Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Özet

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Özet

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Giriş

bağırsak epitel kanser ve kök hücreleri üzerinde araştırma geniş ilgi çekmek için neden olmuştur en hızlı çoğalan vücut dokuları biridir. 2009 yılında bir teknik 3 boyutlu bir yapı ¹ korunması, matrigel küçük bağırsak kript uzun ömürlü kültürlerini oluşturmak için yayınlandı. Bu yapılar, bağırsak organoids orta BMP-sinyal yolu önleyicisi Noggin (Nog) de dahil olmak üzere tanımlanmış bir büyüme faktörü, bir dizi ile takviye çevreleyen, standart teknikler kullanılarak kültür edilebilir olarak adlandırılan 1 (Rspo1) rspondin Wnt-sinyal yolu güçlendirici ve epidermal büyüme faktörü (EGF) tüm bağırsak proliferasyonunu ^2-4 arttırdığı bulunmuştur.

Organoids, kök hücre hiyerarşi korumuştur, bunlar olmayan mutasyona olduğunu yönleriyle geleneksel kanser hücre hatları aşmak doğmakta olan küçük int bulunan tüm hücre soylarının içine sağlam hücresel kutuplaşma ve sergi farklılaşmasını görüntülerestinal epitel. Bunlar transgenlerin taşımak için aktarılacak olan veya RNA interferans ⁵ oluşturur olduğundan, eksiksiz ve hız yönü de, transjenik fareler kullanılarak deneyler outweighing, spesifik genetik elemanları incelemek için kullanılır. Organoids transjenik ifadesi sıçangil retroviral veya lentiviral vektörler ^6,7 kullanarak gerçekleştirilebilir. Nedeniyle mitotik hücre özel olarak ⁸ transduse edebildiği sıçangil retrovirüslerin sınırlamaları, lentiviral transdüksiyon daha sık örneğin organoids olarak enfekte zor olan hücreler için kullanılır.

Viral transdüksiyonlu ve stabil bir şekilde eksprese eden transgenik organoids analiz eder ve immünohistokimya kantitatif RNA dahil olmak üzere, akış aşağı analizler çok sayıda için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, primer intestinal epitel hücrelerinden organoids kültürü özel laboratuvar şartlarına olmadan uygulanması kolay bir rutin tekniği haline gelmiştir, ve ce roman standart haline gelmiştirbağırsak epiteli üzerinde araştırma ll kültürü.

Viral iletimi ve organoids sonraki mansap analiz teknikleri gerçekleştirmek ve kültürlü organoids lentiviral transdüksiyon için yöntemler göstererek, bu video protokolü oluşturulan organoid deneyler yardım için sıkıcı bulunmaktadır. Biz ayrıca verimi artırmak ve dolayısıyla RNA teknikleri veya immunhistokimya kullanan alt analiz performansını artırabilirsiniz ne kadar doğru işlem organoids arasında gösteriyor. Tarif edilen teknikler de kolon organoids tatbik edilebilir, ancak protokol, ince bağırsak kript türetilen organoids sadece kullanılmıştır.

Protokol

Transfeksiyon Reaktif olarak polietilenimin (PEI) hazırlanması 1.

1. _H2O, 100 ml PEI'nın yaklaşık 150 mg çözülür
2. Solüsyon berrak hale gelir ve tam olarak çözülene kadar karıştırın kadar HCI eklenerek pH 7.4 çözeltisi ayarlayın. Bu durum, 10 ila 60 dakika sürer ve 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar su ilave edilebilir.
3. Ne zaman açık, 5 ml hacimde ° C derin dondurucuda bir -80 steril 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden PEI çözüm filtre.

Lentiviral Parçacıkların 2. Üretim

1. Gün:

1. 162 ^cm2 şişeye ya da hücre hattı kültürü ortamında büyük bir petri (% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM glutamin takviyesi ile desteklenmiş DMEM) içinde% 60 -80% konfluansa Split HEK293T hücreleri.

Gün 2:

2. Birlikte ekleyerek toplam plazmid DNA 45 ug içeren DNA transfeksiyon çözüm hazırlayınLentiviral ambalaj vektörleri (7 pVSVg ug, pRSV rev 5 ug; 13 pMDL ug) ilgi faiz veya shRNA genini kodlayan lentiviral plazmid ve 20 ug. DMEM ile 1 ml 'lik bir hacme kadar ayarlayın.
3. DMEM 930 ul 1 mg / ml bir PEI 90 ul ekleyerek PEI transfeksiyon çözelti hazırlanır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
4. PEI solüsyonuna DNA transfeksiyon solüsyonu ekleyin. Vorteks birkaç kez ters çevirin ve DNA transfeksiyon çözelti elde etmek için, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe veya.
5. HEK293T hücrelerine, DNA transfeksiyon solüsyonu 2 ml damla ve 37 ° C nemlendirilmiş bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 4 saat boyunca inkübe edilir.
6. 4 saat sonra, PEI çıkarmak için kültür ortamı yenileyin. Bu yeni orta eklemeden önce Hücreleri yıkamak için gerekli değildir.
   NOT: 4 saat daha uzun PEI olan sitotoksik ve inkübasyon süreleri HEK293T hücrelere zarar verebilir.

4. Gün:

7. Supe değiştirinyeni kültür ortamı ile rnatant. Süpernatant (virüs içeren) tutun; Bu aşamada 2.10 kullanılacaktır.
8. 15 ml'lik bir şişe içinde süpernatant koyun. 500 x g'de 5 dakika boyunca ölü hücreleri, santrifüj kaldırın.
9. Büyük bir 60 ml şırınga kullanılarak 0.45 um filtre içinden yüzer itin. 4 ° C 'de bir gece boyunca muhafaza ediniz.

5. Gün:

10. Süpernatant ikinci parti toplayın; adımlarda 2.8-2.9 gibi santrifüj ve filtre.
11. 90 dakika boyunca bir ultrasantrifüjdeki 50.000 x g'de adımlar 2.9 ve ultrasantrifüjdeki tüpleri 2.10 ve santrifüj süpernatantlar Havuz.
12. Çok dikkatli ultrasantrifüjdeki tüpleri içeren kapsüller çıkarın ve santrifüj içinde tüp yönünü hatırlayarak, bir laminer akış kaputu koymak.
13. Topak, tüp üst tarafında olmasını sağlayacak bir şekilde, dikkatli bir ultra santrifüj tüpüne ve dökme sıvı ortam tutan açık kapsül. Viral pelet görselleştirmek için zor olabilir çünkü, üzerinde ne hatırlıyorumtüpün yan bir pelet oluşmuş olacaktır. Bir mikropipet alın ve ultrasantrifüjdeki tüpün alt tarafında görünür opak kahverengi pelet kışkırtmak dikkat çekerken orta son bit çıkarın.
14. 10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 ve 8 ug / ml polibren ile takviye organoid kültür ortamında 500 ul bu pelletini. Yüksek titre virüs doğrudan organoids Transduct için kullanılan bu yana bu ortamda tabanda önemlidir.
15. İsteğe bağlı olarak: -80 ° C'de 250 ul'lik iki seri olarak alınmıştır, bu ortamda virüs dondurma.

Organoids 3. lentiviral İletimi

Gün 0:

1. Yaklaşık 50 küçük organoids elde etmek amacıyla, yeni bir kuyunun içine transdüksiyon için iki gün önce organoids tam 0.95 cm ² kuyu bölün. Daha önce yayınlanan bir protokolün ¹ (Şekil 3A, B) işlemine göre organoids Böl.
2. Kistik aşırı çoğalma crypts (Şekil 3C) elde etmek için 10 uM Chir99021 ve 10 mM nikotinamid ile kültür ortamı Organoid Supplement.
   Not: taze bölme organoids Chir99021 varlığında büyütülür kistik kript iyi gelişir.

Gün 2:

3. Böylece P1000 mikropipet ile karışımı bozarak, yukarı pipetleme ve matrigel ve orta aşağı Hasat organoids. 15 ml'lik bir tüp içinde karışımın yerleştirin.
4. Distal açıklık eritilerek azalmış olan Pasteur pipeti kullanılarak daha bozabilir. Santrifüj organoids 100 x g'de 5 dakika boyunca pelet için.
   NOT: santrifüj büyüklüğüne bağlı olarak, farklı bir santrifüj hızı kullanın. Bu organoids karışımdan ayrılır bozulduğu olan tam hız bulmak için gereklidir.
5. Süpernatantı ve (% 0.25 tripsin benzeri) önceden ısıtılmış 1x tripsin 500 ul ekleyin. Tripsin içinde organoids yeniden süspanse ve inkübe37 ° C'lik bir su banyosu içerisinde 3 dakika.
6. Hücre hattı kültürü ortamı içinde 3.5 ml tripsin inaktive (DMEM,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve glutamin ile takviye edilmiş). 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
7. Orta yaklaşık 20 ul pelet bırakmak süpernatantı. Bir 48-kuyu plaka üzerinde kuyuya ortamının bu son küçük miktarda organoids aktarın.
8. Adım 2.14, tekrar süspansiyon tarif edilir ve 3.10: adım olarak iletim ortamı içinde yüksek titre lentivirüs ekleyin. Düşük transdüksiyon etkinliğini karşılaşmak, 3.9 eklenebilir adım.
   Not: etkin iletimi için, tipik olarak organoids bir oyuğuna yüksek titre lentivirüs 250 ul bir kısım ilave edin. Bu protokolün adım 2'de tarif edildiği gibi, tek bir üretim Hasat lentivirüs% 50'sini oluşturur.
9. İsteğe bağlı olarak: 32 ile ilgili, bir önceden ısıtılmış bir santrifüj içinde 48 gözenekli plaka ihtiva organoids koyarak spinoculation yerine, transdüksiyon etkinliğinin arttırılması için6, C ve 1 saat süre ile 600 x g'de döndürün.
10. Kültürü inkübatöründe organoid-virüs konacak ve transdüksiyonunu izin vermek için bir kültürü inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
11. İsteğe bağlı olarak: bundan başka, iletim etkinliğini geliştirmek kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de 3 saat daha organoids kuluçkalanması.
12. Organoids peletleştirmek için 850 x g'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj içine transfer organoid kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve organoid-virüs karışımı tekrar süspansiyon.
13. Süpernatantı ve buz-soğuk matrigel 20 ul pelletini. Daha sıcak olduğunda malzeme katılaşır beri, birkaç kez soğuk PBS yukarı pipetleme ve buz aşağı soğutulmuş olan pipet uçları kullanın.
14. 48 kuyu plakasında iyi olarak ortasında damlacık koyun ve katılaşmaya 15 dakika için 37 ° C 'de kültür inkübatörü içinde inkübe edilir.
15. 15 dakika sonra, dikkatli bir şekilde ilave edilmiş organoid kültür ortamında 250 ul10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021 ve 10 uM Y27632. Küçük kesintiye organoid parçaları 24 saat içinde küçük kistik organoids içine oluşturacak.

5. Gün:

16. Orta yenileme ve bir seçim antibiyotiği ile ek (puromisin için, 4 ug / ml kullanımı).

Gün 7:

17. Seçim antibiyotik ile desteklenmiş standart organoid kültür ortamı için orta değiştirin.
    Not: geliştirici Chir99021 çekilmesinden sonra 2-3 hafta tamamlanır. Seçimden sonra, organoids seçimi antibiyotiksiz yetiştirilebilir.

Kantitatif RT-PCR veya Mikrodizi 4. organoid RNA Preparasyonu

1. RNA preparasyonu için, üreticinin protokolüne göre, ticari bir kit kullanılır. Organoids orta çıkarın ve düz matrigel içeren organoids kubbesi üzerindeki β-mercaptoethanol ile takviye tampon RLT 350 ul ekleyin. Materyali yeniden süspanseP1000 mikropipet kullanarak pipetleme RLT al.
2. Üreticinin protokolüne göre başka bir RNA hazırlık yapın.
3. İsteğe bağlı olarak: üreticinin protokolüne uygun olarak 50 ug toplam RNA, ilk giriş gerektiren Ovation Pico WTA sistemi kullanılarak amplifikasyon RNA verimi artar.
4. İsteğe bağlı olarak: RNA, mikrodizi önce kalite kontrolü için, üreticinin protokolüne uygun olarak 8.5 ya da daha çok (Şekil 5) bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) hedefleyen bir ökaryot toplam RNA, nano çipini kullanan bir 2100 Bioanalyzer çalışacak örnekleri.

Parafin Yerleştirilmiş ve İmmünohistokimya için 5. İşleme Organoids

1. Önceki gömme organoid başlamasından parafin sıvı tutmak için 70 ° C 'de delikli inkübatör bağlantı 12 mm çaplı cam tüpler bir alüminyum blok önceden ısıtın.
2. Bozulmamış gömülü organoids bırakarak, tam yetiştirilen organoids tek bir kuyu alın ve orta kaldırmak.
3. 1 ml ilave edilir% 4 paraformaldehid, PBS içinde düz iyi ve 1 saat her yerde, 4 ° C'de gece boyunca sabitlemek.
4. Buz soğukluğunda PBS, 1 ml paraformaldehid yerine.
   İsteğe bağlı olarak: bu aşamadan sonra, 4 ° C'de 1 hafta kadar PBS içinde sabit organoids tutun.
5. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve sabit organoids bir cam şişe içine koyun.
6. , Organoids 1 dakika boyunca dibine çöker olsun PBS süzün ve eozin çözeltisinin damlacıklarının bir çift gömme işlemi boyunca organoids görselleştirme sağlamak için çözülmüş olan% 70 etanol ile değiştirin.
7. Oda sıcaklığında% 70 etanol içinde organoids bırakın. 30 dakika sonra, dikkatli bir şekilde, çünkü hafif pembe eozin renk gözle organoids görselleştirmek için güçlü olmak, boşaltılarak% 70 etanol çıkarın. % 96 etanol ile gömme çözüm değiştirin.
8. Adımı yineleyin 5.7, yanında bir gömme çözüm yerini her zaman. % 70 etanol,% 90 etanol,% 96 etanol,% 100 etano: daha sonra, aşağıdaki çözeltiler ile organoids geçirinmetanol,% 100 etanol, ksilen, ksilen.
9. Son ksilen yıkama Durusu ve tüpe parafin dökün. 30 dakika boyunca 70 ° C'de önceden ısıtılmış alüminyum bloğunun Tüp hemen koyun ve yeni, temiz parafin ile parafin değiştirin.
10. Geniş açıklığı bulunan bir önceden ısıtılmış Pasteur pipet kullanarak parafin blok kalıp içine kapalı parafin ve pipet organoids dökün. Bunsen beki kullanarak Pasteur pipet sıcak tutun. Sıvı parafin, küçük bir tabaka halinde parafin blok kalıp tüm organoids yerleştirin.
11. Mümkün olduğunca, bir ısıtılmış diseksiyon iğne kullanılarak parafin blok kalıp merkezine doğru tüm organoids işlemek için deneyin. Bunsen beki kullanarak diseksiyon iğne sıcak tutun.
12. Kalıptaki organoids lokalizasyonu tatmin edici olduğunda, soğuk kalıp biraz parafin tabakası katılaşmaya.
13. Üst daha fazla parafin dökülerek blok bitirin ve bir standart histolojik gömme kaseti ekleyin.

Sonuçlar

Organoid lentiviral transdüksiyon

Lentiviral parçacıklar kullanılarak organoid iletimi tekniği öncesi ve transdüksiyon sırasında organoids doğru kullanımı bağlıdır. Organoids (Şekil 3A) kültürlenmiştir ve bir kript (Şekil 3B) içine dağıtıldı. Daha önce belirtildiği gibi, GSK3 inhibitörü Chir99021 mevcudiyetinde kültürlenmiş, bu tek kript kistik crypts ⁹ (Şekil 3C) olmuştur. Daha sonra org...

Tartışmalar

Mevcut video protokolü primer bağırsak epiteli ve kantitatif RNA teknikleri ve immünohistokimya kullanılarak, bu organoids aşağı doğru analizden organoids lentiviral iletimini tarif etmektedir.

Lentiviral transdüksiyon genellikle kültür plakaları içinde yapışık veya yüzen hücrelerin içinde gerçekleştirilir. Organoids bölgesinin üç boyutlu yapısı, viral parçacıklar tarafından nüfuz onları zor hale yana etkinliğini artırmak için bir dizi yöntem kullanılır....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025