JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Özet

Yaralanmaya yanıt olarak karaciğer iltihabı, monositler, nötrofiller, T hücresi alt kümelerinin, B hücreleri, doğal katil (NK) ve NKT hücreleri de dahil olmak üzere, lökositlerin farklı alt süzmeyi söz konusu eden bir yüksek dinamik bir süreçtir. Bağışıklık hücre göçü izlemek için karaciğer intravital mikroskopi, numune hazırlama ve fiksasyon, optik çözünürlük ve uzun süreli hayvan yaşam konusunda yüksek gereksinimleri özellikle zordur. Ancak, inflamatuar süreçler yanı sıra hücresel etkileşim çalışmaları dinamikleri daha iyi inflamatuar karaciğer hastalığı başlatılması, ilerlemesini ve gerileme anlamak için kritik bilgiler verebilir. Bu nedenle, son derece hassas ve güvenilir bir yöntem yoğun bakım ile kombinasyon halinde göç ve intravital iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu (TPLSM) uzun bir süre (yaklaşık 6 saat) fare karaciğer, farklı bağışıklık hücreleri, hücre-hücre etkileşimini incelemek için kurulmuştur izlenmesi. esi "> Resim yöntem yumuşak bir hazırlama ve organın en az pertürbasyon ile karaciğerin stabil bir sabitleme içeren, uzun süreli intravital görüntüleme izleme sağlayan, en fazla 6 saat arasında bir zaman dilimi boyunca hemen hemen hiçbir ışıkla ağartma ya da fototoksik etkileri ile çok renkli multiphoton mikroskopi kullanılarak ve fare hayati parametreleri ve dolaşım, sıcaklık ve gaz değişimi istikrar geniş izleme nedeniyle istikrarlı görüntüleme koşulları, özel lökosit alt gruplarının.

CXCR6.gfp karaciğer iltihabı üzerine lenfosit göçünü araştırmak knock-in farelerde bazal şartlar altında ve karbon tetraklorid, periton içine enjekte (ler) i (CCl4) neden olduğu akut ve kronik karaciğer hasarı sonrası intravital karaciğer görüntüleme tabi tutuldu.

Doğal Katil (NK) - - ve aynı zamanda, CD4 T hücreleri gibi T lenfositlerinin alt grupları fakat mukozal Associ CXCR6 esas Doğal Katil T (NKT) lenfositlerin eksprese edilen bir kemokin alıcısı, birated değişmez (MAIT) T hücreleri 1. Bir karaciğer hasarı üzerine kendi değişmiş davranış içine ayrıntılı fikir ve hastalığın ilerlemesinde dolayısıyla potansiyel katılımı izin CXCR6.gfp + bağışıklık hücrelerinin göç desen ve konumlandırma ardından.

Giriş

hücre ve bütün organlarda hücresel fonksiyonlar ya da hatta bütün bir organizma görselleştirme gövde 2'nin hemen hemen tüm parçaları dahil olmak üzere, 50 yıldan fazla bir büyük bir ilgi olmuştur. Bu nedenle, bazı erken çalışmalar zaten karaciğer 3,4 intravital görüntüleme istihdam. Ancak, çeşitli sınırlamalar karaciğer dokusunun uzun vadeli istikrarlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile ilgili güncel var.

Nedeniyle diyafram ve gastrointestinal sistem 5 ile yakın temas içinde karaciğer anatomik pozisyonuna, mikroskobik intravital görüntüleme için en yaygın sorun, bağırsak 6 daha az bir ölçüde, peristaltik hareket solunum nedeniyle ve. Diğer katı organlara kıyasla, karaciğer cerrahisi özellikle zordur. Nedeniyle yoğun mikrovasküler yapı, cerrahi manipülasyon, masif hemorajik lezyonlar ikamet bozulmuş mikrosirkülasyon 7 ve ayrıca aktivasyonunu yol açabilir iBu tür Kupffer hücrelerinde 8 olarak mmune hücreleri. Bu nedenle, doku mekanik tespit 6,9 intravital mikroskopi görüntüleme ile müdahale muhtemeldir yerde yayınlanan.

Sağlıklı bir karaciğer toplam kan hacminin% 10-15 karaciğer damar içinde bulunduğu, ve organ dolaşımdaki değişiklikler (örneğin, kan basıncı dalgalanmaları oldukça duyarlı bir organ oluşturma, genel kalp debisi 10 civarında% 25 alır ). Bu nedenle, aşırı doku işleme veya merkezi dolaşımı yoluyla örneğin, kayma gerilmesi, yerinden, yaralanma hepatik kan akımı aksamalar yanı sıra karaciğer bağışıklık yanıtları etkileyen, lökosit göç davranışı yapay değişiklikler, bozulmuş karaciğer oksijenlenme ve bu nedenle daha fazla karaciğer hasarına yol açacaktır organ koruyucu ve hayvanın genel yaşam süresidir.

Erken mikroskobik çalışmalar Intravital epifloresans mi dayanmaktadırcroscopy, ancak böyle bir fotoğraf ağartma ve düşük penetrasyon derinliği gibi çeşitli teknik kısıtlamalar uzun vadeli karaciğer görüntüleme 4,11,12 için bu tekniğin kullanımını sınırlamak. Bu yeni yöntem, gerçek yaşam durumları 13-15 altında hemen hemen tüm organlarda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek için teknik yetenekli olduğu gibi 1990'larda multiphoton mikroskopi gelişmesiyle birlikte, fotoğraf beyazlatma veya penetrasyon derinliği sınırlamalar çoğunlukla, çözüldü. Ancak, karaciğer görüntülemesi açısından ana kalan zorluklar vardı: birkaç saat 16 daha uzun süre hepatik Sinüsoidlerde değiştirilmemiş kan akışını ve özellikle kararlı görüntüleme güvence nefes hareketleri, karaciğer dokusunun otofloresansı.

Çeşitli çalışmalar karaciğer 17, örneğin, NKT hücreleri 18-20, T hücreleri 21,22, karaciğer makrofajlar 23,24 veya nötrofiller 25, uzun vadeli multiphoton m fonksiyonu ve çeşitli lökositlerin göçünü ele rağmenicroscopy görüntüleme henüz başarılı nedeniyle daha fazla hasara 26 mevcut hasar ve dolayısıyla daha yüksek duyarlılığa bir görev daha zorlu akut veya kronik karaciğer hastalığı olan hayvanlarda, kurulmuş olmasaydı. Ancak, gerçek zamanlı olarak karaciğerde lökositlerin göç davranışlarını ve hücresel fonksiyonu izleme karaciğer homeostazı ve hastalık 27 kendi özel rolü yeni bakış açıları sağlar.

Kemokin reseptörü CXCR6, doğal öldürücü (NK) hücreler, NKT hücreleri ve bazı T hücresi popülasyonları 18,28 dahil olmak üzere birçok lenfosit alt, ifade edilir. Farelerde Önceki çalışmalar CXCR6 ve aynı kökenli bağ CXCL16 homeostazı karaciğer sinüsoidlerinden üzerinde NKT hücrelerinin devriye kontrol olabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, (CXCR6 lokusunda yeşil floresan protein [GFP] bir knock-in taşıyan) CXCR6.gfp farelerin kullanılması, beyin 29 gibi çeşitli organ lenfosit göçünü araştırmak için tarif edilmiştirve ayrıca karaciğer 18,20, enflamasyon üzerine CXCR6.gfp hücrelerin infiltrasyonunu artış göstererek.

Bu çalışmada verilen yöntemle stabilize koşullar altında uzun bir süre boyunca, bu işlemleri takip edilmesi mümkün olmuştur. Intravital multiphoton bazlı prosedür hayvan ve organın minimal pertürbasyon ile son derece tekrarlanabilir oldu görüntüleme izin; solunum ve dolaşım yakın kontrolü ardından geniş izleme uzun süreli hayvan yaşam için optimize edilmiş; ve son derece esnek ve kolay gibi böbrek veya dalak gibi diğer parankimal organlarda da benimsemeye.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: deneyler (NIH yayın, 8. baskı, 2011) 'bakım ve kullanım Laboratuvar Hayvanlar olan Kılavuzu'nda' Aşağıdaki hayvan çalışmaları düzenleyen Alman mevzuatına uygun olarak yapıldı ve hayvanların korunması konusunda Direktif 2010/63 / AB Bilimsel amaçlı (Avrupa Birliği Resmi Gazetesi, 2010) için kullanılır. Resmi izin hükümet hayvan bakımı ve kullanımı ofis (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Almanya) verildi.

NOT: Kısa vadeli görüntüleme için atlanabilir adımlar hazırlık süresini azaltmak ve cerrahi protokol basitleştirmek için yıldız (*) ile işaretlenmiştir (örn da çekim, 3-D yığınları ya da kısa süreli time-lapse mikroskopi ek). Gerekli Ancak, hayatta kalma süresi büyük ölçüde azalmış olması durumunda Görüntüleme aynı zamanda geniş bir izleme ve sirkülasyon kontrolü olmadan gerçekleştirilebilir.

1. Mikroskop Kurulum ve Ön-cerrahi Hazırlama (5-10 miln)

  1. (Mikroskop, güç Lab, lazer, ısıtma yastığı, klima odasının, web cam, şırınga pompası cihazının, solunum) açın sistemi.
  2. 1.5% Vol Ç 2 Isoflurane Vapor beslemesini ve set İsofluranın seviyesini bağlayın (v / v), küçük bir hayvan solunum cihazına bağlanmak.
    1. Kısa süreli görüntüleme için, sadece ilk ip anestezi indüksiyonu sonrası izofluran kullanarak anestezi korumak (adım 2.2). Daha sonra stabil, karaciğer mikro dolaşımı garanti altına almak için hacimce% 2 (hac / hac), izofluran kullanımı, ve 2 saat aşağıdaki görüntüleme zaman tutmak.
  3. 150-200 ul hacminde 120-140 solunum devir / dak solunum ayarlayın.
  4. Fare agaroz sahne ayarlayın. 40 ° 'lik bir açı ile bir çanak (yaklaşık 10 cm x 15 cm, baz) içine dökülerek,% 3 (w / v) agaroz 100 ml hazırlayın.
  5. Gerekli aletleri toplama cerrahi çalışma alanını ayarlayın. Mikrobiyal enfeksiyonu önlemek için, Sekusept Forte S bir% 1 çözeltisi (kullanarak aletleri% 9.9 w / v dezenfekte) Glutaraldehit w / v% 9.8, deney (Şekil 1A önce 5 dakika için formaldehit).
  6. Kalan bileşenler elde edilir: Cilt dezenfektan (örneğin,% 10 povidon iyot solüsyonu), karaciğer aşama (yığınları ve köprü), agaroz çözeltisi (% 3 (w / v) PBS içinde)% 5, şırınga pompası (ağ / hac) glikoz çözeltisi anestetik çözeltisi (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 0.5 mg / ml, Fentanil 5 ug / ml), pamuklu, n-Butil-2-Cyanoacrylat ve 1x PBS ile (G-5), enjektör pompası olabilir. Ön ısıtma için kuluçka odasına agaroz sahne çanak koyun.

2. Trakeotomi (10-15 dk)

  1. 25-28 g ağırlığında ev yetiştiriciliğinde gelen C57BL / 6 fareler kullanın. House, 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık çevrimi olan bir ısı- olarak FELASA kılavuzlarına uygun ve nem kontrollü bir ortamda belirli bir patojen içermeyen koşullar altında fareler. Hayvanların standart fareler diyet (koklayın Standart Kemirgen Diyet) ve su ad libitum ücretsiz erişime izin ver.
  2. Init tarafından fare anestezisiial intraperitonal anestetik II çözeltisi 250 ul (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 1 mg / ml, Buprenorfin 10 ug / ml) (İP) enjeksiyon.
    1. * Intravital görüntüleme sırasında bakım için, sürekli kesintisiz ip enjeksiyonu ile anestezi çözeltisi I yönetmek (Ketamin 0.1 mg / ml, iksilazin 0.5 mg / ml, Fentanil 5 ug / ml), 0.2 ml / st bir akış oranında bir şırınga pompası cihazı kullanılarak enhalasyon izofluran 0.5% Vol kombinasyonu (hac / hac).
    2. , Trakeotomi için cildi dezenfekte, 5 dakika (forseps ile örneğin tutam ayak pedi) sonra refleksleri kontrol fare cerrahi hoşgörülü anestezi durumunda ise hazırlık başlar.
    3. (Şekil 1B) kurumasını önlemek için göz kornea koruyucu krem (örneğin, Dekspantenol 50 mg / g) uygulayın.
  3. Ekstremitelerde için yapışkan bant kullanılarak ventral tarafı açığa hazırlık masaya fareyi sabitleşmek; yavaşça, bu pozisyonda sabitleşmek örneğin., boyun daraltabilir, bir lastik bant kullanarak t bağladımkesici dişler o.
    1. Bir pamuklu çubukla dezenfektan uygulayarak, povidon iyot solüsyonu kullanarak cilt ve kürk dezenfekte edin.
  4. Doğrudan çene altına ilk cilt kesme (0.5-1 cm uzunluğunda) gerçekleştirin (Şekil 1C)
    1. Dikkatle, tükürük bezlerinin (Şekil 1D) arasındaki bağ dokusunu incelemek.
    2. Dikkatlice açın kas tüp çevreleyen trakea (Şekil 1E, F) gözyaşı.
  5. Daha sonra havalandırma tüpü sabitleme (Şekil 1G) için trakea altında cerrahi iplik yerleştirin.
    1. T-şekilli kesi performans kıkırdak halkaları arasındaki mikro-makas ile Açık trakea (Şekil 1 H)
  6. Insizyon (~ 0.5 cm) ile trakea içine havalandırma tüpü yerleştirin. Ileri tüp itin küçük anatomik forseps ile kaudal ucunu yakala ve yavaşça trakea içine tüp ilerletmek için (Şekil 1I)
  7. Cerrahi iplik ile tüp sabitleşmek (örn , 5-0) Adım 2.5 trakea içine tüpün etrafında bir düğüm atarak yerleştirilir; Kazara depositioning (Şekil 1J, K) önlemek için cildin borunun ikinci kranial tespiti yapmak.
  8. Doku yapıştırıcısı (örneğin, n-bütil-2-Cyanoacrylat) (Şekil 1 L) ile sızdırmaz bir kesim.
  9. Yapışkan bant kullanılarak başında tüp sabitleşmek.

3. laparotomi (15-20 dk)

  1. Hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Karın Tıraş, dikkatle deriden saç kaldırmak. Povidon iyot çözeltisi ile traş cilt ve kürk dezenfekte edin.
  2. Cerrahi makas (Şekil 2A) kullanarak sternum altında kesilmiş küçük bir cilt gerçekleştirin. Kanamayı önlemek için tüm görünür kan damarları dağlama, yanal her iki tarafa da kaburga altında kesim uzatın.
  3. Dikkatle periton (Şekil 2B) açılış, sternum altında linea alba küçük bir kesim gerçekleştirmek. Cauteriz kullanarak her iki taraf için kesim uzatıntirme (Şekil 2C, D) kanamayı önlemek için.
  4. Agaroz sahne çanak (Şekil 2E) içine fare yerleştirin. Fare (genellikle 12-14 kapak slipleri) (Şekil 2F) her iki tarafına da, uygun yükseklikte yığınları yerleştirin.
  5. Solunum ile mikroskop eşitlemek için sırtın üst solunum altında tetik sensörü yerleştirin. Tetik ünitesi (Şekil 2G) etkinleştirin.
  6. Kaburga (Şekil 2I) geri çekilmesi için sternum ile cerrahi iplik (5-0) yerleştirin.
  7. Dikkatle kavisli cerrahi makas kullanarak karaciğer ve diyafram (falsiform ligament) bağlayan bağ yanı sıra karaciğer ve gastrointestinal sistem kesti. Aorta (Şekil 2J) aşağı falsiform ligament kesin.

4. Numune Kur (10-15 dk)

  1. Büyük karaciğer lobunda kolay erişim için 45 ° 'lik bir açı ile sağ tarafta fare yerleştirin.
  2. Karın kapsayan, kaburga altında evreleme köprü eklekavite. Keskin kenarları (Şekil 2K) kapsayacak şekilde yapışkan bant kaplama standart bir kapak kayma kullanarak bir köprü imalatı.
  3. Sahnede büyük karaciğer lobu yerleştirin. Dikkatle çift bilyeli kalem probu veya karaciğer altında yastıklı spatula kayma ve ıslak pamuklu bir bez veya ıslak mendil kullanarak organın üst tutun. Slayt üzerine lob kaldırın ve nazik sürükle uygulayın. Lob bükülmüş ya da katlanabilir. Karaciğer (Şekil 2L) sadece nazik manipülasyon için ekstra bakım sağlayın.
  4. Örneğin, küçük bir kapak fişleri (20 mm x 20 mm), yanındaki karaciğer lobunun yaklaşık aynı yükseklikte yığınları kapak kayma desteklemek için yanal destek hisselerini, yerleştirin.
  5. Karaciğer lobda büyük kapak kayma (24 mm x 50 mm) yerleştirin. Bu kapak kayma olun mümkün (Şekil 2M) olarak yatay olarak aydınlatmaktadır.
    NOT: kapak kayma sıkarak olmadan doku ile temas halinde olmalıdır. Engelli kan akımı (beyaz doku) gözle görülür kontrol edin. Microcirc Eğerulation bozulur, daha kazık destek ekleyin.
  6. * Uzun süreli anestezi ve G-5 uygulama için yer iki bağımsız periton kateterler (Şekil 2N). Bir sonraki arka bacaklarda düşük karın yanal kateter takın.
    NOT: periton kateterler self-made esnek silikon tüp (Şekil 3) ile 27 G iğne bağlayarak olabilir.
  7. * Cilde 5-0 cerrahi iplik bir döngü ile sabitleşmek iğne yanlışlıkla değiştirmesini önlemek için.
  8. * Ben 1 katatere anestezi çözümü ile şırınga pompası takın, 0.2 ml / saat ayarlanmış akış hızı; 0.1 ml / saat kateter 2, G-5, şırınga pompası, sabit akış hızı ekleyin.

5. Fare İzleme

  1. * Yeri EKG ön içine elektrotlar ve arka ekstremite (Şekil 4A).
  2. * 2 seviye sensörü CO son tüp takın.
  3. (Şekil 4C ısı yastığı bağlı harici sıcaklık sensörü ekle).

6. gömülmesi ve Doku Sabitleme (5-10 dk)

  1. 3,% 1 X PBS içinde (ağırlık / hacim) agaroz 100 ml hazırlayın. Sıcaklık 5 ml'lik bir şırınga ve bir 18 G iğne (Şekil 5A) ile 41 ° C 'de iken karaciğer gömer.
  2. Lamel ve fare (Şekil 5B, C) ​​etrafında kalan agaroz dökün. Agaroz tamamen Jelatinize kadar bekleyin.
  3. Hazırlanan karaciğer lobu (Şekil 5D, E) taramak için yeterli bir viewfield büyük hazırlanması, Heidemann spatula ile fazla agaroz çıkarın.

7. Görüntüleme

  1. Mikroskop iklim odasına fare aktarın.
  2. 1x PBS 50-100 ml ekleyin (37 ° C ısıtılmış).
  3. Buharlaşma (Şekil 5F) önlemek için numune çanak örtün.
  4. * 0.5 hacmin% enhalasyon izofluran azaltın (hac / hac).
  5. * Izleme yazılımı EKG, kalp hızı ve ekspiratuar CO 2 kaydetmeye başlayın.
  6. Görüntüleme başlatın: la açmakser panjurlar, ilgi alanlarını belirlemek görünüm Z-yığınları için üst ve alt sınırını tanımlamak, ve zaman atlamalı kayıt başlar. Z-sürüklenme düzeltmek için gerekirse (Z-yığınlarının yeniden ayarlayın, örneğin. Sebebiyle kan basıncı ya da sıcaklık dalgalanması, Şekil (5G) değişikliklere.
    NOT: Hayvanların dolaşımı veya anestezi görüntüleme dönemi veya eğer tamamlanması kararsız hale geldikten sonra, (anestezi uyanış olmadan), boyunları kırılarak fareler kurban.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bizim Intravital TPLSM yaklaşımı doğrulamak için, biz intravital TPLSM görüntüleme CXCR6 GFP / + fareler tabi. Fareler, ya temel kontrol olarak tedavi edilmeden bırakıldı ve akut karaciğer hasarı 20 uyarılması için karbon tetraklorür, tek bir intraperitoneal enjeksiyon (CCl4) tabi tutuldu.

Nedeniyle yeşil floresan Video dizileri 2-5 saatlik bir süre boyunca alındı ​​ve hücreler, zaman içinde takip edildi. Genel hücresel hareketlili...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, karaciğer intravital TPLSM görüntüleme için yüksek ölçüde standardize edilmiş stabil ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmektir. Genel Intravital görüntüleme hedeflemesi ve geliştirme, homeostasis ve hastalığın farklı lökosit popülasyonlarının etkileşimi aşağıdaki gerçek hayat koşullarında hücresel davranış içine değerli anlayışlar verdi. Ancak, doğrudan diğer katı organlara kıyasla karaciğer yanı sıra yüksek kırılganlık aktarılır hangi neden...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors disclose no conflict of interests.

Teşekkürler

The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetics
BuprenorphineEssex Pharma997.00.00Analgeticum, 0.1 mg/kg
FentanylRotex Medicacharge: 30819
Fluovac anesthesia systemHarvard Apparatus34-1030
Glucose 5%Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiserEickemeyer4802885
IsofluraneForene AbbottB 506
Isotonic (0.9%) NaCl solutionDeltaSelect GmbHPZN 00765145
Ketamin 10%cevaCharge: 36217/09
Xylazin 2%medistarCharge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml SyringeBD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flaskSchott Duran21 226 36
25 ml Beaker 2xSchott Duran50-1150
2 ml syringeBD Plastipak
4-0 Vicryl sutureEthiconV7980
Agarosecommercially available
Bepanthen Eye and Nose ointmentBayer Vital GmbH6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery KitFine Science Tools Inc.18010-00
Cotton Gauze swabsFuhrmann GmbH32014
Cover Slip 24x50 mmROTH1871
Durapore silk tape3M1538-1
Feather disposable scalpelFeather02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm IDSmiths medical800/100/200
HistoacrylBraun10500525x 0.5 ml
LeukoplastBSN Medical Inc.
Microscope SlidesROTH1879
Poly-Alcohol Haut…farblos AntisepticumAntiseptica GmbH72PAH200
Sterican needle 18 G x 1B. Braun304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1B. Braun4657705
Tissue papercommercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PLGatz0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2Storz&KleinS-01134
Dumont No.7 forcepsFine Science Tools Inc.91197-00
Graefe forceps curved x1Fine Science Tools Inc.11151-10
Graefe forceps straight x2Fine Science Tools Inc.11050-10
Heidemann spatula HD2Stoma2030.00
Needle holder MathieuFine Science Tools Inc.12010-14
ScissorFine Science Tools Inc.14074-11
Semken forcepsFine Science Tools Inc.11008-13
Small surgical scissors curvedFine Science Tools Inc.14029-10
Small surgical scissors straightFine Science Tools Inc.14028-10
Standard pattern forcepsFine Science Tools Inc.11000-12
Vannas spring scissorsFine Science Tools Inc.15000-08
Equipment
ECG Trigger UnitRapid Biomedical3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide AnalyzerAD Instruments
Minivent Typ 845Harvard Apparatus73-0043
Multiphoton microscope Trimscope ILaVision
Perfusor CompactB. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorderAD InstrumentsPL3508
Temperature controlled heating padSygonix26857617
Temperature sensorcomercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&BoxLife Imaging Services

Referanslar

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955(1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693(2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 97intravital g r nt lemeTPLSMiki foton mikroskopikaraci ergmikroskopil kosit trafi iinflamasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır