Eşzamanlı<em&gt; Ex vivo</emİki retina&gt; Fonksiyonel Test tarafından<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram Sistemi

Özet

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Özet

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Giriş

Elektroretinogram (ERG) ışıkla tetiklenir retina elektriksel aktivitesi kaydetmek için kullanılabilen bir köklü bir tekniktir. ERG sinyal retinanın rezistif dışı uzayda akan radyal akımların neden olduğu gerilim değişiklikleri (fotoreseptör ve bipolar hücrelerin ekseni boyunca) ağırlıklı olarak üretilir. İlk ERG sinyali bir balık gözü ¹ yüzeyinden Holmgren, 1865 kaydedilmiştir. Einthoven ve Jolly 1908 ² b-, a- denilen üç farklı dalgaların içine ışık başlangıcından ERG yanıtı, ve c-dalgalar, şimdi bipolar hücreler ON fotoreseptör esas aktivitesini yansıttığı bilinmektedir ve pigment epiteli bölünmüş Hücreler sırasıyla ^3-8. ERG, yerel (mikroelektrotla (ex vivo) izole sağlam retina arasında, izole edilmiş bir göz Hazırlama ^9'da elde edilen, anestezi uygulanmış hayvanlar ya da (in vivo) insan gözüyle ^3,10-15 ya arasında belirli bir retina katmanları kaydedilebilirERG) ^4,16. Bunlardan in vivo ERG şu anda retina fonksiyonunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu teşhis amaçlı kullanılabilir veya hayvanlarda veya hastalarda retina hastalıklarının ilerlemesini takip etmek invaziv olmayan bir tekniktir. Ancak, in vivo ERG kayıtları genellikle ekstraoküler fizyolojik gürültü (örneğin, solunum ve kalp aktivitesi) ile kirlenmiş, birkaç örtüşen bileşenleri ile karmaşık bir sinyal üretmek.

Yerel ERG retina spesifik katmanlar arasında sinyalini kaydetmek için kullanılabilir, ancak, en invaziv ve diğer ERG kayıt konfigürasyonları ile karşılaştırıldığında düşük bir sinyal-gürültü oranı (SNR) sahip olmasıdır. Yerel ERG ayrıca teknik olarak ve pahalı donanımları (örn mikroskop ve mikromanipülatörler) gerektirir. Sağlam, izole retina gelen Transretinal ERG (ex vivo ERG) istikrarlı ve HIG izin in vivo ve yerel ERG yöntemleri arasında bir uzlaşma sunuyorhayvanlar ya da insanlar ¹⁷ sağlam retina h SNR kayıtları. Son zamanlarda, bu yöntem, memeli primat ve insan retina ^18-20 çubuk ve koni fotoreseptör fonksiyonunu incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo olarak, retina pigment epiteli olmaması, ERG sinyalinin pozitif Cı dalga bileşeni çıkarılır ve önemli bir negatif yavaş PIII bileşeni ex vivo kayıtları ortaya çıkar. Yavaş PIII bileşeni retina ^21-23 Müller glia hücrelerinin aktivitesi kaynaklı gösterilmiştir. Bu nedenle, ex vivo olarak ERG yöntemi de sağlam retinada Müller hücreleri incelemek için kullanılabilir. Çeşitli çalışmalarda da bu ex vivo ERG kayıtları retina ²⁴ civarında farmakolojik ajanların konsantrasyonu ölçmek ve uyuşturucu ^25-27 güvenliğini ve etkinliğini test etmek için kullanılan olabilir göstermiştir.

In vivo sistemlerde birden fazla ticari mevcuttur vemutlaka geniş elektrofizyoloji altyapıya sahip olmayan birçok laboratuvarlarında kullanılan. Buna karşılık, ex vivo cihazlar son zamanlarda ¹⁷ kadar ve sadece çok az laboratuarlar anda bu güçlü tekniği yararlanarak bir sonucu olarak mevcut olmamıştır. Bu retina fizyolojisi ve patolojisi hakkında bilgimizi ilerletmek ve hastalıkları kör için yeni tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla laboratuvarlara ex vivo ERG kayıtları kullanılabilir hale getirmek için yararlı olacaktır. Burada, bir basit ve uygun fiyatlı bir ex vivo ERG aygıtı ¹⁷ göstermektedir ve bu çubuk ve koni aracılı sinyal kaydetmek için çeşitli ticari olarak temin edilebilir, in vivo ERG sistemleri ile kombinasyon halinde kullanılabilir göstermek (a- ve b-dalgası) ve fonksiyonu görmemiş vahşi tip fare retinaları Müller hücrelerinin (PIII yavaş).

Protokol

Tüm deneysel protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Washington Üniversitesi'nde kurumsal Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Perfüzyon ve Numune Tutucu Kurma

1. Deney gününde taze retina perfüzyonu için çözelti hazırlayın. Distile ve deiyonize su kullanın. Aşağıdaki üç çözümlerden birini kullanın.
   1. , Medya ve NaHCO ₃ 1.9 g 'Ames 1 şişe (1 L) çözeltisi' Ames bikarbonat içeren hazırlanması
   2. (MM olarak) Locke çözeltisi hazırlayın: 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 _MgCl2, 1.2 _CaCl2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO _3, 3.0 Na süksinat, 0.5 Na glutamat, 0.02 EDTA ve 10.0 glikoz,% 0.1 MEM vitamin ve amino asitler
   3. (MM olarak) Hazırlama HEPES-tamponlu Ringer solüsyonu: 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 _MgCl2, 1.0 _CaCl2, 10.0 glikoz, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH1 M NaOH 5,8 mi ~ ile 7.5'e ayarlandı, 0.72 g / L kültür ortamı Leibovitz L-15 ekleyin. Herhangi bir perfüzyon medya ile fotoreseptör yanıtı izole etmek için 100 mcM BaCl ₂ - 50 mcM DL-AP4 ve 50 - 20 kullanın.
2. (MM olarak) elektrot ²⁸ için çözelti hazırlayın: 140.0 NaCl, 3.6 KCl, _CaCl2, 3 HEPES, 0.01 EDTA 2.4 _MgCl2, 1.2 ve 7.4 pH ayarlamak - NaOH ile 7.5 olarak değiştirilmişti. Elektrot çözeltisi bir kaç ay için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
3. Hazırlayın ve numune tutucu test edin.
   1. Numune sahibinin taban kısmının kubbelerin üstünde siyah / gri filtre kağıdı Tutkal (Şekil 1A bakınız). Kubbelerin düz üstleri kenarlarda dikkatlice iki bileşenli 5 dk epoksi tutkal sürün. Gerekirse, diseksiyon mikroskobu altında bunu.
   2. Tutkal neredeyse kuru (yaklaşık 4 dakika) kadar bekleyin ve düz öğesini kullanarak kubbe üzerinde filtre kağıdı bastırın. Tutkal filtre kağıdı deneyden önce en az bir gün.Filtre kağıdı, birden çok kez kullanılabilir ancak kayıtların bir ay sonra değiştirilmelidir. Yedek kağıt yüklemeden önce herhangi bir yapışkan kalıntısı dikkatlice kubbeleri temizlemek için% 70 etanol kullanın.
   3. Elektrot çözelti hava kabarcıklarını önlemek ve elektrot kanallarına dişli adaptör ile kapalı pelet elektrotlar (Şekil 1A ve B) vida çalışıyor elektrot kanalları doldurun. Dört vida ile numune tutucu üst ve alt parçaları bağlayın ve elektrot çözeltisi ile perfüzyon çizgileri doldurmak.
   4. Multimetre (Şekil 1B) kullanarak her bir elektrot çiftinin uçları arasındaki direnci ve voltajı ölçün. Direnç 100 Ωk ve 10 mV altında geriliminin kanalları kabarcık-ücretsiz ve elektrotlar iyi şartlarda iseniz altında olmalıdır.
4. Cam şişe perfüzyon medya 700 ml - 400 dökün. Başka bir 300 mi retina ve s diseksiyon kullanılacak AyrıBir buzdolabına yırttı. Eşanjör bloğunda perfüzyon tüp ayarlayın ve ısıtıcı plaka üzerinde ısıtılmış blok yerleştirin (Şekil 1D bakınız).
5. (Şekil 1D bakınız) (Ames 'ya da Locke kullanılması durumunda) bağlantıları ₂ / O ₂ gazı CO olan bir kapakla şişe ve perfüzyon tüp için sarmalar. 37 ^o C medya ile şişeyi Onceden ve ısıtma plakası veya 37 ayarlanmış su banyosunda hafif stimülasyon birimi üzerine yerleştirin - 39 ^o C ^17.
   1. Prime yerçekimi ile çalışan akmayı başlatmak için perfüzyon ortamı ile doldurularak perfüzyon hattı.
      1. LKC sisteminde, daha sonra deney sırasında şişede perfüzyon çözeltisi düşürücü seviyesi etkilenmeden akış hızı regülatörü ile ayarlanır önemli bir yer çekimsel bir akış sağlamak için stimülatör ünitesi ¹⁷ üzerine şişe yerleştirin.
      2. Ocuscience sisteminde, s yernumune tutucu uzun perfüzyon çıkış hatları gürültüyü en aza indirmek ve yerleştirmek amacıyla Faraday kafesi içinde erfusion şişe çözümünün yerçekimi sürücü artırmak için de numune tutucu (ve perfüzyon şişesinin) seviyesinin altına (adım 2.8 bakınız). Bu çıkış hatlarını koruyun ve ERG sinyal elektromanyetik gürültü bağlanmasını engellemek için amplifikatörün toprağa kalkanı bağlayın.
6. Debi regülatörleri kullanarak / dk 5 ml - 3 perfüzyon ayarlayın. Doğru regülatör ile bir silindirden% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ gazı bağlayın ve bir hava taşı ile şişe medyanın sürekli köpüren sağlamak için akış hızını ayarlayın.

2. Numune Hazırlama

1. Düz kanatlı microscissors, bir ya da iki 45 ^o cımbız, jilet ve filtre kağıdı dikdörtgen bir parça da dahil olmak üzere, temiz ve keskin diseksiyon aletleri birleştirin.
2. Soğuk perfu yaklaşık 200 ml dökünbüyük bir Petri kabındaki yon çözeltisi (kubbe dahil olmak üzere), numune tutucu bütün alt kısmı çözeltisi içine daldırılmış şekilde. Kubbelerin üzerindeki retina monte ederken Bu adım önemli hale (adım 2.6 bakınız). Bazı çözeltiler karbojen (% 5 CO _2/95% O _{x 2),} doymuş üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu diseksiyon amaçları için gerekli değildir ve burada tarif edilen deneylerde yapılmadı.
3. Kayıtların önce 12 saat - Tipik bir deney için, aydınlık / karanlık döngüsü ve 6 onları koyu adapte 12/12 saat içinde hayvanlar tutmak. (Mikroskop ışık kaynağının önünde, örneğin kırmızı filtre kullanın) loş kırmızı ışık altında servikal dislokasyon tarafından takip CO ₂ inhalasyon yoluyla hayvan Euthanize ve loş kırmızı veya kızılötesi ışık altında aşağıdaki işlemleri yapmak.
   1. Cımbız kullanarak gözleri dışarı çekin ve medya koyun. Kağıt (örneğin, bazı düzenli filtre kağıdı) küçük bir parça üzerinde bir seferde bir göz yerleştirin ve olarak yapmakCımbız ile göz (bu burada çözümün dışında yapılır) tutarken ora serrata düzeyinde yaklaşık yaktı.
4. Ora serrata boyunca kesin (ya da yakın gözün ekvatora) microscissors ve kornea ve lensi çıkarın. Büyük Petri kabındaki soğuk medyada göz fincan koyun ve diğer gözle aynı işlemi tekrarlayın.
5. Mümkün olduğunca sağlam olarak retina tutmak için retina ve sklera arasındaki makas tutarak optik sinir doğru göz fincan üstünden küçük bir kesi kesin. Kavrama iki cımbız kullanarak ve retina ayırmak için birbirinden uzakta cımbız çekin tarafından kesi her iki taraftan sklera.
   1. Optik siniri kesin ve uzak yüzeye fiziksel temas minimum miktarda retina izole etmeye çalışın. RPE çoğunlukla diseksiyon işlemi sırasında retina otomatik olarak ayırmak olacaktır. Bu gerçekleştirmek için daha retinanın mekanik rahatsızlık önlemek için daha önemlidirDiseksiyon hızlı bir şekilde, genel olarak retina yanıtı özellikleri üzerinde önemli etki olmadan çözelti içinde en az 30 dakika inkübe edilebilir.
6. Numune tutucu (Şekil 1C) kubbe üzerinde retina monte edin. Disseke retina ile Petri kabındaki numune tutucu alt kısmını daldırın. Kubbenin üzerindeki retinayı yukarı fotoreseptör tarafı (izole retinanın dışbükey yüzeyi), Slayt ve retina filtre kağıdı üzerinde verdiği, böylece numune tutucu kaldırın. Diğer retina için aynı işlemi tekrarlayın.
7. Elektrik retina arasındaki karışma yanı sıra gürültü ve sinyal şant önlemek için dikkatli bir şekilde tutucu plakayı kurutun. Numune tutucu tutucu alt ve üst parçaları arasındaki çözüm dökülme önlemek için yanı sıra bireysel retina fotoreseptör ve ganglion hücre tarafı elektrik izolasyonu yardım etmek için alt kısmı kubbe etrafında O-halkalarını vardır. (Dört vida ile sahibinin üst kısmını takınŞekil 1B) ve bir şırınga ve iğne kullanılarak perfüzyon çözeltisi ile perfüzyon kanalları doldurun.
8. Isı değiştirici blok sonraki numune tutucu aktarın ve numune tutucu (Şekil 1D) giriş ve çıkış perfüzyon hatlarını bağlayın. (Üst elektrotlar amplifikatör toprak / eksi pin bağlantı) ERG amplifikatör elektrotlar bağlayın ve bir adaptör kullanılarak numune tutucuya stimülatörü / kontrol ünitesi takın veya bağlı stimülatörü ünitesine ısıtma yastığı kaydırın in vivo hangi ERG sistemi kullanılmaktadır.

3. Kayıtlar

1. In vivo sistemin yazılımını kullanarak amplifikatör ve uyarıcı ayarlarını yapılandırın. 300 Hz filtreleme 1 ile 10 kHz ve low-pass arasında bir değere satın alma frekansını ayarlayın. Yüksek geçiren filtreleme kullanmayın. 60 Hz (veya Avrupa'da 50 Hz) Gerekiyorsa filtreyi çentik kullanın.
2. Işık uyarımı ve zekâ olmadan Tutanak temelh loş stimülasyon (örn., -35 dB veya 0.3 mCd şiddetindeki sm ^-2 yeşil ışık) elektrotlar ve retina örnek arasında iyi elektrik bağlantısı için test etmek. Retina sıcaklık ve fonksiyon istikrarlı duruma ulaşması ve böylece veri toplama başlamadan önce 20 dakika - 10 bekleyin.
   1. Herhangi bir özel deneye göre uyaran parametrelerini seçin ve veri toplama başlar. Örneğin, 0 dB kadar ya da 0.1 1.000 kadar mCd şiddetindeki sm den -40 yeşil ışık kullanmak ^-2 bir skotopik yanıt aile için. Çubuklar arka plan ışığı tarafından bastırılmış gereken Fotopik kayıtlarda yaklaşık 2 parlak log-birimleri 3 yanıp söner kullanın (3-30 Cdm ^-2) ya da bir prob flaş ^(-2 = 1 dB yaklaşık 1.3 Cd sm, bakınız Şekil 3).
   2. Ancak, tam ışık şiddeti değerleri sistem kalibrasyonu ve deneysel koşullara biraz bağımlı olabileceğini unutmayın. Genel bir kural olarak, aşağı 5 ölçek yoğunlukları - 10 kat in vivo karşılaştırıldığında kayıtlar yeşil ışık ¹⁷ kullanarak. (Ticari bağdaştırıcı sistemine dahil) retina üzerinde delikler olan bir siyah kapağı numune tutucu ışık saçılması: azaltmak ve in vivo sistemler ticari Ganzfeld çevrede her iki retina homojen ve eşit bir uyarım kolaylaştırmak için kullanılabilir.
      NOT: koyu adapte retina kayıtları, tipik bir deney ağartıcı pigment sadece önemsiz bir kısmını kullanılan test yanıp söner yoğunlukları böylece RPE odaklı rejenerasyon eksikliği söz konusu değildir. Buna ek olarak, daha önce koni pigment rejenerasyon hala Müller hücresi görsel döngüsü ²⁰ üzerinden izole retinada yer alabilir gösterilmiştir.
3. Deneyler birkaç saat 30 dakika kadar tipik son gibi bu değişiklikler teknik sorunlara işaret edebileceğiniz gibi, deney sırasında bazal sürüklenme, gürültü seviyesi ve yanıt istikrarı izlemek.
   NOT: Artan gürültü ya da azalmad tepki genlikleri hava perfüzyon veya elektrot kanalları kabarcıklar, çok düşük ya da yüksek sıcaklık, çözüm sızıntı / dökülme veya retina deplasman gösterebilir.

4. Temizlik

1. Perfüzyon hatları numune tutucu ayırın açın ve filtre kağıdı retina yıkayın. Elektrotları çıkarın ve damıtılmış su (etanol kullanmayın) ile durulayın. Etanol ve / veya distile su ile (perfüzyon kanalları dahil) numune tutucu temizleyin. Dikkatlice yıkayın perfüzyon boru 70> ile% etanol.
2. Damıtılmış su (deterjanlar kullanmayın) ile perfüzyon şişesini durulayın. Etanol, aynı zamanda şişe temizlemek için de kullanılabilir.

Sonuçlar

Bu koyu adapte yabani tip flaş yanıtları kaydedildi deney protokolleri farklı standart perfüzyon için solüsyonlar (Şekil 2) ile, yukarıda tarif edilen ve Şekil 1 'de gösterilen izleyerek (WT), C57BL / 6 fare retinaları. tepki dalga ve kinetik yanı sıra çubuk fotoreseptör duyarlılığı Ames "ve Locke'un medya (Şekil 2A ve B) benzer çıktı. Öte yandan, HEPES-tamponlu Ringer çözeltisi (Resim bikarbonat ya da% 5 CO _...

Tartışmalar

Biz burada bir ex vivo ERG adaptörü ile birlikte in vivo ERG sistem bileşenlerini kullanarak iki izole fare retina aynı anda yüksek kaliteli ex vivo ERG kayıtları elde etmek için kritik adımlar göstermektedir. Bu çalışmada, aynı solüsyonu (ya Ames ', Locke ya da Ringer) ile hayvandan her iki retina perfüze ama uyuşturucu test amaçlı, farklı bir çözüm örneğin her retina serpmek de mümkündür. yüksek kaliteli veri elde etmek için en öneml...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
In vivo ERG system	OcuScience	HMsERG	www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system	LKC Technologies	UTAS-E 3000	www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter	OcuScience	Ex VIVO ERG adapter	www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope	North Central Instruments	Leica M80	May use any brand
IR emitter	Opto Diode Corp.	OD-50L	www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes	B.E. Meyers Electro Optics	D4300-I	Military grade product.
Red filter	Rosco Laboratories	Roscolux #27 Medium Red	May be used instead of IR system
Red head light	OcuScience	ERGX011	www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors	WPI, Inc.	500086	www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5	WPI, Inc.	14101
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000	www.emsdiasum.com
Scale	Metler Toledo	AB54-S/FACT	May use any brand
pH meter and electrode	Beckman Coulter	pHI 350	May use any brand
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	May use any brand
KCl	Sigma-Aldrich	60129	May use any brand
MgCl2	Sigma-Aldrich	63020	1.0 M solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21114	1.0 M solution
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	May use any brand
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	May use any brand
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	May use any brand
Ames medium	Sigma-Aldrich	A1420	May use any brand
BaCl2	Sigma-Aldrich	B0750	May use any brand
DL-AP4	Tocris Bioscience	101	May use any brand
Succinic acid disodium salt	Sigma-Aldrich	224731	May use any brand
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G2834	May use any brand
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	May use any brand
Leibovitz culture medium L-15	Sigma-Aldrich	L4386	May use any brand
MEM vitamins	Sigma-Aldrich	M6895
MEM amino acids	Sigma-Aldrich	M5550
Carbogen	Airgas	UN3156	5% CO2