Bir Hidrojel Construct ve Fare Miyokard Enfarktüsü Modeli Therapeutics sunun için Tutkal Yaklaşım Fibrin tabanlı.

Özet

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

Özet

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo¹. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased.

Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream^2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream⁵. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Giriş

Bir miyokard enfarktüsü (MI) büyük bir koroner arter tıkanmasına neden olduğu kalp bölgeye kan kesintisiz olarak tanımlanır. Bir MI kaynaklanan hasar nedeniyle ya da daha spesifik olarak, sol ventrikül düzgün yenmek için kalp yeteneğini azaltır fonksiyonel olmayan skar dokusu içine canlı kalp dokusunun yeniden, etmektir. Bu vuruş hacmi olarak bilinir, her kalp atışı, ve ejeksiyon fraksiyonu ⁶ olarak bilinen her kalp atışında kalp dışarı pompalanır, bir kan yüzdesi, gövdeye teslim edilebilir kan hacminde bir azalma ile sonuçlanır. Bunlar, diğer azalmış fonksiyonları ile birlikte, yeterli işlevini korumak için kalbin geri kalanı üzerinde gerginlik artar. Ikinci bir kalp krizi, bireylerin ⁷ yaklaşık% 10'unda görülen bir fenomen neden sık sık bu artış suş çok şiddetli olabilir.

Tıbbi uygulamalar tedavisinde geliştiğini ikenBir MI hemen sonrasında, hiçbir teknik, yavaş, durdurmak veya doku yeniden olumsuz yan etkilerini tersine çevirmek için geliştirilmiştir. Kök hücre terapileri da umut verici etkisine karşın, bununla birlikte, böyle bir tedavi için, olası bir yol olarak ortaya çıkmıştır kök hücreler klinik başarılı kanıtlanmamıştır. Onların eksikliklerini bir teori yararlı hücreler olumlu sonuçlar üretmek için ⁵ yeterince uzun enfarktüsü yerinde kalmasını sağlamak için yetersizliğidir. Bu sadece enfarktüs sitesi içine enjekte edilir hücrelerin en fazla% 24 hayatta kaldı ve zarar görmüş Alanı 1 gün sonrası teslimat ² de kaldığı gösterilmiştir. Hücre tutma, bu konuyu ele için olası bir ihtimal hücreleri veya hasarlı siteye teslim edilebilir terapötikleri ya saklanması biyouyumlu hidrojel sistemleri geliştirmektir. Bu protokolde seçim hidrojel nedeniyle hücre encapsulation pr önceki kullanımına bir poli (etilen glikol) dimetakrilattırocedures Bununla birlikte, kapsülleme yeteneğine sahip herhangi bir hidrojel ⁸ kullanılabilir. yaralanmanın sitesine yama dağıtım hücreleri yatan miyokard yararlı faktörler sağlayabilir süreyi artırmak, uzun bir zaman süresi boyunca hücreden doku teması sağlar.

Yama yaklaşımına bir darboğaz kalp yüzeyine yapışan yama zorluğudur. Birçok grup teknikleri, kalp yüzeyine ^9,10 için yapı kravat basit bir dikiş olmanın en yaygın çeşitli aracılığıyla bunun üstesinden gelmiş. Bu yapı, daha sert bir malzemeden imal edildiği durumlarda, bir dizi başarılı olduğu kanıtlanmıştır, ancak, yüksek su konsantrasyonu ve yama yapısının hassas doğası, bir hidrojel sistemi üzerinde çalışırken başarısız olmuştur. Bunun üstesinden gelmek için, biz pıhtı oluşumu kimyası taklit eden bir fibrin yapıştırıcı dış yapıştırıcı sistemini kullanmışlardır. Fibrin yapıştırıcı inc, çok sayıda tıbbi ameliyatlarında kullanılmaktadırBir yara dolgu ^11-13 olarak ürünün biyouyumluluk vurgulayarak, dura gözyaşları, bronşiyal fistül ve kornea nakli luding. Buna ek olarak fibrin Bununla birlikte, kalp yama için bir yapışma yapıştırıcı olarak kullanımı yaygın olarak ^14-17 kullanılmaz sol ventrikül kopmalar ve koroner arter by-pass ameliyatları cerrahi tedavisi de dahil olmak üzere kalp amacıyla, çeşitli kullanılmıştır. Kalp etkileşim yama sağlamak için uygun bir yapıştırma sisteminin sağlanması, harici kalp yama dışında doğrudan yerleştirilebilir, bir biyo-uyumlu yapıştırıcı Trombin ve fibrinojen sonuçları basit bir formülasyon.

Protokol

Prosedür IACUC protokolü numarası 13302 ile tam uyumluluk içindedir ve hayvan kaynaklarının bölünmesi tarafından onaylandı.

1. Enstrüman Hazırlık

1. Sterilite sağlamak için cerrahi işlem öncesinde kullanılan tüm olmayan tek kullanımlık aletleri otoklavlayın.
2. Kullanımlar arasında bir cam boncuk sterilizatör bir oturumda birden çok kez kullanılan aletleri sterilize edin.

2. Hidrojel Hazırlık

1. Çözülme ve hidrojel yapının oluşturulması için en az 24 saat önce plaka kök hücreler.
2. Önceki yayınlarda ^8,18 detaylı bir şekilde tarif edilmiş bir stereolitografi aparatı kullanılarak cerrahi (ya da benzer bir alet), bir gün önce, yamalar hazırlayın.
3. Hidrojel oluşturmak için, ilk olarak istenen yama bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) modeli oluşturmak ve stereolitografik biçimi (STL) tasarımını ihracat.
4. Dissolvin bir ön jel çözeltisi oluşturmakSteril 1x PBS g poli (etilen glikol) dimetakrilat (PEGDMA)% 20 ağırlık / hacim solüsyonu elde etmek için. Aynı zamanda, foto-başlatıcı 1- [4- (2-hidroksi-etoksi) -fenil] -2-hidroksi-2-metil-1-propan-1-on, DMSO içinde çözülür. / 0.5 hacimce% nihai olarak PEGDMA çözeltisine foto-başlatıcı ekleyin. Doğrudan çapraz bağlama öncesi hücrelerin istenen yoğunlukta 100 ml. Not: hücre / ml önerilir ⁶ 10 x -2.0 ⁵ 10 x 2.0 arasında bir hücre yoğunluğuna.
5. SLA platformun ortasında bir çanak içine önceden jel çözümü Pipet ve önceden yüklenmiş STL formatlı tasarımı ile SLA yazılımını çalıştırın.
6. Aletinden yamalar çıkarın ve Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı,% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM), 100 U / ml penisilin hidrojeller göre O / N inkübe ve hücreler, ayarlamak için 100 mg / ml streptomisin izin vermek için yama içinde çevreye.

3. Hayvan Hazırlama ve Sözlü intubatiüzerinde

1. Onların kafes arkadaşları ile onların tımar alışkanlıkları ve etkileşimleri belirlenen hayvan, sağlık durumunun iyi olduğundan emin olmak için prosedür öncesinde her fare değerlendirin. Not: Bayan 8-10 haftalık C57BL / 6J fareler bu işlem için kullanılan, ancak, herhangi bir fare yaş ve tipi kullanılabilir.
2. Bir anestezik odasına hayvanları yerleştirin ve 1 L / dk O ₂ desteği ile% 5 isofluorane maruz. Ayak tutam refleks ile anestezi düzeyini izleyin.
3. Hayvan düzgün uyuşturulduktan sonra, tartmak ve entübasyon standı üzerine koyun.
4. Hayvanın göğüs boşluğuna doğru bir ışık kaynağı yönlendirin ve ses tellerini laringeal yüzeyini geri çekin ve ortaya çıkarmak için forseps kullanabilir. Dikkatle ses tellerinin arasında 20 G angiocath rehberlik ve sorunsuz trakea içine yerleştirin. Kateter küçük hayvan ventilatöre bağlı bir kez göğüs boşluğunun mekanik hareketi ile uygun ekleme algılar.
5. Inci havalandırma ayarlarını yapınüreticinin yönergelerine göre hayvanın e ağırlığı.
6. Entübe sonra hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. Isıtma yastığı 40 ° C'yi aşmaması emin olun. Gerekirse, yanık şansını en aza indirmek için hayvan ve ısıtma yastığı arasında bir bariyer yerleştirin.
7. Bir epilasyon kremi kullanılarak cerrahi bölgeden saç çıkarın. Doğru sterilizasyon sağlamak için Betadin ve% 75 etanol 3 alternatif scrubs tarafından siteyi sterilize edin. Sadece cerrahi siteyi açığa ve işlem sırasında kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem yerleştirmek için bir örtü yerleştirin.

4. Cerrahi Prosedür

1. torakotomi nedenle, sternum uzunluğu çalışan sternum sol, bir cilt kesisi yaklaşık 1 cm yapmak, hayvanın sol tarafında yapılır.
2. Iki adımda yatan göğüs kafesi arasında kas tabakası ayrı forseps kullanın. Bir Deline'a gözlemleyinhayvan pektoralis majör kaslarını gösteren ating hattı. Altta yatan dış eğik kas ayırmak ve mediale geri, biraz bu kası kaldırın. Ardından, aynı şekilde yatan göğüs kafesi dış oblik kas özgür ve ikinci, üçüncü ve dördüncü kaburga bir unobscured görünüm sağlayan, yanal geri çekin.
3. Üçüncü ve dördüncü kaburga arasındaki torakotomi gerçekleştirin. Yavaşça dördüncü kaburga kaldırın ve üçüncü ve dördüncü kaburgalar arasındaki göğüs boşluğunu açmak için bir cauterizer kullanın. Ayrıca boşluğu açmak ve kalp maruz Ekartörleri yerleştirin.
4. Kalbin ince perikard rüptürü için forseps kullanabilir.
5. Bir 8-0 monofilament naylon sütür ile sol koroner arter Arter. Doğrudan sol atrium alt ucu altında, yaklaşık 4 mm kalbin apeks gelen dikiş yerleştirin. Ventriküler miyokard bir blanching ve Sutu sonra sol atrium boyutunda bir artış ile doğru dikiş yerleştirme belirleyinYeniden bağladı edilmiştir.

5. Patch Yerleştirme ve Tutkal

1. Kullanılana kadar _CO2 şartları, 37 ° C'de tutun yamalar ve% 5.
2. Yavaşça düz uçlu spatula ile yama kaldırın ve yavaşça infarktüsü yerinde, kalbin bir yüzeye yerleştirin.
   Not: Sol ventrikül kaymasını önlemek için, yama hafifçe spatula ya da forseps bir çift ucu kullanarak kişiyi koruyarak yerinde tutulabilir.
3. Trombin, fibrinojenin: 1 oranını 4 karıştırılarak tutkal hazırlayın. Bu hazırlık başladıktan sonra genellikle 1 dakika içinde, kalınlaştırmak başlayana kadar tekrarlanan pipetleme çözüm karıştırın.
4. Çözelti viskozitesi istenen seviyeye ulaştığında, hızla yama yüzeyine yaklaşık 10 ml aktarın. Not: fibrin yapıştırıcı pıhtılaşma zamanı hızlıdır, tutkal verimli transferi için küçük bir fırsat penceresi sağlar.

6. Dikiş

1. 6-0 monofilament naylon dikiş kullanarak tüm kapanış sütür gerçekleştirin.
2. 3-4 ayrı kesintiye dikişlerle kaburga katmanı kapatın.
3. Interkostal katmanın tam kapanmasından önce, kapatma işlemi tamamlandıktan sonra göğüs boşluğuna tahliye ve uygun intraplevral basınç yeniden kurmak için kesi içine PE-10 kanül yerleştirin.
4. 3-4 ayrı kesintiye dikişlerle göğüs kasları kapatın.
5. Sürekli dikiş ile cilt katmanı mühür.
6. Tam kapatılması sonrasında, kanül sonuna 1.0 ml şırınga takmak ve göğüs boşluğunu tahliye için kullanabilirsiniz.
7. Dikiş sitesini güçlendirmek için kesi sitesine doku yapıştırıcısı sürün.

7. Post-cerrahi tedavi

1. Fareler buprenorfin (0.05-1.0 mg / kg) ve deri altından hemen önce canlanma koroner ligasyon ve en az 20 dakika, aşağıdaki karprofen (2.2 mg / kg) enjeksiyonu ver. Her iki ilaç da ameliyattan sonra 6-8 saat yönetmeVe sonra ağrı ve sıkıntı kontrolü üç gün süreyle günde iki kez vermek.
2. Sürekli ilk 4 saat aşağıdaki ameliyat için bilinçli ve her saatte kadar hayvanları izlemek. Analjezik ikinci bir dozunu vermek için ikinci bir sağlık kontrolü ameliyat (2-4 saat sonra) gecesini gerçekleştirin.
3. Hayvanlar kararlı görünen kadar prosedürü izleyerek ikinci günden sonra her gün hayvanları izleyin.

Kalp Fonksiyonu ve Histoloji 8. Analiz

1. MI Aşağıdaki hasarın boyutunu belirlemek için prosedür izlenerek fareler 4 hafta echocardiographs gerçekleştirin.
2. Inhalasyon anestezi indüksiyonu için bir anestezi odasının içinde% 4-5 izofluran ile fareler anestezi ve bakım anestezi için yüz maskesi aracılığıyla daha sonra% 2 izofluran.
3. Bir tüy dökücü krem ​​ile görüntüleme alanını temizleyin ve kalpte bir 2B M-mod ekokardiyografi tarama elde etmek için küçük bir hayvan ultrason kullanımı ve fonksiyonel parametreler asso kayıtonunla anılmaktadır.
4. Daha sonra 24 saat boyunca bir% 10 formalin çözeltisi içinde hayvanlar ve yerden kalpleri toplamak, bir karbon diyoksit odasında fareler öldürülür. 24 saat sonra,% 70 etanol kalpleri aktarmak ve doku işlenene kadar 4 ° C'de tutun.
5. Kalpleri işlemek ve parafin bloklar onları gömmek.
6. Apeks başlayan ve atrium biten, kalbin ventriküler bölgesi boyunca 5 mm bölümleri kesin.
7. Leke Masson trikrom ve hematoksilen ve standart protokoller kullanılarak eozin leke hem dilimleri kesitli.

Sonuçlar

Cerrahi işlem sırasında, sol koroner arter ligasyonu bir Tıkalı arterin alt beyazlatma işaretlenmiş tarafından tespit edilebilir. Düğüm atarak önce bir test olarak, dikiş uygun yerde olup olmadığını kontrol etmek için kısa bir süre sıkılır olabilir. Ayrıca, düzgün yenmek için sol atrium yeteneği neredeyse anlık azalma arter sonuçlarının tıkanması beri, sol atrium sisteminde kan geri akışının cevaben büyütmek olacaktır.

M-mod ekokardiyografi ölçümle...

Tartışmalar

Fare MI modeline Bu yaklaşımla, diğer kemirgen MI teknikleri ile ilişkili olmayan miyokard alanlara zarar en aza indiren bir sistem geliştirdik. Bu alanlar trakeostomi yol açtığı hasarı, kas tabakasının kesilmesi, ve göğüs boşluğunu maruz kaburga kırılması sayılabilir. Biz bu değişikliklerin cerrahi işlem sırasında olduğu gibi, kaburga ve kas tabakaları dahil, önemli yapıların çok sağlam tutmak için alınan bakım genel cerrahi son...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB