Kök Ganglia Nöronlar ve Farklılaştırılmış Yağ-türetilmiş Kök Hücreler Dorsal: bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Co-kültür Modeli Periferik Sinir Rejenerasyon Eğitim

Özet

Dorsal kök gangliyon (DRG), periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva eden yapılardır. Ayrışmış zaman, yaralanma yerinde in vivo ortamda taklit in vitro sinir rejenerasyonu ve miyelin incelemek için değerli bir model sağlayan, Güney Carolina gibi yağ elde edilen kök hücreleri (ASC) ile birlikte kültürlenebilir.

Özet

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Giriş

Periferik sinir yaralanmaları İngiltere'de yaklaşık 9.000 vaka ağırlıklı olarak genç her yıl meydana gelen ve nüfusu ¹ çalışma ile ortaktır. Mikrocerrahi sinir onarım teknikleri rağmen, fonksiyonun normal restorasyon engelli el hissi, azaltılmış motor fonksiyon ve sık ağrı ve soğuk intoleransı ² ile sonuçlanan ulaşılamaz. Bu tür yaralanmalar derin ve kalıcı bir hasta üzerindeki etkisini ve daha az% 60 ^3. çalışmak için dönen, günlük yaşam aktivitelerini gerçekleştirmek için yeteneği var.

Yaralanma, fenotip ve nöronların morfolojisi ve Schwann hücrelerinin akson filizlenmesini sağlamak için uygun bir ortam yaratmak amacıyla (SC) değişikliğinin ardından. Transeksiyonu durumunda, sinir yakın ve uzak uçlarının ayrıldı; rejeneratif süreç distal güdük iken, yer aldığı noktasıdır olmak proksimal güdük SC kopmakta bunun Wallerian dejenerasyonunu uğraryaralı aksonlar, de-farklılaştırmak ve çoğalırlar gelen. Bu miyelin enkaz kaldırma ve sinir yeniden nesil ^4,5'ten için uzak güdük hazırlanıyor yönelik esastır. Akson filizlenmesi distal güdük de SC tarafından yayımlanan nörotrofik faktörlerin ve kemokin üretimi tarafından desteklenen ve Wallerian dejenerasyon ^6,7 aşağıdaki geride bazal lamina tarafından yönlendirilir. SC Büngner bantlarını oluşturan rejenere akson, yanında hizaya yardımcı olan endonöral tüp dışında dallanma azaltılması hedef organa doğru akson büyümesi. Reinnervation ardından, Güney Carolina rejenere akson sarma yeni miyelin kılıfını oluşturan, ancak duyusal ve motor fonksiyon sadece kısmen ⁸ restore edilmiştir.

Dorsal kök gangliyon (DRG), duyusal sinir hücreleri, çevresel organlar innerve içeren omurga intervertebral foraminanın bulunan yapılar vardır. Ayrışmış, bunlar, uygun bir in vitro mod olarak kullanılabilirmiyelin oluşumu soruşturma da dahil olmak üzere ^{11, -} sinir rejenerasyonu ⁹ çalışma için el. Özel olarak, yetişkin DRG nöronlarında, bu hücrelerin in vivo özelliklerini taklit eden ve doku mühendisliği periferik sinir onarımı için yeni stratejiler incelemek için üstün bir araç sağlar.

Eş-kültür, in vitro olarak, bir, özellikle iki (veya daha fazla) hücre tiplerinin etkileşimi, in vivo ortamı taklit eden dinamik bir sistemi temsil eder. Bu hücre ko-kültürü modelleri avantajlarından biri, hücre dışı ortama tatbik edilebilir esnekliği ve yüksek kontrolüdür. ^{14 -} DRG nöronlarında çevresel sinir sisteminde ^10,12 iki hücre tipleri arasında meydana gelen gerçek etkileşimi taklit eden SC ile ko-kültür sistemlerinde sık sık kullanılmaktadır. Bu SC dışı matriks (ECM) proteinleri ve son derece artırabilir büyüme faktörleri salgılar olduğu gösterilmiştirDRG nöronlar yeteneği hayatta ve neurites ^15,16 filiz. Bununla birlikte, SC hücre kültürü tekniği ilerlemelere rağmen, doku mühendisliği uygulamaları için bir hücre, uygun bir sayı üretmek için hala zordur çoğalmaya zaman uzun süre gerektirir ve. Buna ek olarak, sağlıklı bir sinir kurban otolog SC hasat için gerekli olan. Bu nedenle, kaynak SC fark her iki doku mühendisliği için ve sinir rejenerasyonu vitro testler de önemlidir. Bu görünümde, ASC, periferik sinir tamiri ^17,18 için kullanılmak üzere, bir doku mühendisliği yapısının geliştirilmesi için önemli bir alternatif olarak kabul edilebilir. Daha önceki çalışmalar, S-100, p75 ve glial fibriler asidik protein (GFAP) ^19, hem de miyelin proteini sıfır (P0) gibi karakteristik glial belirteçleri, ²⁰ eksprese eden, Güney Carolina gibi ASC farklılaşırlar, bu hücrelerin yeteneği gösterdi . beyin-türevi nörotrofik faktör olarak glial büyüme faktörlerinin salgılanması (BDNF), sinir gelişme faktörü (NGF) ve glial hücre-türevi nörotropik faktör (GDNF), aynı zamanda ^21,22 gözlenmiştir. ^{26 -} in vitro hem de gösterdiği ve in vivo olarak ²³ çalışmalar nedenle, Güney Carolina gibi ASC, periferal sinir rejenerasyonu için promoter olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, ASC, diğer kök hücre tiplerine göre daha yüksek sayıda minimal invaziv prosedürler aracılığıyla hasat edilebilir; adipoz dokusunda kök hücrelerin sıklığı 100- kemik iliği ²⁷ daha yüksek 1000-kat, ve SK ve kemik iliği mezenkimal kök hücreleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir proliferasyon oranına sahiptir.

Bu eser sırasıyla ayrışmış DRG nöronlar ve ASC yüksek verimli hasat gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol, ikinci SC-benzeri hücrelere ayırt ediliyor sağlamayı amaçlamaktadır. Bu iki hücre tipi ko-kültür nedenle DRG KD yeteneği gelecekteki çalışmalar için kullanılabilecek bir çok pratik bir sistem temin edecektirurons neurites ve sinir doku mühendisliği için farklı iskele üzerinde miyelin oluşumu mekanizmaları filiz.

Protokol

NOT: hayvanları kapsayan tüm deneyler İngiltere Hayvanlar (Scientific Usul) Yasası, 1986 uyarınca yapılmıştır.

1. Deney Seti-up

1. Tüm araçlar steril olup olmadığını kontrol edin, doku ve hücre hasat başlatmak için önce. Gerekli olsun, keskin cerrahi makas, çok ince forseps ve ince standart forseps bir çift otoklav. Ayrıca UV sterilizasyon, etanol pozlama veya uygun olarak buhar sterilizasyon kullanarak hücre tohumlama önce her substrat sterilize.
2. Kök hücre hasat ve farklılaşması için medya hazırlanması
   1. % 10 fetal sığır serumu (FBS), 200 mM L-glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin (PS) ile takviye edilmiş minimum temel ortam (α-MEM) içeren, kök hücre büyüme ortamı hazırlar.
   2. Steril dimetil sülfoksid içinde 2,436 ml forskolin 10 mg çözülmesiyle forskolin 10 mM'lik bir stok çözelti hazırlayın. 14 uM son konsantrasyonda kullanın.
   3. Steril dimetil sülfoksid 1.43 ml, 50 mg çözülmesiyle retinoik asit, 35 mg / ml stok çözelti hazırlayın. 350 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın.
   4. Damıtılmış steril su, 100 ul, liyofilize bir toz, 10 ug çözülmesiyle trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) stokları, (100 ug / ml) hazırlayın. 5 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın.
   5. Damıtılmış steril su içinde 500 ul, liyofilize bir toz, 50 ug çözündürülmesiyle temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) stokları, (100 ug / ml) hazırlayın. 10 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın.
   6. 14 uM forskolin, 126 ng / ml arasında glial büyüme faktörü-2 (GCF-2), 5 ng / ml trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF) ve 10 ng ile takviye edilmiş kök hücre büyüme ortamı içeren, kök hücre farklılaşması ortamı hazırlayın / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF).
3. Nöron hasadı ve ayrılması için ortam ve stok çözeltilerinin hazırlanması
   1. Bottenst hazırlayınein ve Ham'ın F12 ortamı,% 1 PS ve% 1, N2 ek ekleyerek Sato'nun (BS) orta ^28. (24-iyi plaka kullanılıyorsa) oyuk başına 500 ul olarak gerekli nihai hacim hesaplanır.
   2. Ağırlık / hacim olarak% 1.25 konsantrasyonda Ham F12 ortamı içinde kolajenaz IV stokları hazırlayın. 200 ul alikotları olarak -20 ° C'de çözüm ve mağaza Filtre-sterilize.
   3. ,% 2.5 ağırlık / hacim konsantrasyonunda Ham F12 ortamı içinde sığır pankreatik tripsin stokları Hazırlama 200 ul alikolar -20 ° C'de filtre-sterilize saklayın.
   4. Sinir büyüme faktörü (NGF), 200 ul -20 ° C sıcaklıkta, bir filtre ile sterilize edilmiş 1 mg F12 ortamında ve mağaza / ml yağ asidi-içermeyen sığır serumu albümini (BSA) solüsyonu içinde 5 ug / ml konsantrasyonda stok çözelti hazırlayın alikotları. Hazırlandıktan sonra NGF filtre etmeyin.
4. Durumda, herhangi bir yüzey modifikasyonu, oda sıcaklığında 15 dakika karıştırıldı ve kat lamelleri / poli-D-lisin ile plakanın (0.1 mg / ml gerçekleştirilmiştir) Ve / veya laminin (37 ° C 'de 2 saat süre ile 2-10 ug / ^cm2) uygun şekilde nöron eki ve nörit gelişimini desteklemektir.
5. Her zaman kullanmadan önce 37 ° C'de su banyosunda medya ısınmak.

Bir SC Fenotip içine 2. Yağ kaynaklı Kök Hücre (ASC) Hasat ve Farklılaşma

1. Yetişkin erkek Sprague-Dawley viseral ve kasık yağ ASC hasat
   1. Başlatmak Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi yağ hasat kadar buz PS çözeltisi ve mağaza% 1 v / v ile takviye (HBSS) içinde 10-15 ml bir tüp hazırlamak için önce.
   2. Servikal dislokasyon ve başları kesilerek sıçan sonlandırın. Iç organların açığa ve kanama kaçınarak, sıçan Tıraş ve karın deri yoluyla bir kesi yapmak. Mide ve bağırsakları (genellikle yağlı sarı tutarlılık ile karakterize) ve yetişkin bir erkek Sprague-Dawley sıçan testisleri çevreleyen kasık yağ encasing visseral yağ çıkarın. Aktarım inciBuz üzerinde HBSS içeren tüp e yağıdır.
   3. Biyolojik güvenlik kabini (sınıf II) ince ulaşıldığında bir makas ve ince kıvamına gelene kadar steril bir jilet kullanarak yağ doğrayın ve ağırlık / hacim kollajenaz tip I çözümü taze hazırlanmış% 0.2 15 ml içeren bir tüp içine transfer ve günde filtre ve sterilize edilmiştir.
   4. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüp aktarın ve sürekli ajitasyon altında 30 dakika-1 saat süre ile, ve enzim mevcudiyetinde sindirimi yağ dokusu bırakın. Yakından sindirim Monitör ve doku tamamen ayrışmış önce, bu hücre canlılığı ve hücre verimi artıracak durdurun. Filtre 100 mikron hücre süzgecinden doku Theun-ayrışmış.
      NOT: hafifçe bej görünüm elde, tüp dönen zaman iyi doku sindirim gözle görünür yağ, homojen kıvamda neden olacaktır.
   5. C santrifüj 37 ° C'de fetal sığır serumu içeren, kök hücre büyüme ortamı 15 ml ilave etmek suretiyle enzim nötralizetüpün dibinde, kök hücreler dahil stromal vasküler kısmını toplamak amacıyla 10 dakika için 160 g çözelti.
   6. Bu aşamada, topak, kırmızı kan hücreleri, 1 ml olarak yeniden süspanse edilebilir kan hücresi neden olduğu kirliliğin çıkarılması için liziz tamponunda. 1 dakika süre ile yeniden süspansiyon haline getirilmesi ve pipetleme sonra, 10 dakika boyunca 160 g taze kök hücre büyüme ortamı ve santrifüj 10 ml ekleyin.
   7. Dikkatle altta biriken hücre pelet bakımı, tüpten aspire. Kök hücre büyüme ortamı, 10 ml hücrelerin tekrar 75 cm içine ² şişeler aktarmak ve 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edin. Her 3 günde orta değiştirerek, geçit 1-2 kadar alt-birleşik düzeyde hücreleri koruyun.
2. Bir SC fenotipi ASC farklılaşma
   1. Geçit 1-2 içinde 75 ^cm2 şişeye kök hücre büyüme ortamı çıkarın ve Prepa taze 1 mM β-merkaptoetanol ihtiva eden taze ortam, 10 ml ile değiştirinKırmızı ve günde filtre ve sterilize edilmiştir. 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 de hücreleri inkübe edin. Bu aşamada, bu hücrelerin farklılaşmasını başlamadan önce düşük yoğunluklu (% 30) tohumlanır önemlidir.
   2. Dikkatle HBSS, aspirat hücreleri yıkayın ve 350 ng / ml retinoik asit ihtiva eden bir ortamda 10 ml ile değiştirin. 72 saat için 37 ° C,% 5 _CO2 de hücreleri inkübe edin. Işığa hücre orta maruziyetini en aza indirmek için deneyin.
   3. (Aşama 1.2.6 bakınız) 3 gün sonra, HBSS, aspirat ile dikkatli bir şekilde yıkama hücreleri ve kök hücre farklılaştırma ortamının 10 ml'si ile değiştirin. Her 3 günde bir ortam değiştirilerek, alt konfluent düzeyde hücreleri koruyun.
      NOT: (. Kingham ark ⁵ tarafından gösterildiği gibi) inkübasyon 2 hafta sonra, ASC karakteristik fenotip ifade, SC-benzeri ASC ayrılırlar. Daha sonra davranış ²⁹ gözle görülür bir değişiklik olmadan 10 geçişi kadar kullanılabilir.

3. Hasat ve Dorsal Kök Ganglionlar (DRG) Nöronlar Ayrılma

1. Servikal dislokasyon ve başları kesilerek sıçan sonlandırın. Sıçan Tıraş ve omuriliğe maruz cilt kaldırın. Keskin bir makas kullanarak, sınırlı organ ve kan damarlarının ekstra özen omuriliğe excide. Bir Petri kabı kullanarak biyolojik güvenlik kabini (sınıf II) spinal sütun aktarın ve herhangi bir sırt kısmını kaldırın.
2. Kord doku maruz steril ve keskin cerrahi makas kullanarak boyuna ekseni boyunca yarısında omurga bölün. Bu noktada, o kolay DRG nöron hasat sırasında ele yapmak, göğüs kafesinin seviyesinin altında iki küçük segmentlerde omuriliğe kesmek için yararlıdır. Ince forseps kullanarak, hafifçe çekin ve DRG kökleri çıkarmayın dikkat, tüm kord doku kaldırmak. DRG ve kökleri omurga kanallar içinde maruz kalacağı Bu şekilde, hala sütununda kaplı. Beyaz filamentler COMI olarak DRG gözlemleyinkanallarından doğrudan dışarı ng.
3. Ganglionlar kökenlerini zarar değil dikkat, çok ince forseps kullanarak vertebra kanallar derinliklerine gidiyor ve ödeme ile omurga kanallarından tüm DRG kök (sadece DRG) çekin. % 1 PS ile desteklenmiş Ham F12 ortamı 3-4 ml ihtiva eden bir küçük bir petri kabı (60 mm ²⁾ içine DRG aktarın. Farklı hayvanlar kullanıyorsanız, ayrı yemekler kullanın.
4. Bir mikroskop altında, glial hücre kontaminasyonu azaltmak için steril forseps ve bir neşter kullanılarak ganglionlar çevreleyen sinir köklerinin herhangi bir aşırı DRG temizleyin. Taze F12 ortamı, 1.8 ml küçük bir petri (35mm ²⁾ içine DRG aktarın.
5. % 1.25 ağ / h kolajenaz tip IV stok çözeltisi (0.125,% nihai konsantrasyon) 200 ul ilave edin ve 1 saat süre ile 37 ° C,% 5 _CO2 de DRG kuluçkalayın. Dikkatlice aspire veya DRG zarar vermemeye dikkat, bir cam pipet ile orta aspire. Taze F12 ortamı esnek EkleDaha önce tarif edildiği gibi,% 0.125 ağırlık / hacim kolajenaz tip IV enzimi ile olmasına ve 1 saat süre ile inkübe edilir.
6. Orta aspire yavaşça F12 ortamı ile DRG yıkayın. F12 ortamı, daha sonra 1.8 ml tripsin 200 ul ilave edin (nihai konsantrasyon% 0.25 ağ / h) ve 30 dakika boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe edin.
7. Tripsin çıkarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 500 ul FBS ile takviye edilmiş F12 ortamı içinde 1 ml. Orta aspire ve yavaşça serum izlerini çıkarmak için üç kez F12 ortamı ile DRG yıkayın.
8. Taze F12 ortamı içinde 2 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde bir cam pipet kullanılarak 15 ml'lik bir tüp içine ortam maddesi ile DRG aktarın. Yavaşça (plastik ipuçları alternatif olarak kullanılabilir) cam pipet aşağı (yaklaşık 8-10 kat) kadar pipetleme tarafından DRG nöronlar ayırmak.
9. Topak, tüp dibinde biriken ve yeni bir tüp içinde ortam toplanır. Topaklarını içeren tüp taze F12 ortamı içinde 2 ml ilave edilir ve m tekrarcam pipet ile echanical ayrışma. Süspansiyon homojen (yaklaşık 3-4 kat) olana kadar bu adımı tekrarlayın ve yeni tüp bütün ayrışmış DRG toplamak. Bu yöntem, mekanik ayrışmasından kaynaklanan stresi azaltır ve nöron canlılığını artırır.
10. Un-ayrışmış nöronlar ve diğer enkaz kaldırmak için 100 mikron hücre süzgeç kullanarak yeni bir 15 ml tüp içine çıkan homojenize süspansiyon Filtre. Bu aşamada, ilk önce bir 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu filtre ve bir cam pipet ile daha küçük bir tüp içine çözelti transfer uygun olabilir. 5 dakika boyunca 110 g süspansiyon santrifüjleyin.
11. F12 ortamı, 500 ul% 30 BSA çözeltisi 500 ul ilave edilerek% 15 bovin serum albümini (BSA) hazırlayın. Yavaş yavaş kademeli bir protein iz oluşturmak için 15 ml tüp duvarına aşağı çözüm pipetle. Bu aşamada, bu sayılar üzerinde kullanarak BSA 45 ° açıyla tüp tutun ve yavaşça serbest bırakmak için yardımcı oluroluşturan "parça" için bir referans olarak şahin tüp.
12. Tüpün alt kısmında 500 ul bırakarak adım 3.10 gelen süpernatan aspire ve aynı ortam içinde hücre pelletini. Yavaş yavaş daha önce 5 dakika boyunca 500 g aşama 3.11 (bir referans olarak tüp üzerindeki numaraları kullanın) ve santrifüj hazırlanan protein yol boyunca süspansiyonu pipetle.
13. Aşama 4.5 altında tarif edildiği gibi, süpernatan aspire ve modifiye BS ortamı (veya SC-benzeri ASC / DRG ko-kültür için karma bir orta 1 ml pelletini.
    Not: DRG nöronlarını yeniden askıya almak için ses tohumlanmış istenen nihai hücre konsantrasyonu ve örneklerin sayısına bağlı olarak, gerekli olan gerçek hacme yapılabilir. Bir hayvan, bir 24 yuvalı plaka deney için yeterli hücre sağlar.
14. Hücre bağlantısı oluşturmak için 2 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 seviyesinde tohumlanmış örnekleri inkübe ve son olarak sinir büyüme fa 50 ng / ml ile takviye edilmiş, taze BS orta ekleyinctor (NGF).

SC-benzeri ASC ve DRG Nöronlar 4. Doğrudan Co-kültür

1. Aşama 2.2.3 tarif edildiği gibi alt konfluent seviyelerde kültür SC benzeri ASC koruyun. DRG hasat öncesinde Yirmi dört saat, kök hücre farklılaşması orta aspire ve HBSS hücreleri yıkayın. Aspire ve 3 dakika için 37 ° C,% 5 _CO2 de tripsin 3 ml inkübe edilir.
2. Tüm hücreler şişeden çözülmüş olan bir ışık mikroskobu altında edin. Yavaşça dekolmanı yardım şişeyi dokunun. Tripsin reaksiyonu durdurmak 5 dakika boyunca 110 g'da bir 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu toplamak için orta 7 ml ilave edilir.
3. Süpernatan aspire ve kök hücre farklılaştırma ortamının 5 ml hücre pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve istenen nihai konsantrasyonuna göre hücre süspansiyonu seyreltin. İdeal olarak, 20,000 SC benzeri ASC tohum / ^cm2 hücrelerinin konfluent tabakası garantisi olacaktır.
4. SC-benzeri TohumVe alt-tabaka üzerinde ASC hücre bağlantıya olanak vermek üzere, 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edin.
5. 24 saat inkübe edildikten sonra, ortam aspire ve adım 3.14 ve 3.15 de tarif edildiği gibi hücreler üzerine DRG nöronlarını ekleyin. Kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ve BS ortam% 50 ihtiva eden bir karışık ortama orta değiştirin. Buna ek olarak, nihai karışık bir ortam içinde 1-2.5% FBS maddelerin azaltılması DRG ayrışma elde edilen uydu hücreleri, kirletici çoğalmasını önlenmiş olur.
6. 37 ° C,% 5 _CO2 de birlikte kültüre örnekleri inkübe ve gelecekteki deneyler için gerekli süre boyunca kültür içinde muhafaza.

Sonuçlar

Ayrışmış DRG nöronlarının Kültürleri sinir rejenerasyonu çalışması için bir in vitro model uygun temsil eder. Ancak, işlenmemiş yüzeyler DRG eki ve neurites uzatılması için uygun bir ortam vermeyin. SC-benzeri ASC onlar kültür ortamında yayımlanan zaman neurites filiz DRG nöronların yeteneğini artırabilir büyüme faktörleri ve kemokinleri ¹⁹ üretebiliriz. kültür sisteminde SC benzeri ASC varlığı dolayısıyla DRG fonksiyonlarının düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir.

Bu protokol (Şekil 1) nöronal hücrelerin önceden ekilmiş SC-benzeri ASC ile doğrudan temasa sırasında SC-benzeri ASC ve DRG nöronlar, doğrudan ko-kültür gerçekleştirmek için prosedürü gösterir. Bu prosedür ile ilgili ana zorluk farklı hayvanların hasat DRG nöronların sayısının yüksek değişkenlik olduğunu. Bu nedenle, sonuçlar COMPAR bazen zor olabilirE ve belirli bir önem verilmektedir, her deneyde benzer bir hücre yoğunluğu elde etmek üzere tohum işlemi sırasında dikkat edilmelidir. protokol BSA degrade (adım 3.11) kullanılarak DRG nöron ayrışma kalan uydu hücrelerin en azından sayısını azaltmak için optimize edilmiştir. Kingham'deki ve ark. ¹¹ tarafından tarif edildiği gibi ek olarak, sitosin-arabinoz (Ara-C) ek, daha da uydu hücre popülasyonu en aza indirmek için BS ortamına ilave edilebilir. Bununla birlikte, tedavi süresi seçimi aynı zamanda, kültür ortamı içinde ARA-C ek mevcudiyeti ile etkilenmektedir DRG SC benzeri ASC canlılık ile dikkatle dengelenmiş olması gerekir. Bu nedenle, bir uydu hücre serbest sistemini gerçekleştirmek çok zor.

Alt-tabakalar olarak kaprolakton (PCL) film - Şekil 2, muamele edilmemiş ve kimyasal olarak modifiye edilmiş poli ile bir ko-kültür modelinde filizlenme DRG akson SC benzeri ASC önemini göstermektedir. DRG nöronlar vardı maiAşama 4.5 de tarif edildiği gibi, BS ortam% 50 ve kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ihtiva eden bir karışık çözeltisi kullanılarak varlığında veya SC-benzeri ASC yokluğunda, 3 gün için kültür içinde ntained. Bu dönemin ardından, hücreler% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi ve β-tubulin III (DRG nöronlarında), S100 (SC-benzeri ASC), hücre morfolojisi araştırmak ve nörit çıkıntı yapacak DRG nöronlarının yeteneği çalışma ile boyanmıştır. Nöritlerin oluşumu açık eş-kültür sistemine (Şekil 2C) geliştirilmiş iken Resim nevritler kendilerine SC-benzeri (ASC Şekil 2A) yokluğunda muamele edilmemiş yüzeyler üzerinde gözlenmiştir. Ortalama olarak, hücre gövdesi başına yapılan akson sayısı, önemli ölçüde kök hücrelerin varlığında 0-3 yükselmiştir. Bu sonuçların doğrulanması da Şekil 3 'de gösterilen elektron mikroskobu (SEM) analizi, taramalı verildi. Özellikle, SEM görüntüleri nevritlerle filiz DRG nöronlarının yeteneği bağlantılı olarak, tercihen gerçekleştiğini göstermekSC-benzeri ASC, Şekil 3C'de sarı oklarla gösterilen.

Bu nörit oluşumu ve uzantısı ile ilgili kayda değer etkilere sahip olan, DRG nöronlarını içeren kültür sistemleri (laminin türetilmiş peptidler de dahil olmak üzere), laminin ile modifiye edilmiş alt-tabakaların kullanımı ise genellikle nöronal hücre kültürü için uygun bir tıbbi vaziyet olarak tanımlanmaktadır olduğunu belirtmek gerekir ^30-32 . Bununla birlikte, Şekil 2 ve Şekil 3D'de gösterilen sonuçlar, kimyasal ve biyolojik ipuçlarının kombinasyonu ayrıca DRG nöronlarının yanıtı arttırmak olduğunu gösterir.

Doğrudan DRG-SC-benzeri ASC ko-kültür sisteminin Şekil 1. hazırlanması. DRG nöronlar ve ASC spinal kolon ve yetişkin mal viseral ve kasık yağ sırasıyla elde edilire Sprague-Dawley rat. Enzimatik reaksiyon bir çağlayanı içinden adipoz doku sindirilmesinden sonra, ASC SC-benzeri hücrelerin farklılaşmasını ve ihtiyaç duyulana kadar alt konfluent koşullarda muhafaza edilmiştir. SC-benzeri ASC DRG hasat öncesinde her bir taban 24 saat önceden numaralı seribaşı bulunmaktadır. Günde, DRG nöronlarında ekstre edilir ve enzimatik ve mekanik olarak yürütülen bir dizi ile ayrışmış. nöronlar daha önce ekilmiş SC benzeri ASC üzerine ekilmiş ve deneye tabi tutulana kadar kültür içinde muhafaza edilmiştir (karışık ortam: kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ve modifiye BS ortamının% 50 ihtiva eder). Burada tıklayın bir büyük görmek için Bu rakamın sürümü.

Farklı kültür koşullarında DRG nöronların Şekil 2. Floresan görüntüleri.(A) muamele edilmemiş PCL filmler (B), RGD modifiye PCL filmler, (C) eş-kültür SC gibi, ham PCL filmler ASC, (D), eş-kültürlenen RGD modifiye PCL filmler SC benzeri ASC. Hücreler, modifiye edilmiş BS ortamı% 50 ve kök hücre farklılaştırma ortamının% 50 ihtiva eden bir karışık çözeltisi kullanılarak, 3 gün için kültür içinde muhafaza edilmiştir. Bu süre geçtikten sonra, hücreler,% 4 paraformaldehid içinde sabitlendi Triton-X-çözeltisi içinde permeabilize ve spesifik olmayan bağlanma bölgeleri,% 1 BSA ile bloke edildi. Ve S-100 karşı SC-benzeri ASC (AlexaFluor568; kırmızı) antikorları; nöronal hücreler daha sonra β-tubulin III (yeşil FITC) karşı boyandı. Son olarak çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Görüntüler, bir floresans mikroskobu (Olympus BX60, Japonya) kullanılarak elde edildi. Izni ile (Re-print de Luca ve ^{ark., 30.} büyük bir vers görmek için buraya tıklayınızBu rakamın iyon.

Farklı kültür koşullarında DRG nöronlarının Şekil 3. SEM görüntüleri, (A) muamele edilmemiş PCL filmler (B), RGD modifiye PCL filmler. (C), ko-kültürlenmiştir işlenmemiş PCL filmler SC benzeri ASC, (D), eş-kültürlenen RGD modifiye PCL filmler SC-benzeri ASC ile. Sarı oklar ko-kültür sisteminde doğrudan etkileşim teyit SC-benzeri ASC ve DRG arasındaki temas noktalarını gösterir. Hücreler, 3 gün için kültür içinde muhafaza ve% 2.5 glutaraldehid içinde sabitlendi. Dereceli etanol serisi (% 50,% 70,% 90,% 100) dehidrasyon sonra hücreler son olarak heksametildisilazan ile durulanmış ve SEM analizi için püskürtme kütüklerden ve altın monte edilmeden önce kurutulmuştur. Görüntüler hızlanan vol ile SEM (Zeiss EVO60, İngiltere) kullanılarak elde edildi10kV ve tage. (De Luca ve ^{ark., 30} izniyle yeniden baskı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Birincil kültür in vivo axotomy sonra nöronların rejenerasyon çalışması için DRG nöronlar sıklıkla nöronal hücreleri arasında kullanılır. İşte yetişkin farelerin DRG hasat için doğru bir protokol nöronal hayatta ödün vermeden çevredeki uydu hücrelerinin nüfusu azaltmayı amaçlayan, sunulmuştur. SC-benzeri fenotip ayrışmıştır ASC gibi, hücre terapisi için SC için geçerli bir alternatif, SC-benzeri ASC / DRG ko-kültür sistemi de detaylı bir şekilde tarif edilmektedir.

^{33 -} yaygın laminin (veya laminin türetilmiş peptid dizileri) nöron sağkalım ve nörit oluşumu ³¹ üzerinde yararlı bir etkiye sahip olduğu bilinmektedir. DRG nöron kültürleri gerçekleştirirken bu nedenle nöronal hücrelerin işlevsellik kaybını önlemek için, önceden kaplanması için laminin ile her alt tabaka, tavsiye edilir. laminin kaplama kavramı da tasarımı için biyomalzeme yüzeylere uygulanırpoli doku mühendisliği yapılan, - kaprolakton (PCL) sık sık sinir boruları ³⁰ üretimi için de kullanılır. Aynı zamanda, önceki eser, fibrin matrisi üç boyutlu ¹¹ nöronal kültürler için uygun malzemeler olduğunu ortaya koymuştur.

Protein kaplamasına ek olarak, ko-kültür modelleri DRG nöron sağkalım ve yaralanma sonrası periferik sinir sistemindeki nöronların, SC arasında meydana gelen etkileşimler üzerinde çalışmak için uygun bir ortam için değerli koşulları sağlar. Hücreler ayrıca, yara alanında otolog hücrelerin alım süresini kısaltmak için nöral cihazları kullanarak, in vivo olarak transplante edilebilir. Bu hücre yaşlanması / ölümü ve kas atrofiye neden olabilir ağır yaralanmalar, özellikle önemlidir. SC periferik sinir rejenerasyonu ve miyelinasyonu, sınırlı kullanılabilirlik ve yavaş çoğalması oranı sürecine dahil en önemli glial hücreler olmasına rağmen onları uygun haledoku mühendisliği uygulamaları ^34. ASC nedeniyle bolluk ve SC fenotip içine ayırt yeteneği, belirli glial belirteçleri ifade ve yerli SC ¹⁹ fonksiyonel benzerlikler gösteren bir geçerli bir alternatif vardır. ASC, aynı zamanda, bir ko-kültür sisteminde DRG nöronlarının formasyon ve nöritlere genişletilmesi için faydalı olabilir proteinleri ve büyüme faktörleri ⁵ üretebilmektedir. Ancak, iki farklı ko-kültür sistemleri deneysel ihtiyaçları fonksiyonu olarak ayarlanabilir. Bu çalışmada önerilen yöntem laboratuarımızda ¹¹ köklü protokolün gözden geçirilmiş bir versiyonu ve ikinci hücre tipi (DRG nöronlar) numaralı seribaşı olan iki hücre tipleri arasında doğrudan bir temas (doğrudan ko-kültür), içerir diğerleri (SC-benzeri ASC) üstünde. Bu yaklaşım, nöron hücreleri ³⁵ ekim sırasında alt tabaka üzerinde bir glial hücre tabakasının bulunmasının önemini gösterdi önceki bulgulara dayanmaktadır ^{- 37. Bu etki, kök hücre yüzeyinde ASC ve diğer bilgileri çökeltilen DRG integrinler ile hücre-hücre etkileşimleri ve ECM moleküllerinin nedeniyle olasıdır. Aynı zamanda, ortam maddesi içinde serum bir azalma ASC fonksiyonlarını etkilemeden, DRG nöronlarının ayrışma türetilebilen uydu hücreleri, kirletici proliferasyonunu düşük olduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, SC içeren küçük bir popülasyonda uydu hücreleri, tam da ko-kültür sisteminde mevcut olacaktır DRG nöronlarının ve birkaç diğer hücre kültürlerinden ortadan kaldırmak zordur. Bu küçük alt-popülasyonları da yaralanma sonrası in vivo mevcut olan otolog hücrelerin hatırlatarak, in vitro çalışmalar sırasında miyelinasyonun süreçlerine katılmaları dikkat etmek önemlidir. İkinci yaklaşım (burada sunulmamıştır), iki farklı hücre tipleri arasında doğrudan bir temas (aktarmalı ko-kültür) kaçınarak, hücre kültürü insertlerin kullanımını içerir. Ancak buradaner, sinir rejenerasyonu (uzun nevritlerle geliştirmek için nöronal hücrelerin azalması yeteneği) sırasında in vivo koşullarda temsilcisi değil, ama diğer 38 üzerine belirli bir hücre popülasyonu tarafından ortamda yayımlanan yayılabilir faktörlerin etkisini araştırmak için kullanılır .}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µm cell strainer	BD Biosciences	352360	70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative
15 ml plastic tubes	Sarstedt	62.554.002
50 ml plastic tubes	Sarstedt	62.547.004
75 cm2 flasks	Corning	BC301
Retinoic Acid >98% HPLC	Sigma	R2625
ARA-C supplement	Sigma	C6645
Recombinant Human FGF-basic (154 aa)	Peprotech	100-18B
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9205
Collagenase type I	Gibco	17100-017	Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion
Collagenase type IV	Worthington Biochemical	LS004188	Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants
Foetal Bovine Serum (FBS)	Biosera	FB-1001
Forskolin	Sigma	F3917
Glass pipettes	Fisher Scientific	FB50253	Sharp material to be disposed accordingly
Glial Growth Factor-2 (GGF-2)	Acorda Therapeutics		GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml
Nutrient Mix F12 HAM	Sigma	N6658	Warm at 37 °C in a water bath unless specified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9394	Warm at 37 °C in a water bath unless specified
N-2 supplement (100x)	Invitrogen	17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands  (NGF)	Millipore	NC011
Penicillin-Streptomycin (PS)	Sigma	P0781
[header]
Petri dishes	Corning	430165
Recombinant Human PDGF-AA	Peprotech	100-13A
Trypsin	Invitrogen	25200-056	Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks
Trypsin (2x bovine pancreatic)	Worthington Biochemical	LS003703	This is used for DRG dissociation
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma	M8042	Warm at 37 °C in a water bath unless specified
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148	Prepare the solution in the biological cabinet