Fare Embryolarının üzerinde Utero içi kardiyak Domates-lektin Enjeksiyonlar Renal Kan Akışı Ölçer için

Özet

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Özet

oluşumu ve (dışında glomerüllerden) böbrek kan damarlarını geliştirme perfüzyon ölçüde understudied edilir. Damar gibi reçine atmalarını, in vivo ultrason görüntüleme ve mikro-diseksiyonu olarak perfüzyon haritalama teknikleri arasındaki yakın ilişkiyi gösteren sınırlı olan, (de novo damar oluşumu) ve vaskülogenez (büyük damarların kapalı dallanma olan) anjiyogenez yoluyla geliştikçe Embriyonun içinde bu iki süreç ve gelişmekte olan böbrek yapıları. Burada, biz böbrek perfüzyonunun ontogenezini ölçmek için fare embriyoları üzerinde utero içi kardiyak ultrason rehberliğinde FITC etiketli domates lektin mikroenjeksiyon içinde prosedürü tarif. Domates lektin (TL) hasat embriyo ve böbrekler boyunca perfüze edildi. Nefron atalarıdır, nefron yapıları, üreter epiteli ve damar: dokular dahil olmak üzere çeşitli böbrek yapılar için ortak boyandı. E13.5 büyük kalibreli damarları başlayan, ancak periferik perfüze edildigemi unperfused kalmıştır. E15.5 E17.5 ve tarafından, küçük periferik damarlar yanı sıra glomerüller perfüze hale başladı. Bu deneysel teknik, embriyonik gelişim sırasında damar kan akışının rolü üzerinde çalışılması için kritik önem taşır.

Giriş

Embriyonik gelişimi sırasında iki ayrı, ama aynı anda, vasküler işlemler gerçekleşir: anjiogenezisi, süreci bir gemi konut endotel atalarıdır ^1,2 den gemilerin de novo oluşumu büyük bir önceden var olan damar, ve vaskülogenez, yetişen bu sayede. Ikinci büyük ölçüde o olmadan gerçekleşmesi düşünülmektedir ise sırasıyla, eski, kan akımı ile eş anlamlıdır.

Kan damarı oluşumu eş zamanlı, böbrek progenitör hücre sentezi, çoğalması ve farklılaşması bir döngüsel ve dinamik bir süreç embriyonik gün 9.5 (E9.5) açılmak başlar. Bu noktada üreter tomurcuğu (UB) metanefrik mezenşimi (MM) çevredeki içine dorsal işgal ve Doğum ³ kadar devam eder. Hızla metanefrik kap mezenşimi yoğuşmalı içine UB dallanma tekrarlanan böbrek fonksiyonel birimleri, nefron oluşumunu başlar. UB ve nef her yeni nesilron, eski kuşaklar daha sonra öncelikle damar-yoğun ortamlarda daha olgunlaşmasını ve farklılaşmasını geçiren iç kortikal ve medüller bölgeler, içine yerinden edilir. Dressler ve ark. ³ ile kanıtlandığı gibi, bu embriyolojik işlemi, UB ve MM, ve hücre dışı faktörler ^3-6 sayısız arasında çapraz olarak, endüktif sinyal çökeltilir. İki yakın zamanda incelenen dışı gelişen pankreas içindeki faktörler ve böbrekler oksijen gerilimi ve kan akışını ^7,8 bulunur. ikinci böbrek gelişimi ile ilişkili olarak aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilecektir.

Kan akışı, potansiyel nefron progenitör hücre farklılaşması, hem de diğer organogenez süreçleri, embriyonik kan akımı haritalama hassas ve doğru bir yöntem oynadığı endüktif rolü ortaya koymak için de çok önemlidir.

Kan akışını ölçme alternatif yöntemler ul reçete dahiltrasound görüntüleme ve reçine ^9,10 atmalarını. Sonuç, bu modlar doğal eş kan akımı arasındaki zamansal ve mekansal juxtapositions açıklayacak ve hücre farklılaşmasını kök onların kapasite eksik gösterilmiştir. Reçine kalıplar, örneğin, ancak bu tür oluşum safhasındaki zaman noktalarında olduğu gibi olgun olmayan kaplar, içinde, yetişkin doku içindeki damar desenli geçerli bir model sağlayan, kaplar büyük ölçüde az gelişmiş ve sızan bulunmaktadır. Bu nedenle, reçine, çoğu zaman gözenekli, küçük damarlarda içinde tutmak için başarısız atmalarını.

Bu belirgin engeller için, diğerleri arasında, biz ultrason rehberliğinde böbrek gelişimi bizim soruşturma içine in vivo içi kardiyak embriyonik domates lektin (TL) mikroenjeksiyon dahil etmek seçti. Bu prosedürde, biz zaman uyumlu E11.5, 13.5, E15.5 ve E17.5 zaman noktalarında fare embriyoları sol ventrikül içine TP çözeltisi 2.5 ul ile dolu bir monte mikropipet iğne kılavuz için, bir ultrason probu kullanmaktadır. E17Iğneler daha gelişmiş embriyo nüfuz için yeterince güçlü değil gibi .5 son gelişimsel yaş.

Bu mikroenjeksiyon yönteminin avantajları bol miktarda bulunmaktadır. Ultrason eşliğinde mikroenjeksiyon kesin embriyonik sol ventrikül içinde bir enjeksiyon iğnesinin konumlandırma, hayvan, kalp minimal hasar ve çevreleyen dokuların atan kalbine çözümün pasif ve kontrollü atılmasına, ve ani kalp yetmezliği kaçınma ve ölüm veriyor embriyo tam vücut perfüzyon önce. FITC-işaretli TL kullanımı ile, herhangi bir perfüze damar da endotel apikal zar boyunca işaretleyici koruyacaktır. Immunohistokimyasal ile birlikte, PECAM (CD31, Trombosit endotel hücre adezyon molekülü) ve diğer çeşitli vasküler belirteçleri kullanarak, açıkça edebiliyoruz perfüze ve un-perfüze gemilerin arasında ayrım yanı sıra çevre dokulara herhangi bir anormal boyama karakterize.

Protokol

NOT: Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tüm deneyleri onaylamıştır.

Ultrason-mikroenjeksiyon Cihazları ve Embriyolar 1. Hazırlık

1. Sahne, montaj ve prob (Şekil 1) yanı sıra cerrahi aletler (Şekil 2) ayarlayın. 37 ° C'lik bir ısıtma banyosu içinde yer fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi (pH 7.4). Tabanı yoluyla bir ikinci esnek 25 G iğne takılı 1 ml şırınga kullanılarak, mineral yağ ile tamamen mikroenjeksiyon iğne doldurun.
2. Dönme üzerine iğne Fix kolunu monte ve madeni yağ çözeltisi boş iğne. TL çözeltisi 2,5 ul yeniden doldurun. Hava kabarcığı enjeksiyon iğnesi içinde mevcut olduğundan emin olun. Uzakta aşamasından, duvara doğru iğne kolunu döndürün.
3. Izofluran sürekli infüzyon yoluyla anestezi odasına hamile anne anestezisi. Anne bilinçsiz hale olduğunda, c konumlandırılmış burun tüp anestezi transferiburun tüp içinde burnu ile yatar pozisyonda audal aşamada yan ve yer annesi tam anestezi devletin bir devamı sağlamak için.
4. 45 ° açıları, ya da elleri ve ayakları ile Bant bacaklarda dinlenmiş ve üstünlük EKG / Sıcaklık monitör sekmelerini konumlandırılmış. Hamile baraj sürekli o anestezi sağlamak için izlenmesi önemlidir yeterlidir ve gözlere uygulanan bu merhem kurutma azaltmak için.
5. Yavaşça herhangi bir aşırı bir ürün ve saç kaldırmak için% 70 etanol-doymuş pamuklu sonra tekrar kuru pamuklu silin, ve, anne karnın alt genelinde epilasyon ürünü uygulayın. Kesi yerinde (Şekil 3) tüm saç kapalı karın cildi temizlemek için emin olun.
6. Ince cerrahi forseps ve makas kullanılarak gebe anne üzerinde bir laparotomi gerçekleştirin. Herhangi bir büyük damarları ya da visseral organları kesme önlemek için dikkat edin. 1.5-2 cm vajina üzerinde, ilk epidermis düz kesi yapmak ve approximat için kaburga doğru kesilmiş devamely 2-3 cm. Viseral organlar ve rahim saccules iç göstermek, aynı uzunluğu boyunca, deri altı membran Açığa linea alba ("beyaz çizgi") (Şekil 3) bulmak, ve ilk kesi paralel kesilmiş.

Embriyolar 2. Ekstraksiyon

1. Anne ve embriyolar manevra 6-inç pamuk uçlu aplikatör kullanın. Yavaşça kesi açılması dışında ilk embriyo işlemek için aplikatör ile cilt üzerinde (zorlamayın) itin. İlk embriyo Keseciklerin çıkarılmasından sonra, yavaşça ve yavaş yavaş yoluyla ve annenin dış üzerine uterin boynuz kalanını çekin. Bu aşamada kesikten bağırsak ya da diğer organlara çekerek kaçının.
2. Embriyoların ölçmek ve yavaşça anne geri sol uterin boynuz yerleştirin. Sonra boynuz vajinadan embriyo saccule sağdaki ile başlayan ve aşağı hareket geri anne içine doğru uterin boynuz yerleştirerek başlar. (Sadece iki embriyo maruz kalması kadar Fi, bu devamGüre gösterir 4). Son olarak, bir yukarıda sütun ve paralel pozisyon embriyolar rahim dolaşımını kesmek için değil haberdar olmak, çizgi insizyon.
3. Kollar ve gövde, aynı zamanda bacak ve kuyruk arasında kil blokları ve pozisyon yerleştirin. Kil yüzeyleri laparotomi insizyon ile yaklaşık seviyede olduğundan emin olun. 37 ° C PBS ile fenestre Petri kabı ıslatın.
4. Sol el (embriyolar fenestrasyonu paralel) ile sağ el ve fenestre Petri kabı ile uzanan forseps kavrayın ve Petri kabı üst, fenestrasyonu aracılığıyla kapalı forseps ~ 5-cm getirmek. Tamamen fenestrasyonu örgü yırtmadan açın forseps.
5. Embriyolar üzerinde ellerini Manevra ve iki embriyo saccules üzerinde görüş odaklanmak. Olmadan (ya da hafifçe) yarıktan kaydırın ve annenin karın üzerine Petri kabı set, fenestrasyonu meshing veya forseps ile saccules dokunmadan. Forseps hala uzatılmış, (her iki tarafta ve her embriyonun üssünde oturması için Şekil 5 Fenestralı örgü manipüle ) ve yarık açılması dışarı forseps çekin.
6. Sonraki, (Şekil 6) kısma veya embriyolar zarar vermeden, Petri kabındaki duvar içeren mavi lastik yerleştirin. Emin kil bloklar sıkıca Petri kabı, embriyo ve kauçuk içeren duvar dengeleme emin olun. Fenestralı geçmelerine sızıntıları kontrol ederken embriyolar tamamen (Şekil 6) batık kadar Son olarak, 37 ° C PBS ile Petri kabı doldurun.

3. Enjeksiyon Yöntemi

1. Sonra alt enjeksiyon anne ve embriyoların aşağı Z-seviye ayar düğmesini (Şekil 1) kullanarak sahne ve prob ucu sola ve altında iğne ½ cm, enjeksiyon iğnesi döndürmek ve kol monte ve ultrason probu ile doğrudan hizaya (Şekil 7) . 45 ° uzakta prob iğne-kol (değil iğne) itin. Çanak veya ultrason probu ile iğne ucu vurmak için dikkatli olun.
2. Ultrason p, geri orijinal yüksekliği enjeksiyon sahne kaldırındoğrudan embriyolar Probe üzerinde elbise biraz batık ve embriyonik doku 3-4 mm'lik içinde olmalıdır. Kullanım X & Y sahne ayar düğmeleri (Şekil 8) sistematik dayak embriyonik kalp bulmak için embriyo / anne / sahne konumunu değiştirme.
3. Doğrudan ultrason ekranının Merkezi çizilmiş siyah bir merkez hedef işaretleyici (*) gözlemlemek. X & Y sahne ayar düğmeleri kullanarak sol ventrikül (tercih) veya atrium (Şekil 8) bulun ve ardından yükseltmek veya ultrason ekranında siyah merkez işaretleyici üzerinde tam enjeksiyon hedef konumlandırmak için sahneye döner düğmesini kullanarak sahne indirin.
4. Ultrason ekranında kapalı, sağ embriyo hareket X sahne ayar düğmesini kullanın. ½ uzak cm ve ultrason probu 90 ° (Şekil 7), mikroenjeksiyon iğne yeniden konumlandırmak ve tekrar yerine kol.
5. Mikroenjeksiyon açıkça ucu al ayar düğmeleri (Şekil 9C-G), pozisyon iğne monte kullanmamerkez işaretleyici ile igned. İğne ucu doğru düzlemde odaklı sağlamak için, ve X, Y, ve mikro-iğne Z vektörleri (Şekil 9C'de & EG düğmeleri kullanarak) enjeksiyon açısını ayarlayın. Sadece "enjeksiyon" düğmesini (Şekil 9F) kullanarak mikroenjeksiyon iğne geri çekin, dikkatli değil, diğer boyutlarını ayarlamak için.
6. Yine, tam ultrason ekranında merkez işareti hedef geri prob altında sadece X ince ayar aşaması topuzu hareket embriyo kullanarak. Sol ventrikül aynı X, Y ve Z düzleminde şimdi olduğundan emin olun.
7. Mikroenjeksiyon sadece "enjeksiyon" düğmesi monte ile Sonraki, yavaş yavaş mikroenjeksiyon iğne ile embriyo delinme ve yavaş yavaş sol ventrikül içine ucu getir. Kez (Şekil 2A & B) "boş" tutan ve "dolgu" dokunarak, boş uyarı bip sesleri sol ventrikül içine kadar veya TL çözümünün tam 2.5 ul enjekte edilir. Şu andaenjeksiyon kalp odasına giren TL (Şekil 10) iğne ucu kaynaklanan bir gölge gözlemlemek. Tersinde, hızlı enjeksiyon tamamlandığında mikroenjeksiyon üzerinde "enjeksiyon" düğmesi (Şekil 9F) monte dönen mikroenjeksiyon iğne geri çekin.
8. Bir sonraki embriyo Devam ve Bu adımlarda sonra, kalan embriyolar için bu yordamı yineleyin ve nihayet geri baraj karın içine son embriyolar yerleştirin. Odacık kutusuna anestezi geçin ve hafifçe son enjeksiyon zamanı 15 dakika burada anneyi taşıyın.

4. Hasat Embriyolar ve Analiz

1. Servikal dislokasyon yoluyla baraj Kurban. Kolayca anneden rahim boynuzları kaldırmak için laparotomi kesi genişletin. Uterus kesesi içinde embriyolar tutun. Soğutulmuş PBS embriyolar yerleştirin.
2. (Eğer genotiplemede için gerekli toplamak doku) uterus kesesinin embriyolar incelemek ve tüm embriyo yerleştirmek in,% 4 paraformaldehit (PFA), gece boyunca, daha sonra içine% 30 sukroz, gece boyunca, orta kesit kriyostat dondurma. Sonra cryosection kesmek ve immünohistokimyasal analiz için slaytlar üzerine yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, dokuların kullanımı,% 100 metanol dehidrasyon% 4 PFA içinde tespit izleyerek tüm montaj.
3. Immünohistokimyasal analiz için OCT kaldırmak için PBS içine cryosections yerleştirin. Daha sonra, 30 dakika boyunca,% 10 normal eşek serumu ile bölümleri bloke eder. Daha sonra 1 ile PECAM birinci antikor ekleyin: 100 seyreltme, gece boyunca 4 ° C'de ilave edildi. Bir sonraki gün, 10 dakika her biri için PBT 3 kez slaytlar yıkama ve ikinci eşek anti-fare 594 ekleyebilir ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
   NOT: Bu ultrason ve mikroenjeksiyon optimizasyonu ve koordinasyonu gerektiren son derece zorlu bir tekniktir. Orada bu teknikle ilgili bir çok dik bir öğrenme eğrisi ve bir uzman olmadan önce mentorluk enjeksiyonların 4-6 hafta gerektirir.

Sonuçlar

Vasküler oluşumu böbrek gelişmekte akışı öncesinde

(Böbrek de dahil olmak üzere), embriyonik dokunun büyük bir kısmı daha erken dönemde embriyo zaman noktalarında, yoğun damar (unperfused ve perfüze her ikisi) içerir. Gelişmekte olan böbrek içinde iyi göstergesi ve analiz kan akımı biz utero embriyonik intrakardiyak mikroenjeksiyon içinde bir yöntem kullanılmıştır. Bir laparotomi yoluyla çıkarılması ve bir tek uterus Keseciklerin maruz kaldıktan sonra E17....

Tartışmalar

Mikroenjeksiyon anestezi ve zaman çerçevesi

Annenin anesthetization ile ilgili olarak, bu hava akımı sabit (2-3 L / dk) ve düşük PSI'de tutmak esastır. sedatif akışı / dak yaklaşık 1,75-2 L tutulmalıdır. Aynı anda, enjeksiyonlar yer aldığı zaman dilimleri yakından takip ve her çöp için kontrol edilmelidir. Her çöp için enjeksiyon prosedürü 45 dakika altında tutulmalıdır. Her embriyo gövdesi ve ilgi organı boyunca kontrollü ve değişmez perfüzyon kolayl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10