16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

Özet

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Özet

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Giriş

Bakteriler gibi periodontitis, pulpitis, Perikoronitis, selülit ve osteomyelit gibi çeşitli ağız hastalıklarının etiyolojisinde rol oynarlar. Hastalığın patojenezinde bakteri rolünü anlamak ve tedavilerin etkisini izlemek amacıyla, doku içindeki bakterilerin yeri önemlidir. periodontitis olan hastalardan alınan dişeti dokusu içinde bakterilerin varlığı Floresan-kullanarak, in situ hibridizasyon (FISH) ⁸ elektron mikroskobu ^1,2, immünohistokimya ve immünofloresan kullanılarak bakterilerin spesifik antikorlar ^3-7, ve floresan dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak gösterilmiştir 16S rRNA hedef etiketli oligonükleotid prob. Bununla birlikte, bu yöntemler yaygın nedeni, teknik sınırlama veya zorluklara kullanılmamaktadır. Antikorlar ile karşılaştırıldığında, 16S rRNA hedefleme probları üretmek ve tür spesifikliğini elde etmek kolaydır. BALIK Bact görüntülenmesi için mükemmel bir araç olduğunu kanıtlamıştırBöyle plak biyofilm olarak kendi doğal ortamlarında eria. Bununla birlikte, doku numunelerini, FISH uygulanması nedeniyle çeşitli doku bileşenlerinin otofloresansı sınırlıdır. Bunlar ⁹ kanama barındırır, örneğin kırmızı kan hücrelerinin kuvvetli otofloresansı genellikle iltihaplı dokulara floresans teknolojisinin uygulanmasını engellemektedir.

Iltihaplı diş eti dokularda bakterilerin lokalize etmek için, bu nedenle, digoksigenin kullanılarak bir in situ hibridizasyon metodu (DIG) -etiketli DNA probu geliştirilmiştir ve başarılı bir şekilde ^10,11 uygulanır. P kullanarak parafine gömülü dokularda bakteri lokalizasyonu için Burada detaylı bir protokol gingivalis-spesifik ve genel eubacterial sondalar açıklanmıştır. Özellikle içindeki sonuçlar diğer laboratuarlarda yeniden böylece yöntemin standardizasyon odaklanmıştır. Bu protokol histolojik bağlam ve resu içindeki bakterilerin lokalizasyonu veriyorlt son derece tekrarlanabilir. Açıklanan protokol, ya çeşitli dokularda bir türe özel veya genel bir şekilde bakterileri lokalize etmek için de kullanılabilir. Evrensel prob polimikrobial hastalıklarda bakteri tespit etmek ve belirli bir bakteri rolü bilinmemektedir burada hastalıklarda bakteri potansiyel rolünü araştırmak için yararlıdır.

Protokol

1. Probe Hazırlık

1. Prob PCR amplifikasyonu
   1. P. gingivalis spesıfik prob, P. bir 343-bp DNA fragmanını çoğaltmak P. genomik DNA kullanılarak PCR ile gingivalis 16S rRNA gingivalis aşağıdaki primerler: 5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 've 5'-ACT ATC CGT CGT GCC TAT TC-3' ^10. Aşağıdaki döngü koşulları amplifikasyonlar yapın: 35 döngü 95 ° C'de 30 saniye, 30 saniye için 60 ° C, ve 72 ° 'de 5 dakika uzatma ve ardından 1 dakika 20 saniye için 72 ° C C ^10,11 için.
   2. 70 bp'lik bir DNA parçası (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG kullanılarak eubacterial prob yükseltin
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 'bir oligonükleotid aşağıdaki primerler olarak sentezlenir): 5'-CAG CTG GTR CMT GGY-3' ¹¹ ve 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3. Aşağıdaki döngü koşulları amplifikasyonlar gerçekleştirin: 40 döngüleri30 saniye için 30 saniye için 9 4 ° C, 60 ° C ve 1 dakika 72 ° C ^11,12 sıcaklıkta 5 dakikalık bir uzatma ve ardından 20 saniye süreyle 72 ° C'de.
   3. Ve 2 saat boyunca -20 ° C'de inkübe 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve (: 1: 2 oranında 10 de),% 100 etanol ilave edilerek PCR ürünleri (≥500 ul) hızlandırabilir.
   4. Santrifüj karışım 15 dakika için 14,000 x g'de, TE tamponu, 100 ul pelet tekrar süspansiyon ve 260 nm'de optik yoğunluk ile DNA konsantrasyonu ölçülür.
2. DIG DNA etiketleme ve saptama kiti kullanılarak DIG-etiketleme
   1. 15 ul bir son hacme su ile prob 3 ug karıştırın.
   2. 10 dakika boyunca 95 ° C 'de DNA'yı denatüre ve hızlı bir şekilde buz üzerine soğuk.
   3. 10x heksanükleotid karışımı 2 ul dNTP etiketleme karışımı 2 ul ve denatüre edilmiş DNA 15 ul Klenow enzimi 1 ul ekle.
   4. Karıştırın ve 48 saat için 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 65 ° C'de ısıtma ile reaksiyonu durdurun.
3. DIG DNA etiketleme ve saptama kiti kullanılarak DIG-etiketli prob duyarlılığını kontrol
   1. El ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kitte sağlanan pozitif kontrol probu seri dilüsyonları 1 ul naylon membran üzerinde DIG etiketli prob 1 ng ve kuru yük.
   2. Kısaca 2x SSC tamponu (0.3 M NaCI, 30 mM sodyum sitrat, pH 7.0) 'de membran ıslatın ve DNA immobilize etmek için 1 saat boyunca 80 ° C' de membran inkübe edin.
   3. Kısaca maleik asit tamponu (MAB, 0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) membran emmek ve anti-DIG alkalin fosfataz ile birleştirilmiş bayır antikoru seyreltildi (AP) ile inkübe: Resim bloke çözeltisi içinde 6 ml (1 5000) 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kiti.
   4. MABT (MAB% 1 Tween 20 ihtiva eden) ile zarın yıkanması ve üzerine 2 ml saptama tamponu (0.1 M Tris-HCI, 0.1 M NaCI, 0.05 M _MgCl2, pH 9.5) ile karıştırılmıştır NBT / BCIP çözeltisi 40 ul geçerlidir 1 dakika için membran. Etiketlenmiş prob duyarlılığı isetatmin edici değil, 1.1.3 den 1.3.4 için adımları tekrarlayın.
   5. Etiketli prob (OD260) DNA konsantrasyonu ölçülür ve ul ng 100 konsantrasyonunu ayarlamak ^-1.
4. DIG-etiketli prob özgünlüğünü kontrol
   1. Genomik DNA örnekleri denatüre 10 dakika boyunca 95 ° C 'de, belirli bir prob hedef bakteri dahil olmak üzere çeşitli bakteri türlerinin gelen (25 3 ul ^-1, her numune başına ng) ve hızlı bir şekilde buz üzerinde soğuk.
   2. El ile oda sıcaklığında 20 dakika için denatüre edilmiş naylon membran üzerine DNA ve kuru yük.
   3. Kısaca 2x SSC tamponu membran ıslatın ve DNA immobilize etmek için 2 saat boyunca 80 ° C 'de membran inkübe edin.
   4. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke edici bir solüsyonuyla membran bloke.
   5. Hibridizasyon tamponu içinde seyreltilmiş probları denatüre ve membran üzerine uygulanır ul ^-1 1 ng probu ile seyreltilir.
   6. 1 saat süre ile 45 ° C 'de membran inkübe edin.
   7. Zarın yıkanması Üç2x SSC tamponu ile kere.
   8. Kısaca MAB membran ıslatın.
   9. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi içinde 6 ml (2.000 1) ile seyreltildi, anti-DIG AP-konjuge antikor ile inkübe edin.
   10. MABT ile zarın yıkanması ve 2 ml saptama tamponu ile karıştırıldı NBT / BCIP çözeltisi 40 ul uygulanır.
   11. Sonda beklenen özgüllük elde değil zaman özgünlüğü görülünceye kadar, melezleme sıcaklığını arttırın.

İn Situ Hibridizasyon 2.

Not: örnekler ve reaktifler kurumayı önlemek ıslak kağıt havlu ile astarlanmış bir nemlendirilmiş oda içinde Bütün inkübasyonlar, gerçekleştirmek için.

1. De-paraffinization ve doku bölümleri rehidrasyon
   1. Parafin bloklardan 4 mikron kalınlığında doku bölümleri hazırlayın. Formalin, paraformaldehit ve çinkoya-dayalı sabitleyici bu protokol ile uyumludur.
   2. DEPC arıtılmış su kullanılarak tüm reaktifler hazırlayın.
   3. 30 dakika boyunca 60 ° C 'de kuru bir fırın içinde ısı slaytlar ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar inkübe edin.
   4. 5 dakika üç kez% 100 ksilen slaytlar daldırın; Taze ksilen, her zaman kullanın.
      Not: Bir kimyasal davlumbaz, bu de-ağda işlemi yapın.
   5. Iki kez 5 dakika% 100 etanol içinde slaytlar bırakın, her zaman taze etanol kullanılarak, ve her biri 5 dakika için seri% 90 örnekleri,% 80 ve% 70 etanol çözüm rehidrate.
   6. 1 dakika süre ile, DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar daldırın ve 6 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS (pH 7.4) içinde slaytlar yıkayın.
2. Doku bölümlerinin ön işlemler
   1. 20 dakika için 0.1 N hidroklorik asit içinde slaytlar daldırın ve 30 saniye süreyle DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar yıkayın.
   2. Bir mum kalem kullanarak örnekleri çevreleyen bir hidrofobik bariyer çizin.
      Not: bir hidrofobik bariyer boyutu örneklerinin büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, aşağıdaki aşamalarda kullanılan reaktif miktarları örneklerinin boyutuna bağlı olarak, ancak hy doldurmak zorunda değişirdrophobic bariyer (küçük numuneler için 50 ul ve büyük numuneler için 400 ul).
   3. 30 dakika için 37 ° C 'de kuru bir fırında proteinaz K (1-10 ug mi ^-1 DEPC ile muamele edilmiş, PBS içinde) ve 50-400 ul numune tedavi ve 1 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş 1 x PBS içinde slaytlar yıkayın.
   4. 10 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde slaytlar bekletin, daha sonra 1 dakika boyunca DEPC ile muamele edilmiş, PBS slaytlar yıkayın.
   5. 0.1 M trietanolamin-HCl, 20 dakika boyunca% 0.5 asetik anhidrit içeren (pH 8.0) slaytlar ıslatın ve 30 saniye için DEPC ile muamele edilmiş su içinde slaytlar yıkayın.
3. Prob ve yıkama ile hibridizasyon
   1. 20 dakika boyunca 2x SSC tamponu slaytlar bırakın.
   2. Hibridizasyon tamponu içinde ul ^-1 1 ng (4x SSC probu ile seyreltilir,% 50 [hacim / hacim] formamid, 1 x Denhardt çözeltisi,% 10 [ağırlık / hacim] dekstran sülfat,% 0.1 [ağr / hac], sodyum dodesil sülfat, 0.4 mg mi ^-1 salmon sperm DNA'sı). Negatif kontroller için, ile etiketlenmiş prob karışımıolmayan işaretli prob, bir 10-kat fazla miktarda.
   3. Seyreltilmiş probları denatüre ve doku bölümleri üzerine 50-400 ul uygulayın. Slaytta bir kapak kayma yerleştirin ve oje ile mühür.
   4. 45 ° C veya en uygun ısıda nemlendirilmiş bir odacık O / N 10 dakika boyunca 90 ° C 'de, PCR makinesi ısı slaytlar ve inkübe slaytlar aşama 1.4.11 de tespit edilmiştir.
   5. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de slaytlar soğutun kapak slipi kaldırmak ve aşağıdaki gibi, bir seri SSC tamponu slaytlar sokmak: 4x SSC 10 dakika, önceden ısıtılmış (45 ° C) 2 x SSC, 20 dakika, 2 x SSC, 10 için dakika ve 10 dakika süre ile 0.2x SSC.
4. Anti-DIG AP-konjüge edilmiş antikor ile tespit
   1. 5 dakika boyunca MABT slaytlar yıkayın.
   2. 20 dakika boyunca,% 1 Tween 20 ile bloklama çözeltisi 50-400 ul engeller.
   3. Çözeltisi (1: 1000) bloke içinde seyreltilmiş anti-DIP-AP antikoru 50-400 ul ekle anld 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. 10 dakika boyunca MABT slaytlar yıkayın.
   5. 5 dakika boyunca% 1 Tween 20 içeren algılama tamponu slaytlar bırakın.
   6. Μ 1 mM levamisol endojen alkalin fosfataz inaktive edilmesi için 5 dakika için (% 1 Tween 20 içeren saptama tamponu içinde) 50-400 ile tedavi edin.
   7. (1 bulgulama tamponu içinde seyreltilmiş 100) önceden karıştırılmış NBT / BCIP çözeltisi 50-400 ul dağıtma Her örnek üzerinde ve gelişmiş sinyal tatmin kadar 2 ila 3 saat boyunca oda sıcaklığında nemli bir haznede slaytlar inkübe edin.
   8. Görselleştirme durdurmak ve 10 dakika için 37 ° C 'de% 0.05 bir karşı leke olarak [ağırlık / hacim] metil yeşili 50-400 ul uygulamak için de-iyonize edilmiş su ile slaytlar durulayın.
   9. % 100 etanol içinde dehidre, de-iyonize su ile slaytlar durulayın ve ksilen batırın.
   10. Her bir slayt üzerine montaj çözümü 80 ul uygulayın ve kapak slipleri ile kaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1 hassasiyetini belirlemek için sette bulunan pozitif kontrol probu ile karşılaştırıldığında DIG etiketli probları nokta blotlama. 343 bp P. gingivalis spesıfik sonda 70 bp eubacterial prob 25 kat daha hassastır. P. tespiti için kronik periodontitisli hastalardan elde edilen dişeti dokularının in situ hibridizasyon 2 gösterileri Şekil gingivalis ve Eubacteria. mor gösterilen bakteriyel sinyaller, doku dışı...

Tartışmalar

Burada bir protokol tarif edilmiştir, DIG etiketli bir DNA probu kullanılarak parafine gömülü doku içindeki bakteri yerelleştirilmesine. Prob bakteriyel 16S rRNA geninin DNA ya da RNA moleküllerini hedef ve 16S rRNA hedefleme problar ya da türe spesifik ya da evrensel olarak dizayn edilebilir. P. spesifik hibridizasyon P. gingivalis -spesifik prob gingivalis ancak diğer ağız bakterileri daha önce ¹⁰ gösterilmiştir. Hibridizasyon etkinliği ¹² farklı olsa d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfate solution	Millipore	S4030
50X Denhardt’s solution	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA labeling and detection kit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vector	SP-5000
Magnesium chloride	Sigma	246964
Maleic acid	Sigma	M0375
Methyl green	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Salmon sperm DNA solution	Invitrogen	#15632-011
Sodium chloride	Sigma	S9625
Sodium citrate	Duksan	D1420
Sodium dodecyl sulfate	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T