Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

Özet

Zebra balığı, kronik böbrek hastalığı (KBH) modellemek için popüler bir araçtır. Ancak, kendi küçük boyutu imkansız geleneksel yöntemlerle böbrek fonksiyonlarını değerlendirmek için yapar. Biz CKD zebrafish böbrek fonksiyonunun kantitatif analiz sağlayan bir floresan boya böbrek boşluk tahlil ¹ açıklar.

Özet

Zebra balığı embriyo organogenezi çalışma ve insan genetik hastalık modellemek için bir uysal bir model sunuyor. Göreli basitliğine rağmen, Zebra balığı böbrek geliştirir ve insanlar hemen hemen aynı şekilde çalışır. İnsan böbrek yapımında önemli bir fark sadece iki olan Zebra balığı göre nefron milyonlarca varlığıdır. Ancak, temel fonksiyonel birimler halinde böyle karmaşık bir sistemin basitleştirilmesi böbrek geliştirir ve nasıl çalıştığını anlayışımızı destekli etti. Zebra balığı, glomerulus bulunduğu orta hat cloaca birbirine kaynaştırarak önce embriyonik eksen aşağı ikili çalıştırmak sapmak iki Pronephric tübüllerine ilk kan filtrasyon sorumludur. Pronephric tübüller ağır nihayet cloaca ^2-4 vasıtasıyla çıkmadan önce çeşitli çözünenlerin alışverişini sağlayan, parçalı tübül boyunca süzülen maddenin hareketini kolaylaştıran hareketli kirpikler tarafından doldurulur. CKD, inc sorumlu Birçok genlerciliogenesis ile ilgili olanlar luding, zebrabalıkları ⁵ incelenmiştir. Ancak, büyük bir beraberlik geri genetik manipülasyon sonra Zebra balığı böbrek fonksiyonunu değerlendirmede zorluk olmuştur. İnsanlar çoğunlukla nedeniyle sucul ortamda ve küçük boyutu, Zebra balığı olmayan translasyonel kanıtladık Geleneksel tahliller böbrek disfonksiyonu ölçmek için. Örneğin, embriyonik üre ve kreatinin içeriğinin analizi için balık kademeli gelen bunlar çok küçük oldukları gibi, kan çıkarmak için fiziksel olarak mümkün değildir. Buna ek olarak, Zebra balığı genellikle ilk hasta muayeneleri sırasında yapılan basit bir proteinüri 'yağ çubuğu' üzerinde test için yeterli idrar üretemezler. Böbrek fonksiyonu ^1,6-9 üzerinden bir okuma vermek için, damar ile ilgili ve dışarı böbrek yoluyla niceliksel olarak, zaman içinde, bir floresan boya açıklık izlemek için zebrabalıkları optik saydamlığı kullanan bir floresan deneyi tarif eder.

Giriş

İnsan böbrek kanından metabolik atıkların filtreleme ve hücresel homeostazı sürdürmek için gerekli eriyiklerin kurtarma önemli bir rol oynar. Böbrek fonksiyon bozukluğuna neden olan insan genetik hastalıkların bir dizi vardır. En yaygın kalıtsal böbrek hastalığı böbrek tübülleri içindeki sıvı dolu keseler gelişimi ile karakterize otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek) 'dir; cystogenesis kaynaklanan hasar böbrek fonksiyonu ¹⁰ için zararlıdır. 800-1: polikistik böbrek 1 oluştuğunun vardır 1,000 ve 8 hesapları - son dönem böbrek yetmezliği ^{(SDBY), 11} hastada% 10. Birkaç genler yaklaşık% 85 ve sırasıyla ^12,13 vakaların% 15 için muhasebe, polikistin-1 (PKD1) ve -2 (PKD2) dahil ADPKD neden suçlanmıştır. Ayrıca, gen PKD1 ürünleri ve -2 cilium lokalize ve ciliogenesis ^14,15 temelidir. Olarak bilinen insan genetik bozukluklar, tanınmış bir aile artık varkirpikler fonksiyonunu etkileyebilir ve CKD ¹⁶ neden ciliopathies.

siliyer gelişimini ve fonksiyonunu etkileyen insan genetik hastalıkların giderek artan sayıda bu kez kabul körelmiş organel küresel ilgi çekiyor. kirpik, saç benzeri hücresel çıkıntı, reseptörler ve anahtar hücre sinyal olayları transdüksiyonu için gerekli iyon kanalları ile zenginleştirilmiştir. kirpik tipik olarak ya da tekil mikrotübül merkezi bir çift olmaksızın dokuz radyal olarak düzenlenmiş mikrotübül çifti içine yapılandırılmış bir mikrotübül göre aksonem oluşur. axonemal yapısı siliyer eylem türünü ve modunu tanımlar. 9 + 2 mikrotübül düzenlemesi epitel yüzeyleri boyunca sıvıların hareketi kullanılmaktadır kirpiğin hareketliliğini bahşeder. 9 + 0 yapılandırması olmayan hareketlidir ama hücresel sinyal olaylar ¹⁷ ağırlıklı olarak işlev inanılmaktadır. Dışında CKD gelen, siliyer disfonksiyon sonuçları karakteristik bir dizi vardır, obezite, retina dejenerasyonu, polidaktili ve kognitif bozukluk ¹⁶ dahil ciliopathy özellikleri. Ancak, CKD hastanın yaşam kalitesi en zararlı ve bu nedenle silier ilgili CKD için vivo modellerde uygun gelişiminin arkasındaki önemli bir itici güç arasındadır.

Zebra balığı, insan genetik hastalığının etyolojisi anlamak için mükemmel bir model. Bunların pratik geliştirme, yumurta, çok sayıda şeffaf doku ve eski in utero büyüme üretimi zebra balığı gelişim süreçleri görsel ve biyolojik etkinlik önemli kolaylıkla idare edilmesine olanak sağlamaktadır. Genler genetik, genom düzenleme araçları (CRISPR ¹⁸ ve TALENS ¹⁹⁾ son başarısını kullanılarak değiştirilmiş antisens morfolino teknolojisi kullanılarak ²⁰ nakavt, ya da farmakolojik onların su ortamında bileşiklerin eklenmesi ile kontrol edilebilir. Nitekim, Zebra balığı e üstlenmek için bir platform sunuyoruzDiğer hayvan modellerinde izin veren değil xperiments. Zebra balığı iken insanlarda ile birçok ortak işlevsel korunmuş organları, genleri ve sinyalizasyon işlemleri paylaşan (insanlara kıyasla) nispeten basit omurgalılar vardır. Örneğin, Zebra balığı böbrek insanlara ^21,22 oranla yapısında ve fonksiyonunda oldukça benzer. Ancak, fazların bir arkaya yoluyla gelişir memeli böbrek aksine, her bir daha gelişmiş böbrek (pronephros, mezonefros ve metanephros) ile işaretlenmiş, embriyonik zebrafish sadece bir pronephros, bir böbreğin en olgunlaşmamış formu geliştirir. Nefron milyonlarca memeli böbrek yapı taşlarını oluşturan bulunabilir iken, Zebra balığı embriyo sadece iki sahip. İlk kan süzülen kısım için izin glomerüller, aort orta hatta sadece ventral olarak kaynaşmıştır. Cloaca yoluyla çıkmak için önce eritme, eksen boyunca kaudal çalıştırmak Pronephric tübüllerine glomerüllerden kan filtreleri. Pronephric tubules ağır kaudal çıkış ^3,4 doğru süzülen maddenin akışına toleranslılar hareketli kirpikler ile kirpikli edilir. Bu basit Pronephric yapı onlar sonunda bir daha karmaşık yapıya mezonefros ²¹ haline larva büyümenin birkaç hafta boyunca Zebra balığı homeostazı korur. Bununla birlikte, zebra balığı, bir metanephros ²¹ geliştirir olmadı. Zebra balığı özel duruma rağmen, zebra balığı nefron memelilerde görülen eşit gen sentezleme profilleri ile bölümlere ve böylece nefrogenezisi ^3,22 in vivo modelinde rakipsiz sunmaktadır.

Rutin hasta, kan ve idrar testleri bir dizi böbrek fonksiyonu için test edilir. Tipik haliyle, kan çözülmüş tuzları, üre, kreatinin için analiz edilir. Üre, kreatinin ve anormal tuz konsantrasyonu yüksek düzeyde böbrek fonksiyonu ile ilgili sorunlar göstergesidir. Bir kolorimetrik çubuğunu kullanarak İdrar tahlili proteini, bloo anormal seviyelerini algılard irin, bakteri ve idrar örneklerinde şeker mevcut. Kanın 10 ml - Bu gibi testler, normal olarak idrar yaklaşık 30 ml ya da 5 gerektirir. Bu esas olarak tahlili gerçekleştirmek için yeterli kan ya da idrar toplama imkansız olması sebebiyle, söz zebrabalıkları gibi in vivo model organizmaların, küçük deneylerde, bu tür çevirmek için zor olmuştur. Burada, biz uygun zebrabalıkları böbrek fonksiyon testleri eksikliğini gidermek ve çalışma için yenilikçi bir teknik tarif. Kan akışı içine bir floresan boya enjekte edilmesi Böbreğin ile kandan süzme ve floresan aktivitesi atılımını izlemek ve ayrı ayrı zaman içinde ölçmek mümkündür. Bu yöntem, bir örnek teşkil hastalığın neden olduğu böbrek hasarı, çalışma için kullanılabilir.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan bakım, hayvancılık ve prosedürler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Tüm hayvan deneyleri Biyolojik uygun Ana Sekreteri (PIL No 70/7892) tarafından verilen lisanslar altında gerçekleştirilmiştir tarafından tanımlanan ve kontrol edilir Hizmetleri Yönetimi Grubu ve Biyolojik Hizmetleri Etik Komitesi, SGUL, Londra, İngiltere. Tüm çabalar kullanılan hayvanların sayısını azaltmak ve refah acı en aza indirmek ve geliştirmek amacıyla hem usul ve hayvancılık rafine yapılmıştır.

1. Araçların, Anestezik hazırlanması ve Floresan Boya

1. Bir mikropipet çektirmesi ve (filamentler olmadan) borosilikat standart duvar kılcal mikroenjeksiyon (Şekil 1A) için uygun uzunlukta iğneler çekin kullanma.
2. Perikard (Şekil 1B) içine kolay enjeksiyon için embriyo yönlendirme için bir agaroz kalıp olun. Tutkal yaklaşık on cam mikroskop slBirlikte ides ofset slaytlar bir 'merdiven' oluşturmak için. En iyi sonuçlar için, her slayt merkezinde hızlı set epoksi reçine yapıştırıcı bir damla kullanın.
3. Kaldırmak, bir Bunsen beki ısıtılmış neşter kullanılarak iki adet 10 ml'lik plastik pipetler ile uzunluk yarım yaklaşık 78 mm'lik bir bölümünü kesip pipet gibi uygun biter. Takın ve yığılmış cam slaytlar tutkal (epoksi reçine) pipet bölümleri kalıp 90 mm Petri kabı içine daldırma izin istikrar sağlamak. Slayt köşeleri Petri kabı yere dik hizaya sağlamak için her türlü çabayı gösteriyoruz. Tutkal zamanı ayarlamak için izin ver.
4. Balık, su içerisinde yapılan% 2 agaroz çözelti içinde kalıp döküm (akvaryum de elde edilmiş). Bir 90 mm Petri kabı içine agaroz dökün ve istiflenmiş slayt agaroz yüzey altında bir açı ile su altında kenarları izin veren açık bir petri kabı üzerine kalıp yerleştirin. 30 dakika için laboratuar bankta ayarlamak için bırakın.
5. Slayt döküm çıkarın ve taze balık su ile slayt baskılı agaroz kapakTricaine anestezik içeren 1:25 oranında (adım 1.9 bakınız).
6. Rodamin dekstran (RD) boya çözümleri olun. Süspanse rodamin B 10,000 MA, 50 mg / ml'lik bir stok konsantrasyonu için otoklava, aşırı saf su içinde dekstran etiketli. Mikroenjeksiyon için daha otoklavlanmış, aşırı saf su içinde 5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar stok seyreltin.
   NOT: Pigmentli hücreler 24 saat sonra döllenme (hpf) den Zebra balığı ayırt başlar; Bu görüntü alımı sırasında floresan işaretçileri belirsiz olabilir.
7. Blok tirozinaz inhibe etmek suretiyle melanojenezin K -Phenylthiourea (PTU) kullanarak melanosit oluşumunu inhibe eder. Tam olarak çözündürülmesi için 60 ° C'de akvaryum su, ısı çözeltisi propiltiourasil'in tozunun çözülmesiyle propiltiyourasil'i bir% 0.003 stok solüsyonu olun.
8. , Metilen mavisi çözeltisi, hafif fungisit zebrafish embriyolar inkübe mantar blum önlemek ve hayatta kalma artırmak için. U içinde% 0.1 Metilen mavisi ihtiva eden, metilen mavisi stok çözeltisi 2 ml ilave edilirltrapure su, standart bir embriyo ortamı olarak akvaryum su ve kullanım 1 L.
9. 'Zebra balığı Kitap' ²³ belirtildiği gibi Tricaine / etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu 15 mM stok konsantrasyonu Makyaj. Embriyoların uyutmak ve dolayısıyla mikroenjeksiyon işlemi gerçekleştirmek için onları hareketsiz.
10. Embriyoların anestezi sonra, metilselüloz, toksik olmayan ve yapışkan özelliklerini kullanarak görüntüleme için, yönlendirilmesi. % 3 metilselüloz 200 ml'lik bir hazırlık yapmak buz üzerinde 30 dakika karıştırıldı ve bir yer için -20 ° C 'de suyun 130 ml soğuk için. , Bir cam beher içinde, 80 ° C'ye kadar 70 mi kadar su Isı metilselüloz 6 g ekleyin ve bütün parçacıkları ıslatıldığında ve düzgün bir şekilde dağılmıştır kadar bir cam çubuk kullanılarak çalkalayın. Buz soğukluğunda su ekleyin karıştırın ve hazırlama 50 ml tüpler içinde aliko haline önce 30 dakika boyunca 4 ° C'de soğumaya bırakın.
    NOT: sıcaklık düşürülmesi metil çözünür olmayı sağlar. Çözelti daha kalın olacakToz hidratlar gibi. % 3 metil bakteriyel 4 ° C 'de bir haftalık, kısa süreler için büyüme ya da -20 ° C'de daha uzun olmayan saklanabilir. Metilselüloz Kullanmadan önce RT ulaşmıştır emin olun.
11. Zebra balığı içine floresan boya enjekte gerçekleştirmek için bir standart mikroenjeksiyon set-up (Şekil 1C) kullanın. Bu 1.0, dış çap kapiller ile kullanım için düz bir pipet tutucusunun içine besleyen bir basınç düzenleyici sistemine bağlı bir hava kompresörü oluşur. Pipet tutucu bir manyetik stand ile bir çelik taban plakasına sabitlenmiş bir MM33 kompakt 3-eksenli kontrol mikromanipülatör içinde muhafaza edilmelidir. Embriyolar manipüle, görsel ve bir stereo mikroskop kullanarak enjekte edilebilir.

2. Zebra balığı Yetiştirme ve Ön-enjeksiyon tedavisi

1. Daha önce açıklandığı gibi ²³ zebrafish koruyun. 28.5 ° C sabit sıcaklıkta verilen sirkülasyon suyu sağlayan bir akvaryum set-up kullanınPH 6.8 şartına - 7.2 ve sodyum bikarbonat ve Anında Okyanus Deniz Tuzu ile 450-550 uS iletkenliği sırasıyla. 8 L tank başına 15 kadın 15 erkek bir stoklama yoğunluğu muhafaza, deney uygun olarak yabani-tip veya transgenik zebrabalıkları hatları kullanın. 09:00-23:00 arasında gün ışığı 14 saat balık tesisi photocycle ayarlayın.
2. Zebra balığı yumurtlama ışıkları sabah açmak photocycle, başında başlar. Toplamadan önce yabani türde stok tanklarına akşam üreme tankları (zebrabalıkları uzmanları temin içeren örgü ekler,) batığın, maksimum yumurta balık bozmadan toplanabilir sağlamak.
3. Sonra bir çay süzgeci ve taze akvaryum su kullanarak yumurta toplamak ve durulayın, balık için 40 dk yumurtlamaya - toplama gününde, 30 izin. Bir 90 mm Petri kabı içeren embriyo ortamda temizlenir yumurta bırakır ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir.
4. Melano inhibe etmek için propiltiyourasil'i embriyo tedavidoğuşu. 8 hpf, 1 içeren taze petri kaplarına minimal sıvı içinde canlı embriyo transferi: embriyo ortamına 100 PTU ve daha 72 hpf kadar 28.5 ° C'de inkübe.
   NOT: PTU yani 8 hpf aşamalarını göndermek için sınırlı olmalıdır erken aşamalarında kullanıldığında gelişimsel bozukluklara neden olabilir, ama geç 24 hpf olarak tedavi edilebilir. PTU Geç eklenmesi tamamen göz pigmentasyon engellemek ama genelde başarılı ve gövde melanosit oluşumunu inhibe vermezse.

3. Mikroenjeksiyon

NOT: perikard kalp encases ama perikard boşluğu içinde sıvı ile koruma ve kardiyak hareket kolaylığı için ayrılır. Bu işlemin amacı, bu damar sistemine boya hızlı alımı için izin veren, perikardiyal boşluğuna RD enjekte edilmesidir.

1. 6 ul yük iğneler - Microloader ipuçlarını kullanarak, RD seyreltilmiş ve mikromanipülatör iğne tutucu içine sabitleyin. İnce tipp kullanarak iğne ucunu kırıned forseps (Şekil 1A). , Dakika ayarına darbe süresi maksimize ederek iğne ucu RD çözüm taşı kez tam msan geri dönmek.
2. Çapı 100 um sınırdışı damlacık boyutunu ayarlamak için (forseps kullanarak) iğne ucu uzunluğu bir sahne mikrometre, basınç regülatörü ve inceliklerini kullanarak, bu 0.5 nl hacmi (Şekil 2A) eşittir.
   NOT: İğneyi kırma yaparken, aksi takdirde zor enjeksiyon hacmi kalibre yapacak kapalı çok kırmak için değil dikkatli olun. Gerekirse ayrıca bununla birlikte açılan boyutunu artırmak dokunun aşırı bükme veya zarar vermeden perikard girişi izin veren bir iğne kalınlığı korumak için iğne ucu bölünürler.
3. Enjeksiyon öncesinde, Tricaine içeren embriyolar embriyo ortamda uyutmak. 5 ml embriyo orta, etiket, bir 'Tricaine' ve diğer 'Kurtarma' içeren 2 x 35 mm Petri kapları ayarlayın.
4. 200 ekleuygun şekilde etiketlenmiş çanak stok Tricaine ul. Enjekte etmek kez hazır, 72 hpf bireysel embriyo seçmek ve Tricaine çanak minimal sıvı içinde aktarmak. Embriyonun aktivitesi Monitör, embriyo anestezi uygulandı ve kesilmiş bir Microloader ucu kullanılarak hafif çalkalama ile hareketsiz hale test edin.
5. Enjeksiyon kalıp anestezi embriyo transfer ve sol tarafı yukarı bakacak şekilde görüş alanının solunda kalp konumlandırma böylece agaroz çukur içinde embriyo yolunuzu.
6. Kalbin içine enjekte RD için, iğne ile perikard delmek ve anestezi embriyo (Şekil 2B, sağ panel) perikard boşluğuna RD 1 nl enjekte. Enjeksiyondan sonra iğneyi çekiniz. 'Kurtarma çanak' minimal sıvı enjekte embriyo transfer ve 1 dakika izlemek. 1 ml taze embriyo ortamı (PTU ihtiva eder) ihtiva eden bir 24-çukurlu plaka bireysel embriyo transferi ve uygun olarak etiketleyin.
   NOT: Perikard zor, ancak perikard ventro-kaudal farenks kemerler ve dorso-rostral yolk kesesi (Şekil 2B ok ucu) karşılayan kesiştiği bir kayda değer bir zayıf nokta vardır. İğne bu oluk yönelik olmalıdır. İğne yerinde olduğunda, mikromanipülatör üstünde bir parmak sağlam bir musluk perikard boşluğuna girişini kolaylaştırmak olacaktır.
7. Ayrı bir kuyu ve benzersiz labelto izin bireysel deneysel takipleri her balık yer, deney grubu başına en az 10 embriyolar için 3.6 - 3.2 tekrarlayın adımları. 3 saat 28.5 ° C'de inkübe edin.

4. Görüntüleme Toplama

1. Daha önce tarif edildiği gibi 3 saat sonra, enjeksiyon (HPI) de embriyolar anestezi ve% 3 metilselüloz içeren 35 mm Petri tabağına aktarın. Yavaşça metilselüloz içine embriyolar itmek ve lateral yan görüntülü böylece yolunuzu.
2. Görselleştirme o bir filtre kullanılarak, UV altında embriyo bir görüntü eldef 570 nm (Şekil 2C) ışığı yaydığı. Görüntü alındıktan sonra, embriyo iyi belirlenmiş içinde değiştirmeden önce kurtarmak için izin verir. Tüm enjekte embriyolar için görüntü elde ve daha 28.5 ° C'de inkübe.
   NOT: Biz TXR filtre seti, bir DFC300FX kamera ve ilgili uygulama yazılımı ile bir floresan stereomikroskopta kullanılan bu protokolde. Sonraki görüntü elde etmek için tam satın alma ayarları bir yere not edin.
3. Yukarıda açıklandığı gibi 24 HPI anda, görüntülerin bir ikinci tur kazanır. Tüm görüntüleri elde edildikten sonra, 3 HPI ve 24 HPI hem de, insanca embriyoların imha veya diğer deneysel yollarla, örneğin, immunohistokimyasal için kullanın.

5. Görüntü İşleme

1. NIH ImageJ yazılımı kullanarak görüntüleri analiz ederek, 3 HPI ve 24 HPI de, her enjekte embriyo floresan yoğunluğu niceliğini. , Floresan yoğunluğu ölçmek ImageJ bir görüntüyü açmak ve 1 faiz (roi) bir bölgeyi belirtmek için00 px ² (Düzen → seçimi → belirtin).
2. Roi (Şekil 2C) merkezinde kalp yerleştirin, (→ tedbir Analiz) ölçümü gerçekleştirmek, (→ set ölçümleri analiz) ortalama gri skala ve bölgeyi kapsayacak şekilde ölçümler ayarlayın. Embriyo başına, 3 HPI ve 24 HPI de, görüntülerin her set için tamamlayın ve daha fazla işlem için bir elektronik tabloya ortalama gri skala değerleri aktarmak.
   NOT: Bu embriyolar arasındaki bireysel kalpleri kapsar Biz 100 px ² sabit roi boyutu seçilir. Kalp nedeniyle önce böbrek girmeden kan floresan içeriğini ölçmek için elverişli bir konuma sağlayan geniş boyutuna ölçümler yapmak için seçildi.
3. Uygun istatistiksel yazılım kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bir öğrencinin t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için gruplar karşılaştırın.

Sonuçlar

Dünya çapında ¹⁶ 160,000 kişiyi: Bardet-Biedl sendromu (BBS) yaklaşık 1 etkileyen nadir heterojen ciliopathy olduğunu. Polikistik böbrekler olmak üzere ilgili bir takım sorunlar ile başvururlar, daha sonra hastalar sıklıkla böbrek diyaliz veya transplantasyon ²⁴ gerektirir. SDBY CKD ¹⁶ gelişmekte olan hastaların yaklaşık% 30 ile, BBS içinde en sık ölüm nedenidir. Şu anda, 20 sigara ile ilgili genler yayınlanmış genotip-fenotip dernek ile BBS suçlanmıştır. BB...

Tartışmalar

Zebra balığı, insan genetik hastalık modellemek için değerli bir araç sunmak, in vivo araştırma için bilimsel bir enstrüman olarak kullanılması böbrek dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemlerin, genetik arıza detaylı çalışmalar sağlamıştır. Çok şimdi Zebra balığı böbrek geliştirir ve işlevleri nasıl anlaşılmaktadır. İnsan nefrogenezisi ve hastalığa neden olan genlerin ²¹ ile homoloji çarpıcı benzerlikler anlamada temel hale nasıl Zebra balığı resimli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404