. RNA miktarı. LCM elde nöronlarda RNA miktarını belirlemek için, RNA konsantrasyonların standart eğrisi fluorospectrometer ve Q-PCR kullanılarak üretilmiştir. Fluorospectrometer ölçümleri (A) için, büyük grafik RNA miktarlarının yüksek aralığını gösterir ve küçük grafik 10 pg / ul aşağı bu testin duyarlılığını göstermektedir. 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin elde edilen RNA konsantrasyonları sırasıyla 17.3, 24.8 ve 50.9 ug / ml, idi. RNA miktarlarda (B) ölçülmesi için Q-PCR kullanarak, RNA konsantrasyonları 50, 100 ve 200 dopamin sinir hücrelerinin elde sırasıyla, 3.55, 6.82 ve 20.58 ug / ul'dir.

es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/>
Bireysel dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu ile dopamin nöron özel genlerin Şekil 11. Konsantrasyon. Dopamin sinir hücrelerinin örnekleri dopamin nöron spesifik genin (Nurr1, tirosin hidroksilaz ve dopamin taşıyıcısının) ve β-aktin C arasında _t (ΔC _t) farkı LCM izole ventral tegmental alan gösterilmiştir, tüm ventral tegmental bölgesinden alınan kesitlerden ifade ile karşılaştırıldığında. Alt CT _değerleri, ilgi konusu genin bir üst konsantrasyonu oluşturulacak için, ΔC _t azalma olacak β-aktin için diğer hücreler (non-dopaminerjik nöronların, glia hücreleri) göreli dopamin nöron genlerinin ekspresyonunda bir artışa işaret eder β-aktin ifade ama dopamin sinir genleri ifade ettiği ventral tegmental alan örneklerde toplanabilir.

Tartışmalar

LCM bir mikroskop lamı ve RNA, mıkroRNA, DNA ve protein daha sonra izolasyon hücre veya doku kesitlerinin bir doku bölgelerin somut popülasyonlarının diseksiyon için güçlü bir tekniktir. Bu tekniklerin duyarlılığı arttırır ve gerekli başlangıç ​​malzemesi miktarı azaltılır gibi mikrodizi, yeni nesil bir RNA dizisi, DNA ve proteomik epigenetik analizi, yüksek verimli teknolojileri kullanılarak analizi ile kombinasyon halinde LCM kullanımı giderek daha yaygın hale gelmektedir ^8-12. LCM ile, daha iyi bir anatomik çözünürlüğü için bir örnek elde edilir, ve bu örneklerin alt baş tedbirlerden anlama büyük ölçüde artırılmıştır. LCM ile bir uyarı, ilgi hücreleri ancak zorunlu hücre saf nüfusunun konsantre örneği sağlamasıdır. hassas sınırları komşu doku bazı kirlenme var olacağı anlamına. Ancak, bu teknik ilgi hücreleri konsantre yapardoku ve hücreleri çevreleyen ile ilgili etkilerini en aza indirmek ve ilgi hücreleri üzerinde deneysel etkileri maksimize etmek.

Dolaylı İmmünohistokimya karşı doğrudan

LCM anda RNA sağlam tutarak, izolasyon ve RNA ölçümü için öncelikle kullanılan olduğundan çok önemli bir kriterdir. RNA bütünlüğünü korumak (Şekil 10) RNA düşüren doğrudan doku leke gereğini kaldırır doku diseksiyonu rehberlik dolaylı immünohistokimya kullanımı asıl gerekçesi de budur. Deneysel soru, ancak, bu, dopamin nöronları gibi hücreler, belirli bir popülasyonun izole gerektirdiğinde, doğrudan floresan immünohistokimya gereklidir. Hızlı immünohistokimyasal etiketleme protokolünü kullanarak işlem sırasında RNA bozulmasını en aza indirebilirsiniz. Kısa inkübasyon süreleri, birincil ve ikincil anti-yüksek konsantrasyonlarının kullanımı nedeniyleorganları, yaklaşık 10-20 olan konsantrasyonları 2 saatlik inkübasyon geleneksel immünohistokimya için gerekli olandan daha yüksek kat. Bununla birlikte, uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç durumunda, Brown ve Smith, RNA bozulmasını inhibe eden ve uzun inkübasyon süreleri (20 saat ^{kadar), 13} ile iyi kalitede RNA elde etmek için yüksek tuz tampon kullanılır. Bu yaklaşım, aynı zamanda bir LCM sistemine doku etiketleme ve alma erişim arasında gerekli önemli bir zaman varsa kullanılabilir.

PEN zarın, Silan-hazırlık ve kaplanmamış cam slaytlar - slaytlar seçimi

LCM kaplanmamış cam slaytların kullanımı ¹⁴ bildirilmiştir. Bu kaplama yeterince doku kaybı olmadan immünohistokimya için slayt doku ekler ama hala slayt LCM kapaklar doku eki ve kaldırılması için izin verir gibi Laboratuvarımızda, Silan-hazırlık slaytlar, optimal bir seçim olduğu tespit edilmiştir . Kaplamasız cam slaytlar varimmünohistokimyası prosedürü ile bazı doku kaybı gösterdi. Dolaylı immünohistokimyasal kullanılırsa, ancak doku tutma daha az sorun olur. Silan-hazırlık slaytlar kapalı düzgün dehidratasyon, yakalama hücreleri veya dokusu ile ilgili bir sorun olmamıştır. Bu yazıda anlatılan izole nöronların veya beyin bölgelerinde çeşitli yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bireysel dopamin sinir hücrelerinin izole edilmesi için, silan-preparatif slaytlar kullanımı iyi optik avantajı vardır ve PEN membran slaytlar daha az pahalıdır. Orada yetersiz dehidratasyon (aşağıya bakınız) ve bazı doku slayt üzerinde kalabilir, eğer dezavantaj bazen yakalayan hücreler zor olabilir ki. PEN membranlar slaytlar avantajı IR ve UV lazer lazer kombinasyonu kullanılarak dopamin nöronları tahsil edilecektir sağlar olmasıdır. Cam slaytlar daha dehidratasyon daha az bağımlı olduğu gibi PEN membran slaytlar hücreleri toplamak için Başarısızlık neredeyse hiç oluşur. Bir Ek bir avantaj, kızılötesi lazer ile cam slaytların kapalı nöronlar yakalamak için bir çevreye göre UV lazer daha yakından ilgi nöronların şekle yaklaştıkları için kullanılabilir olmasıdır. Doku bölgeleri izolasyonu için, PEN membran slaytlar üstündür ve ilave maliyet haklı. Membran üzerinde kesip tüm doku tamamen kaldırılması Bu yaklaşım sonuçları, tek başına IR lazer kullanarak ve kalın doku bölümleri toplanabilir doku geniş bir alanı yakalama daha hızlıdır. Ancak kızılötesi lazer kullanarak LCM kapak zarı tamamen tüm doku alanı üzerine erimiş olması gerekir. Ayrıca, doku eksik koleksiyonu tipik ve genellikle birden girişimleri gerektirir. Bu PEN membran slayt doku izole daha uzun sürer rağmen mevcut doku cam slayt veya UV lazer zaten ise, doku çoğu (Şekil 8J) tahsil edilebilir bu uygun bir seçenek olduğunu, mevcut değildir.

ove_content "> Kritik adımlar

% 100 etanol inkubasyon en önemli adımlardan biridir. Silan-hazırlık slaytlar hücreleri toplamak için dokusunun tam dehidratasyon gereklidir. Bu nedenle,% 100 etanol inkübasyon çoğunlukla ilişkili kaldırılmaz herhangi bir su, slaytlar hücreleri almak yeteneğini etkiler. Bu sorunu gidermek için, sık sık dehidratasyon etkileyebilir önceki yıkama adımlarından hava veya transfer suyun emilimi% 100 etanol çözümleri değiştirin. Buna ek olarak, moleküler elekler, bir su kontaminasyonu absorbe etmek için kullanılır. LCM sistemi ideal düşük nem koşulları sağlamak için bir nem alıcı ile küçük bir odada yer almalıdır.

İyi karyostat bölümleri düzgün LCM için kritik öneme sahiptir. Bölümler minimize dokuda kıvrımlar düz olması gerekir. LCM kapağı arasındaki mesafeyi artırmak ve t temas engellemek olacaktır dokuda KıvrımlarO doku. Daha sonra, yeterli bir doku üzerine zar kap eritmek için zor olur. Cam slaytlar için, tipik haliyle kesit kalınlığı 6 ve 12 um arasında olması gerekmektedir. Kalın bölümler PEN membran slaytlar ile yakalanabilir.

LCM mikroskop slaytlar çok hassas doku diseksiyonu ve hücreleri yapmak için bir teknik kapasiteye sahiptir. Doku parçaları brüt diseksiyon kıyasla dramatik olarak daha fazla analiz çözünürlüğünü artırır. LCM zaman ve yoğun emek olabilir rağmen, bu kapsamlı eğitim veya uzmanlık ve gerektirmez, diğer yüksek verimli teknolojiler ile birleştiğinde ayrı hücreler veya anatomik bölgeler kullanıldığında, büyük ölçüde biyolojik sürecin anlayışı geliştirmek olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System	Life Technologies, Grand Island, NY	Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0213
PEN Membrane slides	Life Technologies, Grand Island, NY	s4651
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Molecular Sieve	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, Grand Island, NY	R11490
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780