Konsantrik Jel Sistemi 3D Hücre Göç Matrix mikroçevresinin biyofiziksel Rolü Eğitim için

Özet

Mekanik özellikler ve hücre dışı matris mikro güçlü hücre 3D göç etkiler. In vitro bir yöntem, nüfus ve tek tek hücre düzeylerde biyofiziksel değişken ortamlarda uzaysal hücre göçü davranışı incelemek için, tarif edilmektedir.

Özet

göç hücrelerin yeteneği tümör ve kanser metastazı embriyonik gelişim yaşamın ve yara iyileşmesi süresince hücre fonksiyonları geniş bir yelpazede çok önemlidir. Yoğun araştırma çabalarına rağmen, hücre göçü temel biyokimyasal ve biyofiziksel prensipler hala tam özellikle fizyolojik ilgili üç boyutlu (3D) mikroçevrelerde, anlaşılmış değildir. Burada, 3B hücre göçü davranışları kantitatif olarak incelenmesini sağlamak için tasarlanmış bir in vitro testi. yöntemi daha önce boş hücre dışı matriks (ECM) göç etmek hücrenin mechanosensing yeteneği ve eğilimi patlatır. Bir model sistem olarak kollajen jel oldukça invazif göğüs kanseri hücrelerinin invazyonu, MDA-MB-231 kullanımı. kültür hafta boyunca hücre popülasyonunun yayılması ve tek tek hücrelerin göç dinamikleri canlı hücre görüntüleme kullanılarak izlenir ve spatiotemporally çözülmüş verilerin çıkarılması için analiz edilebilir. AyrıcaYöntem böylece hücre göçü üzerinde mikroçevresinin biyofiziksel faktörlerin rolünü araştırmak için basit ama güçlü bir şekilde sunan, çeşitli hücre dışı matrisler için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Hücrelerin göç embriyonik gelişme, hemostaz ve bağışıklık tepkisi gibi gibi vasküler hastalıklar, enflamasyon ve kanser ¹ gibi patolojik süreçlerde çeşitli fizyolojik tepkiler içindeki önemli bir rol oynar. Hücre göçü temel biyokimyasal ve biyofiziksel faktörleri Kesme hücresel fonksiyonların temel ilkelerini anlamak için değil, aynı zamanda böyle bir doku mühendisliği anti-metastaz ve anti-enflamatuar ilaç geliştirme gibi çeşitli biyomedikal uygulamalar ilerletmek için, sadece bu nedenle temel olarak önemlidir. In vivo gözlem teknik açıdan zor olduğundan, çabalarının bir sürü hücre göçü in vitro recapitulation odaklanmıştır.

Hücre göçü incelemek için in vitro yöntemler büyük ölçüde en önemlisi, iki boyutlu (2D) yüzeylerde deneyleri için çizik olarak tasarlanmış veya tahlil ² yara iyileşmesi edilmiştir. Bu tür deneyler basit deney düzeneği sunuyoruz, kolay yaşanılırhücre görüntüleme ve hücre göçü yatan çeşitli biyokimyasal mekanizmaların yararlı açılımlar sağlamaktadır. Bununla birlikte, bu deneyler, in vivo göç anlaşılmasında kritik yönleri olan hücre dışı matris (ECM), mimari ve yeniden modellenmesi hesaba katmaz. Son zamanlarda, giderek artan bir şekilde 3B kültürü modeli, genellikle kolajen-esaslı matrisler ^3, daha iyi in vivo durum benzer bir platform temin ettiği takdir edilecektir. Nitekim, hücreler nedeniyle özellikle çevre ⁴ farklı boyutluluk için, 2B yüzeylerde olanlardan farklıdır Göçmen dinamikleri sergilerler. Ayrıca, matris biyo-fiziksel ve mekanik özellikleri, hassas tümör hücre istilası ⁶ bağlamında da dahil olmak üzere, hücre göçünü ⁵ etkiler.

Burada, biz hazırlık koşulları ile kolayca çeşitli olabilir biyofiziksel özellikleri ile ECM 3D hücre göçü davranışlarını incelemek için bir yöntem mevcut. hücrelerdirBir "iç gel" numaralı seribaşı ve içine kaçmak ve başlangıçta Aselüler "dış jel" işgal izin verilir. yöntem yakından hücre ⁷ mechanosensing bağlantılı dış jel, hücre-serbest bölgelere, göç hücrenin varlığını tanımak yeteneği ve eğilimine dayanır. Bu çalışmada, biz son derece invaziv meme kanseri hücrelerinin, MD-MBA-231 tarafından işgal ECMs olarak kollajen ağları kullanır. mekanik özellikler ve hem iç hem de dış jellerin mikro ⁸ olarak ayarlanmış ve fizyolojik olarak uygun koşulları elde etmek için ⁹ karakterize edilebilir. Hücre parça İmar ve analiz nüfus düzeyi ve bireysel hücre düzeyinde hem de uzaysal göç davranışının ayrıntılı nicel incelenmesine olanak. Önemlisi, konsantrik jel sistemi kurulumu ve böylece önemli anlayışlar sunarak, özellikle kanser hücrelerini istila, hücreler göç ile karşı karşıya in vivo doku topolojisini taklitHücre göçü ve metastaz fiziksel mekanizmaları.

Protokol

1. Hücre Hasat

1. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatöründe MD-MBA-231 hücreleri elde edilir. % 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak doku kültürü hücreleri plakadan ayırın. Bir T25 şişesi içinde kültürlenmiş bir hücre için Tripsin-EDTA solüsyonu, 1 ml kullanın.
2. 4 dakika için 200 x g'da santrifüjleme ile 15 ml konik bir tüp içinde Pelet hücreleri, süpernatanı havalandırın, ve tekrar süspansiyon hücreleri kültür ortamı, 5 ml.
3. Bir hemasitometre kullanarak, ρ, hücre yoğunluğu sayısı.
   Not: Hücre numaralı seribaşı iç jel hazırlamak için, hücre süspansiyonu daha sonra 10 × nihai hücre tohumlama yoğunluğu ulaşmak için seyreltilmiş edilecektir. Bu nedenle, 10 x konsantre hücre süspansiyonu gereklidir.
4. 10 x hücre konsantrasyonunu elde etmek için gerekli ortamın miktarı hesaplanır:
   
   Not: nihai hücre tohum yoğunluğu _son C, yaklaşık 215; 10 ⁶ hücre / ml MD-MBA-231 hücreleri için tavsiye edilir ve bu protokol kullanılır. Diğer tohumlama yoğunlukları da diğer hücre tipleri için keşfedilebilir.
5. Pelet hücreleri bir kez daha, 4 dakika için 200 x g'da santrifüjleme ile 15 ml konik bir tüp içinde süresi ve süpernatan aspire.
6. Hücre topaklanma en aza indirmek için iyice serumsuz hücre kültür ortamının (adım 1.3 hesaplanan V _ortam) gerekli miktarda tekrar süspansiyon hücreleri.
   Not: Fenol kırmızı otomatik floresan ve floresan / yansıma görüntüleme engelleyebilir. Fenol kırmızı içermeyen ortamda kullanılması en iyi görüntü kalitesini elde etmek için kabul edilebilir.

Kollajen Çözümleri 2. Hazırlık

1. Stok kolajen çözeltisi, 10 x PBS tampon, Milli-Q, _H2, O, 0.1 M NaOH ve çeşitli mikrosantrifüj tüpleri elde edilir. Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm tutun, ve steril durumunu korumak.
2. Steril cam-dengeye37 ° C inkübatör içinde ön ısıtmaya göre alt yemek.
   Not: Bu protokol tüm birimleri de 12 mm cam alt çanak için optimize edilmiştir. Diğer çanak tipi kullanılırsa, buna hacimleri ayarlayın.
3. Kollajen stok konsantrasyonuna bağlı olarak, iç jeli (çözelti l) 2.4 mg / ml kolajen çözeltisi 50 ul hazırlanması için ihtiyaç duyulan gerekli hacmi hesaplanır.
   Not: İç jeli diğer kollajen konsantrasyonları da kullanılabilir.
4. Steril bir ortamda (tipik olarak bir biyo-güvenlik kapağı) 'de yavaş yavaş hafif döndürme ile (adım 2.3 olarak hesaplanmıştır) kollajen stok çözeltisi gerekli miktarda 10 x PBS tamponu 5 ul ilave edin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkat edin.
5. Kalibre pH metre kullanılarak 0.1 M NaOH ile 7.4'e karışımın pH ayarlayın. Bir kaba bir kılavuz olarak, (miktar stok konsantrasyonu ve pH değerine bağlı olarak değişir) 7.4 pH yakın getirmek için yaklaşık 5 ul kullanın.
   Not: hacimleri bu işin unutmayınadım standart bir pH metre kullanımı için çok küçüktür. Aşağıdaki hileler birini kullanın:
   1. Birden çok numune için kolajen solüsyonları hazırlayın. Standart pH metre kullanılarak toplu pH ayarlayın ve numuneler arasında kollajen çözümleri dağıtmak.
   2. Seçenek olarak ise, daha büyük bir hacimde bir kolajen çözeltisi pH'ın ayarlanması, (i. E., Standart bir pH metre kullanımına izin hacmi). Nihai pH, pH getirmek için gereken NaOH miktarını not edin. Hacimleri küçültün ve deney için NaOH uygun miktarda kullanın. Turnusol kağıdı kullanılarak pH değeri onaylayın.
   3. Aksi takdirde, daha doğru bir şekilde az miktarda pH değerini ayarlamak için bir mikro pH elektrodu kullanın.
6. O. H ₂ kullanarak ul 45 bir hacme çözüm getir Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm adımları uygulayın.

Konsantrik Jel Kültür 3. Oluşumu

1. Önceden ısıtılmış cam alt çanak alın th (adım 2.2 bakınız)E inkübatör.
2. Çözelti I yeniden askıya almak için (adım 1.5 hazırlandı) 10 x konsantre hücre süspansiyonu 5 ul iyice ekleyin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkat edin. Karışım, hemen 50 ul arasında değişen bir hacme sahip ve _(nihai = 2 x 10 ⁶ hücre / ml c) Nihai kollajen konsantrasyonu (2.4 mg / ml) ve hücre yoğunluğu içerir.
3. Bu kubbe şeklinde bir damla (Şekil 1A) oluşturan bu yüzden de merkezine yavaş hücre içeren bir çözeltinin 20 ul ekle. Bu aşamada kabarcık oluşumunu önlemek için dikkat edin. Bir kabarcık formları ise, dikkatli ama hızlı bir şekilde çalışın ya da kopma veya pipet kullanarak dışarı emmek. Yavaşça iç jel 45 dakika süreyle polimerize izin geri inkübatör çanak koyun.
4. (Dış, aselüler kollajen jel için) çözüm O bu inkübasyon adımı bitmeden yaklaşık 15 dakika hazırlayın.
   Not: dış jel durumu kollajen konsantrasyonu ve polimerizasyon pH koşullarını değişik olabilirFarklı mikroyapılanna ¹⁰ ile ağları edinin. 7.4 arasında bir pH değerinde polimerize 4.0 mg / ml kolajen jel - Bu protokolde, 1.5 odaklanır.
   1. Kollajen stok konsantrasyonuna dayalı olarak, nihai konsantrasyonda kolajen çözeltisi O 200 ul hazırlanması için ihtiyaç duyulan gerekli hacmi hesaplanır.
5. 10 x PBS içinde 20 ul yumuşak döndürme ile (adım 3.4 olarak hesaplanmıştır) kollajen stok çözeltisi gerekli miktarda yavaş yavaş tampon ekleyin. Kalibre pH metre kullanımı ile, 0.1 M NaOH ile son pH karışımın pH ayarlayın. PH ayarlaması ile ilgili 2,5 adıma nota bakınız.
6. O _H2 kullanılarak ul 200 ul son hacme çözüm getirmek Erken kollajen polimerizasyonu önlemek için buz üzerinde tüm adımları uygulayın.
7. İç jel 45 dakika polimerizasyondan sonra inkübatör çanak alın (adım 3.3). Çözelti tamamen iç kaplayacak şekilde yavaşça iç jelinin üzerine çözelti, O 180 uljel ve kuyu (Şekil 1B) doldurur.
   1. Dış jelde homojen olmayan bir lif yönelimleri yol açabilir çözeltisi, karıştırma olmadan dikkatlice adımı gerçekleştirir. Bir pipet ile iç jel dokunmaktan kaçınmak için özen ve kabarcıkları veya hava ceplerinin oluşumunu önlemek için. Bir kabarcık formları ise, dikkatli ama hızlı bir şekilde çalışın ya da kopma veya pipet kullanarak dışarı emmek. Yavaşça dış jel, polimerik maddelerin izin inkübatör çanak geri yerleştirin.
8. Polimerizasyon 45 dakika sonra inkübatör çanak alın. yaklaşık olarak kullanıldığı takdirde yine alt yüzeyinden ayırmak, ancak jel zaten oldukça, bu noktada katılaşan olmalıdır.
   1. Yavaşça çanak (Şekil 1C) ısıtıldı hücre kültür ortamının 2 ml dökün. Jel tamamen ortamında batık emin olun. Kültür süresi boyunca 3 gün - her 2 orta yenileyin.

4. Canlı hücre Görüntüleme

1. Uzun vadeli canlı hücre görüntüleme yeteneği ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin. Dahil dahili bir sıcaklığa (37 ° C) ve _CO2 (% 5), kontrol ile inkübasyon odası. Mikroskop açın ve deneye başlamadan önce evre en az 1 saat ısıtın.
   Not: Uzun çalışma mesafesi ile kullanın objektif 3D jellerin hücrelerin gözlem ve lokalizasyonu optimize etmek.
2. 3D sistemindeki hücrelerin doğru belirlenmesine olanak tanımaktadır, 30 dakika için floresan hücre izleyici boya 5 ul ihtiva eden bir ortam içinde jel inkübe edin. Daha sonra, 1 x PBS ile yıkanarak üç kez bağlanmamış boya çıkarın. Daha sonra, çanak hücre kültür ortamı ilave edin.
3. Inkübatör çanak alın ve mikroskop aşamasında (Şekil 1D) üzerine yerleştirin.
   Not: Canlı hücre görüntüleme sağ dış jel polimerizasyon sonrası prensip olarak başlayabilirsiniz. Bununla birlikte bu noktada, hücreler in iç jel henüz yayılmış değil. Dış jel, canlı hücre görüntüleme kültürünün başlatılmasından sonra (hücre tipine göre) 24 saat başlayabilir işgal ilk hücrelerinin göçünü incelemek. Bir kaba bir kılavuz olarak, yaklaşık 12 - kültür 14 gün dış jel girmek iç jel hücrelerin çoğu için gereklidir.
4. İç jel çevreleyen dış jel bölgelerde Manzaralı (VoV en) Seç Birimleri. Kuluçkadan 24 saat, hücre popülasyonu, yayılmış olur sonra, iç ve dış jel arasındaki ara yüzü geçti ve dış jel işgal başladı.
   1. VoV en için, hemen yanındaki dış jel ^7, olay yakın jel arayüzü, ara bölgeler ve bölgelere jel bölgelerini içerir. Mümkün olan kenar etkileri önlemek için, jel üst hem de daha yakın bir alt ve yan yüzeyler ile 50 um den bölge hariç. Her VoV tipik x (647 × 647 × 100 mm ³ ölçerZ -stack 5 um aralığında olan, sırasıyla, y ve z, tarifi).
5. Emin olun görüntüleme modları, kanallar / filtreler, pozlama süreleri ve görüntü çözünürlükleri doğru seçilir. Kollajen ağının etiketi ücretsiz görüntüleme için, zaman atlamalı canlı hücre görüntüleme sırasında eş zamanlı olarak konfokal yansıma mikroskopi kullanın.
6. Örnek görüntüleri alın yoğunluk histogramlar arsa ve yeterli sinyal gözlemlemek ve histogram sıfır ve maksimum yoğunluğu arasında yatıyor sağlayarak doygunluk önlemek için kazanç ve uzaklıklar ayarlayın. Deney süresi boyunca bir daha bu ayarları değiştirmeyin.
7. 8 saat (veya gerekirse daha uzun) için 10 dakika, bir zaman aralığı, Δ t ile, seçilen VoV yılların zaman atlamalı görüntüleri çekin.

5. Hücre İzleme ve Veri Analizi

1. ÖDENEK kullanarak z -stack görüntülerden kantitatif görüntü post-processing yürütmek te görüntü işleme yazılımı.
   1. Segment time-lapse görüntüleri otomatik olarak (x, y, z, t) 3D hücre pozisyonları seçin.
   2. Her çerçeve için, elle lokalizasyon doğruluğunu kontrol ve hücreler için yanılmış olabilir hücre artıkları ve hücresel çıkıntılar nedeniyle yanlış pozitif kaldırın. Farklı nesnelere analiz ve bölünmüş örtüşen veya bağlı hücreleri çoğalma hücreleri çıkarmak.
2. Zaman dizisi her hücrenin yerini bağlayarak önceki aşamada elde edilen hücre koordinatları (x, y, z, t), 3D hızlandırılmış hücre parçaları üretir.
3. Bir eşik hat uzunluğu (genellikle 20 dk) daha kısa parçaları kaldırarak rastgele ve sistem gürültüsünü ortadan kaldırın.
4. Gerekirse parça gelen toplam net değiştirmeleri çıkarılarak örnek sürüklenme için düzeltin.
5. Hücre deplasman hesaplayın,iles / ftp_upload / 52.735 / 52735eq2.jpg "width =" 80 "/> ve hücre göçü mesafesi, Gözlenen hücre yörüngeleri, burada zaman, bir hücrenin 3D konumunu temsil eden bir vektördür ve zaman noktalarının toplam sayısıdır.
   1. Δ t kare arasındaki zaman aralığı S d = / (n • Δ t) gibi hücre hızı, hesaplayın. P = Δd / d kullanarak hücre göçü yönlülük (veya sebat) hesaplayın. Sebat Bu basit önlem P = 0 net deplasman sıfır ve p = 1 için yörünge düz yönlü çizgi olduğunu ima eder.

Sonuçlar

Burada yer alan eş-merkezli jel tahlili, yüksek oranda istilacı meme kanseri hücreleri kullanılarak gerçekleştirildi, MDA-MB-231, 2.4 mg / ml'lik bir iç kollajen jel ve bir örnek olarak = 2 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir hücre tohumlama yoğunluğuna sahip. Şekil 2'de gösterildiği gibi, tipik olarak kültür birkaç gün sonra, hücreler, iç-dış jel arayüzü ihlal ve dış jel işgal başladı. hücre popülasyonu radyal olarak dışarı doğru ağırlıklı olarak ya...

Tartışmalar

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration¹³, which has to date been lar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture incubator	Fisher Scientific Pte Ltd	Model: 371, S/No 318854-6055
Confocal microscope	Nikon A1R		Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	10082-147
Fluorescent CellTracker dye CMTMR	Life Technologies	C2927
Glass-bottom dish	IWAKI Cell Biology	3931-035	35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well
Hemocytometer	iN CYTO	DHC-N01 (Neubauer Improved)
Microprocessor pH meter	Hanna Instruments	pH 211
Nutragen Collagen	Advanced BioMatrix	#5010-D	Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)
Objective lens	Nikon		CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
pH meter	Sartorius	S/No 29153352	Basic pH Meter PB-11
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054