Fiber Teşkilatı geçişleri ile electrospun Nanolif iskeleleri

Özet

Burada, biz liflerin Basamaklandırılmış organizasyonu ile electrospun nanolif iskeleleri imal ve hücre morfolojisi / yönünü düzenleyen kendi uygulamalarını keşfetmek için bir protokol mevcut. Nanolif iskelelerinin fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından Degrade'ler biyomedikal alanındaki uygulamalar geniş bir yelpazede sunuyoruz.

Özet

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Giriş

Nanofiberler nedeniyle yapısı ve göreceli büyüklüğü ¹ hücre dışı matriks taklit etme yeteneği doku mühendisliği için popüler bir yarar vardır. Bununla birlikte, örneğin, tendon-kemik girme mevkisi olarak bazı yerel doku arayüzler, tendon karşı uyum artar ve kemik yerinde ^2-5 azalmakta değişken bir organizasyon yapısı sergileyen kollajen lifleri içerir. Bu nedenle, etkin bir doku rejenerasyonu için etkili bir yapısal gradyanı taklit ederek, bir iskele imal etmek için bir gereksinim vardır.

Lif kompozisyonu kademeli değişiklikler üzerinde yapılan Önceleri, orada bir araştırma, özellikle, mineral içeriği ^6. Ancak, bağ dokularının yapısal bileşeni yeniden büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Daha önceki bir çalışmada sıçan Kalvaryal osteoblast çoğalması yüzey silika parçacık yoğunluğu etkisi inceleyerek morfolojik geçişlerini incelemiş ve bir Inver bulundusilika parçacığı yoğunluğu ve hücre çoğalması ^{7 ila} se ilişkisi. Ama daha önceki çalışmalarında hücre çoğalmasını aracılı morfolojik değişiklikler lif organizasyonel değişiklikler ^7,8 taklit kabiliyeti eksik pürüzleri yüzey çoğunlukla ilgili idi. Bir son çalışmada ⁹ elektrospinning için yeni bir toplayıcı kullanarak benzersiz kollajen lif yönelimleri taklit bir iskele türettiğini. Bu çalışmada hem hizalanmış ve rastgele lifleri ile bir iskele üretiminde başarılı iken, doğal dokuların sergilenen kademeli değişiklikleri taklit etmek başarısız oldu. Aynı şekilde, rasgele yönlendirmeye hizalanmış bir ani değişim ile, ayrı bileşenlerin üretiminde, bu skafold biyomekanik özelliklerini önemli ölçüde azalmıştır. Hiçbir önceki çalışmaları hizalanmış ve rastgele fiber yönelimleri sürekli geçişler ile geçerli nanolif iskeleleri üretmek mümkün olmuştur. Bizim son çalışmada Nanolif iskelelerinin başarılı rekreasyon göstermiştirpotansiyel tendon-kemik ekleme ¹⁰ de yerli kollajen organizasyonu taklit fiber organizasyonunda geçişleri ile. Bu çalışma yakından yerli tendon-kemik doku arayüzü lif örgüt andıran bir yapıya sahip Nanolif iskelelerinin üretimi için kullanılan protokoller sunmayı amaçlamaktadır.

Degrade nanolif yapıları potansiyel alanlarda çeşitli genelinde uygulamaları geniş kapsamlı oylandı. Biz zaten çeşitli yüzeylerde ^11-14 doku rejenerasyonu için kullanılmaktadır adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSCs) ile iskeleleri birleştirerek tendon-kemik ekleme sitenin doku mühendisliği uygulamaları üzerinde duruldu. Buna ek olarak, ADSCs multipotency açısından, kemik iliği kök hücreleri, doğada çok benzerdir ve kaynak basit bir yağ emme işlemi ^15,16 kullanılarak hasat edilebilir boldur. Daha gradated nanolif iskeleleri bu hücrelerin ekim kendi tis artırırPotansiyel çeşitli dokulara ayırt edebilir hücrelerin kontrollü dağıtımı için izin vererek mühendislik uygulamaları dava. Kök hücre ekim ek olarak, nanolifler hücre tepkisinin düzenlenmesi için sinyal molekülleri ile kapsüllenebilmektedir. Bu iskelelerinin örgütsel gradyan ile nanoencapsulation bağlanması hücresel davranış veya olası implant tasarımları ve kaplamaların çalışma için izin verir. Osteoblast farklılaşmasını ^15,16 indüklediği gösterilmiştir kemik morfogenetik protein 2 (BMP2), gibi fonksiyonel moleküllerin Kapsülleme ayrıca bu iskeleler ¹⁰ arasında doku mühendisliği uygulamaları geliştirmek olabilir.

Protokol

Çözüm 1. Hazırlık

1. 100 mg / ml'lik uygun bir konsantrasyonda Poli (ε-kaprolakton) (PCL), _(a, M = 80,000 g / mol) içindeki bir çözeltisi hazırlandı. 4 bir oranda, diklorometan (DCM) ve N, N-dimethlyformamide (DMF) içindeki bir karışımı içinde PCL çözülür: 1 (v / v)% 10 bir konsantrasyona sahip (ağırlık / hacim).
2. Karıştırma için 20 ml'lik bir cam tüp içinde çözelti yerleştirin. 30 dakika ultrasonik süpürge içine cam tüp koyun ya da çözelti berrak hale gelene kadar.

2. İstem hazırlanması

1. Bağlı bir 21 numara kör iğne ile 5 ml'lik bir şırınga içine hazırlanan PCL solüsyonu ekleyin.
2. Şekil 1'e göre, bir dikey elektro pozisyonda şırınga pompası yerleştirin.
3. 2 cm x hizalanmış elyaf alt-tabaka için 5 cm arasında bir açık alana sahip bir paslanmaz çelik boşluğu toplayıcı kullanın. Kolektör iğne ucundan 12 cm yerleştirin.
4. Doğrudan Akım (DC) Yüksek Gerilim güç kaynağı bağlayınİğne ve kollektör topraklayın. Toplayıcı ayrı ayrı diğer laboratuvar ekipmanı hiçbir temas topraklı emin olun.

3. Elektrospinning

1. Çıkartıldığında iğne ucunda oluşturan damlacıklar kadar 1.50 ml / saat Set şırınga pompası, hemen değiştirilir. Sonra, 0.50 ml / saat akış hızını ayarlamak.
2. 12 kV gerilim operatörü çevirin.
3. Electrospin tek eksenli hizalanmış lifler tamamen kolektör üzerindeki boşluğu kapatmak kadar.
4. Küçük bir cam plaka kenarlarına yapıştırıcı uygulanır ve cam plaka boşluk kolektöründen lifleri aktarın. Cam levha ile aynı boyuta sahiptir ve topraklanmış bir alüminyum folyo parçasının üzerine cam levha yerleştirin.
5. Şekil 3'e göre ikinci şırınga toplayıcı yerleştirin.
6. Kollektör yukarıdaki ikinci şırınga pompası ve pozisyon 2 mm plastik maske takın.
7. (A / a), PCL çözelti halinde nan için% 1 kumarin 6 eklemeoencapsulation desired- ve çözelti berrak hale gelene kadar karıştırın.
8. Künt 21 gauge iğne ile 5 ml iğne içine PCL veya PCL / Kumarin 6 çözüm yükleyin. 0.50 ml / saat dikey Pompayı ve 9 ml / sa oranında ve 1 mm / dak hızla, yaklaşık çekmek için yatay.
9. Maske kadar Electrospin kolektör kapalı neredeyse tamamen taşınmış, ancak maskenin altında hala kenar alanı vardır.

4. Fiber Karakterizasyonu

1. 40 mA bir püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak 40 saniye platin metalik damızlık ve kaplamak için çift taraflı iletken bant ile yerleştirin örnekleri.
   1. Daha önceki çalışmalarda ^17,18 uyarınca taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile lifleri inceleyin.
   2. 15 kV bir hızlandırma voltajı görüntüleri toplayın.
2. Fiber hizalama ölçmek için ayrı bir elyaf numunesi üzerinde hızlı Fourier dönüşümü (FFT) analizi yapın. FFT ile ölçüm lif uyum konusunda detaylı bilgiler t başvurabilirsinizönceki çalışmalar ^19,20 o.

5. Seeding Kök Hücre.

1. 2 saat süre ile,% 70 etanol çözeltisi içinde ıslatılmasıyla elyaf örnekleri sterilize edin. Daha sonra herhangi bir kirletici maddelerin ayrılması için damıtılmış su ile liflerin yıkayın.
2. % 95 hava /% 5 _CO2 atmosferinde 37 ° C'de 25 ^cm2 şişeye insan ADSCs kültür hücreleri elde edilir. Hücre kültür ortamı her geçen gün ¹⁰ değiştirin.
3. Hücreleri Trypsinize ve hücrelerin sayısını. Spesifik olarak, hücre kültürü şişesine tüm kültür ortamı çıkarın ve iki kez fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücrelerin yıkayın. Daha sonra, hücre tekli tabakası kapak ve 2-3 dakika için bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe bir balon (37 ° C su banyosu içinde ön ısıtma)% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 1 M ^L ilave edin. 4 ml kültür ortamı ekleyin ve her yüzey üzerinde orta pipetleme yüzeyinden tüm hücreleri yıkayın. Hücre süspansiyonu Santrifüj ve yeniden dağıtılması inciKültür ortamı içinde, e hücre topağı. Hemasitometre yoluyla hücreleri saymak. Ve 35 mm'lik bir -kültür tabağına yerleştirilir nano yapı iskelesi için 1 x 10 ⁴ hücrelerin etrafında Tohum 3 ve 7 gün için inkübe edilir.
4. Floresein sonra diasetat (aseton içinde 5 mg / ml) (FDA), görüntüyü bir flüoresan mikroskop kullanılarak numuneleri kullanılarak Leke hücreleri. Spesifik olarak, kültür kabı FDA çözeltisi 100 ul ilave edildi ve 30 dakika inkübe edilir. Üç kez floresan görüntüleme önce PBS ile hücreleri yıkayın. Bizim daha önceki çalışmalarda ¹⁰ dayalı bir özelleştirilmiş mat-laboratuar programı ile hücre yönünü analiz.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, bir kuruluş gradyanı ile, bir elyaf matın oluşturulmuştur. Şekil 3, nano yapı iskelesi üzerinde farklı yerlerde alındığı SEM görüntülerini göstermektedir. Kalitatif olarak, bu 6 mm (Şekil 3D), rasgele bir lif karışımı göz 0 mm (Şekil 3A) tek eksenli olarak yerleştirilen fiberlerin bir ilerleme olduğu tespit edilebilir. FFT elyaf hizalama bir nicel değer verir, sayısal süreçlere özelliklerini ¹⁹ burada ...

Tartışmalar

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2