Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; H. pylori</emOrtotopik Fare Modelinde Mesane Kanseri Tedavisinde Terapötik Aracı Olarak&gt; Protein HP-NAP

Özet

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

Özet

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.

The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.

In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Giriş

Mesane kanseri ABD'de ¹ yaklaşık 75.000 yeni vaka her yıl, ürogenital sistem en yaygın kanserlerden biridir. Nüks oranlarının yüksek mesane kanseri tedavisinde costliest kanserlerin biri yapar ömür boyu takip gerektirir. yüksek dereceli NMIBC için altın standart tedavi BCG intravezikal immünoterapi ardından, trans-üretral rezeksiyon olduğunu. BCG, anti-tümör aktivitesi kesin mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır olmasına rağmen, bu T yardımcı (Th) 1 ve sitotoksik T (Tc), 1 hücreleri, zenginleştirilmiş bir hücre-aracılı bağışıklık karşılığının harekete geçirmek için çok önemli olduğu kabul edilmektedir tedavinin ^2. başarısı.

BCG NMIBC için seçilecek tedavi olmaya devam olmasına rağmen, tedaviye yanıt vermeyen hastalarda yüksek oranda; Ayrıca, yan etkilerin bir neden olabilir: tedavi edilen tümörlerin yaklaşık% 70 kas-invaziv forma ~% 15 ilerleme bir süre sonra nüksetme vehastalığı. BCG tedavisi ile ilişkili diğer yan etkiler dizüri, sistit ve böbrek enfeksiyonu ^3-6 arasındadır.

yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi, ilk in vitro değerlendirmenin ardından, dikkate klinik öncesi modellerinin kullanımını almalıdır; Bu kimin mikroçevresinin ölçüde tedaviye gelişimlerini ve yanıt etkileyebilecek tümörlerde özellikle önemlidir.

Son on yılda, biz, HP-NAP, bakteri Helicobacter pylori tarafından üretilen bir proteinin bağışıklık modüle aktivitesinin birden yönlerini ele alınmıştır, başlangıçta polimorfonükleer hücreler (PMN) ⁷ endotel yapışmasını teşvik yeteneğine olarak belirledi. Yapısal olarak, HP-NAP hasret koşulları (DPS) ailesi ⁸ altında DNA koruyucu protein aittir ve bir dodecameric kabuk düzenlenmiş 12 özdeş alt birimden oluşmaktadır.

Biz, HP-NAP olduğunu göstermiştirT farklılaşmasını tahrik sorumlu güçlü bir immüno-modüle edici aktivitesi olan bir Toll benzeri reseptör (TLR) 2 agonisti, in vitro ve in vivo ^9-10 hem de TH1 fenotipine doğru lenfosit. Bu aktivite sayesinde HP, NAP-alerjik astım ¹¹ bir murin modelinde daha faydalı Th1 yanıt olarak Th2 immun cevabı yönlendirmek edebilmektedir.

HP-NAP Th1 bağımlı anti-tümör potansiyelini değerlendirmek için, BCG yönetiminin etkisini değerlendirmek için O'Donnel ve arkadaşları ¹² tarafından birkaç yıl önce geliştirilen mesane kanseri bir fare modelinde yararlandı.

Bu protokol ile, HP-NAP mesane kanserine karşı güçlü bir anti-tümör potansiyele sahip olduğunu ve HP-NAP yönetiminin etkinliği (interferon üreten hem Th1 ve Tc1 lenfositlerin, tümör ve bölgesel lenf düğümleri içinde önemli birikimi ile paralellik göstermektedir IFN) ¹³ -γ sup. HP NAP-ile tedavi edilmiş farelerde izole edilmiş tümörler fazla nekroz ve muamele edilmemiş muadili daha az vaskülarizasyon göstermiştir.

Bu rapor, hayvanların hazırlanması, bunların üretral kateter, mesane mukozasının hücrelerin bağlanması için gerekli olan kimyasal yanma ve tümör hücrelerinin enjeksiyonu ayrıntılı bir adımadım protokolü sağlar. Ayrıca mesane kanseri tedavisi için geliştirilmiş herhangi bir terapötik maddelerin bir prototip olarak kabul edilebilir, HP-NAP lokal olarak uygulanmasını tarif eder. Kontrol ve HP-NAP-tedavi edilen hayvanlardan izole edilen tümör karşılaştırarak elde edilen deliller, sadece HP NAP mesane kanseri immünoterapi için iyi bir aday değil, aynı zamanda kurmak deneysel genel etkinliği olabileceği gerçeğini vurgulamaktadır.

Protokol

Hayvan taşıma için tüm işlemler İtalyan Sağlık Bakanlığı (DM 204/2011-B) tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvanlar

1. Microisolation filtreleri ile ayrı ayrı havalandırmalı kafeslerde yaşı 8 hafta C57BL6 / J dişi fareler büyütün.
   Not: Onların dış ürogenital aygıtının anatomik konformasyon erkeklerde daha kateterizasyon kolay işler çünkü dişiler tercih edilir.

2. Hücre Kültürü

1. Nemlendirilmiş bir% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 50 ug / ml gentamisin ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde, fare ürotelyal karsinoma hücre hattı MB49 koruyun.
2. % 80 izdiham T-75 şişelerinde MB49 hücreleri büyütün. Trypsinize ve 0.5 × 10 ⁵ de tekrar süspansiyon - farelerde implantasyon öncesi PBS 150 ul başına 0,5 x 10 ⁶ hücre.

3. İntravezikal Tümör İmplant

1. (Sırasıyla, 33 mg / kg ve 20 mg / kg), anestetikler zoletil ve xylor bir karışımını kullanarak fareler anestezi, karın içinden enjekte edilmiştir.
2. Bir yatar pozisyonda hayvanlar koyun ve kapaklar ile ped arka ayakları düzeltmek. Pençeler yeterince iyi görülebilir ve kateterin yerleştirilmesi için kolaylıkla erişilebilir üretral meatusun işlemek için ayrılması var.
3. Not: kateterizasyon, bir 24 G kateter çocuk 8-10 haftalık fareler için uygundur. Kateterin bir seçim üretral duvar ve kateter arasındaki sıvı sızmasını önlemek için çok önemlidir. Büyük kalibreli kateterler daha büyük veya daha büyük fareler için kullanılmalıdır.
4. Küçük bir cımbız kullanarak, üretranın dış kısmının bir kenarı çimdik ve farelerin "baş ucuna" doğru çok hafifçe bükün. Bu eylem üretral meatus ortaya çıkarır.
5. 45 ° 'lik bir açı ile üretra ikinci kateterin iç iğne çıkarın ve ekleme, hafif yönlendirilmişFarelerin "kuyruk sonunda" doğru. Kateterin giriş zorlamayın; Bu üretranın içine fişleri kadar direnç durumunda, sadece, çok yavaşça kateter bükün. Kateterin yaklaşık 0.5-0.8 cm idrar olduğunda, dikkatli bir şekilde farelerin kuyruk kateter paralel yer tamamen yerleştirin.
6. Kateter takılı olması gereken bir iğne olan bir 1 ml şırınga kullanarak, steril PBS 200-300 ul enjekte edilerek kalan idrar mesane yıkama ve mesane tüm sıvı aspire.
7. Not: PBS enjekte ederken, mesane dolduracaktır ve bir şişme farelerin arka bacaklarının arasına görünür olacaktır; Bu kateterizasyon doğru olduğunu teyit etmektedir. Çoğu kateterler enjeksiyon hacmi hesaplanmasında dikkate alınması gereken bir ölü hacme sahip.
8. 1 ml steril bir şırınga kullanılarak, 0.1 N HCI, 200 ul enjekte edilir. Onun tüm duvar yakmak için mesaneyi doldurun. 10 saniye sonra, her asidi çıkarmak hemen neutralisteril bir şırınga ile 0.1 N NaOH, 200 ul enjekte edilerek ze. En yüksek hücre sayısı (0.5 x 10 ⁶⁾ enjeksiyonu durumunda, asitleme aşaması gerekli değildir.
9. Aspire tüm artık sıvı hemen steril PBS içinde 300 ul boşluğu yıkayın.
10. Mesane içine - (0.5 x 10 ⁶ aralık 0.5 × 10 ⁵⁾ aspirasyonu ile mesaneyi boşaltın ve MB49 hücreleri içeren PBS 150 ul enjekte edilir. Hücrelerin sızmasını önlemek için kateter monte şırınga bırakın. Bu kapaklar ile pad sabitlemek şırıngayı sabitlemek için iyidir.
11. 1 saat sonra, yavaşça üretradan kateter ayıklamak ve onlar uyanık kadar bir akkor lambası altında, kafes içinde fareler yerleştirin: bu genellikle tedavinin bitiminden 1 ila 2 saat oluşur.

HP-NAP 4. ntravezikal Teslimat

1. Not: Hücre uygulamasından sonra en az 3 gün, bu başlamak mümkündürTedavi.
2. Adımlar 3,1-3,4 açıklandığı gibi kateterize. Bu aşamada, bu HCI ile mesane duvarı yakmak için gerekli değildir.
3. 1 ml şırınga kullanarak, steril PBS 200-300 ul enjekte edilerek kalan idrar mesane yıkama ve mesane tüm sıvı aspire.
4. Mesane içine 150 ul PBS başına HP NAP 50 ug enjekte edilir. Protein çözeltisi akıntısını önlemek için kateter takılı şırınga bırakın. Kapaklar ile pad sabitlemek şırıngayı sabitleyin.
5. Onlar uyanık kadar bir akkor lambası altında, 1 saat sonra, yavaşça üretradan kateter ayıklamak ve kafese fareler yerleştirin.

5. Tümör Eksplantlarındaki ve Histolojik Analiz

1. Tedavi sonunda, hayvanlar kurban yatar pozisyonda yerleştirin ve kapaklar ile ped arka ayakları düzeltmek.
2. Cerrahi neşter kullanılarak, cilt ve içinden yaklaşık 1.52 cm uzunluğunda dikey bir kesi yapmakPeriton, sadece fareler "baş ucuna" dış genital üzerinde başlayan. Mesane zarar riskini en aza indirmek için, kesme derinliği özellikle dikkat.
3. Mesane kesim merkez sol yerleştirilmiş olacak ve tümör koyu pembe / mor kitle olarak görülebilir. Kesildikten sonra, histolojik kafese Bütün mesane yerleştirin ve parafin içine yerleştirilmeden önce,% 10 tamponlu formalin içinde sabitlenir.
4. Histolojik ve immün histokimyasal analizi için, standart bir mikrotom kullanılarak mesane (46 um kalınlığında) seri kesitler hazırlamak.
5. Hematoksilin / eozin ile bölümleri Leke ve tümör büyüklüğü (D xd ²⁾ ve bir bilgisayar destekli görüntü analiz cihazı kullanarak enine kesit alanı başına nekroz oranını belirlemek hesaplama ile devam eder.
6. Damar sayımı, standart bir immünoperoksidaz tekniği kullanılarak, endotelyal işaretleyici CD31 / PECAM için bölümleri boyama ile devam edin. Bölümleri tara BirEn yüksek vasküler yoğunluğu bölgeyi tanımlamak için düşük güç (4 ×) t. Bu Bölgede, yüksek güç (20 ×) beş ayrı rastgele alanlarda bireysel mikrodamarlar saymak.

Sonuçlar

Şekil 1, kateterizasyon tekniği göstermektedir; Fare kateterize ve 0.5 × 10 ⁶ MB49 hücreleri ile damlatılır. HP-NAP ile tedavi mesane duvarına yapışır ve çoğalırlar sağlayacak, 3 gün, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan sonra başlatılır. Kontrol grubuna ait bütün hayvanlar tümör geliştirme; bunların bazıları üretra tıkanıklığı 13 günlük sürenin bitiminden önce ölebilir.

HP-NAP ile ilk enjeksiyondan sonra, hayvanlar dört enj...

Tartışmalar

kanser tedavisinde ilerlemelere çoğunluğu klinik denemeler başlamadan önce hayvan modellerinde test gerektirir. in vivo tümör biyolojisi okuyan hayvan modellerinde yararlanarak olasılığı, farklı tedavi yaklaşımları değerlendirmesini sağlayan kanser patogenezinde araştıran araştırmacılar için önemli bir araç temsil eder. Ortotopik modeller altın standart ^14-15 kalır, hem de çünkü tümör modeli kurmak ve mevcut hücre hatlarının büyük miktarda doğal olarak oluşan t?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
C57BL/6J female mice	Harlan Italy (Udine, Italy)
MB49 Cells			Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA
RPMI	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)	R8758
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
PBS	Sigma-Aldrich	D1408	10X, to be diluted in apyrogenic water
Flask	Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA)	353135
Syringe 1ml	Becton Dickinson	301358
Trypsin	Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA)
Gentamycin	Life Technologies	15710-049
Xilor	Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy)		2% Xylazin
Zoletil	Virbac (Carros, France)	359713301992	5% Zolazepam + 5% Tiletamine
24G Catheter	Terumo (Rome, Italy)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, Italy)	403871	Liquid
NaOH	JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA)	10095011	Powder
Equipment
Surgical Scalpel	Albion Surgical Limited (Sheffield, England)
Microtome	Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany)	RM2235
Microscope Slides	VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA)	631-0108
Image Analyzer	Zeiss (Jena, Germany)	Cyres System