Biyolojik Sıvı Ortamda Ölçeklenebilir, Metalik Yüksek Aspect Ratio Nanokompositlerin Üretimi

Özet

Burada biyolojik şartlar altında ve sıvı ortam içinde, yeni, yüksek en-boy oranı biocomposites sentezlemek için bir protokol mevcut. biocomposites sırasıyla çapı ve uzunluğu mikrometre nanometre kadar ölçeklendirilebilir. Sistin ile birlikte bakır nanopartiküller (KNP'ler) ve bakır sülfat sentezi için önemli bileşenleridir.

Özet

Bu protokolün amacı yüksek en-boy oranı yapıları ile iki yeni biocomposites sentezini tarif etmektir. biocomposites bakır nanopartiküller (KNP'ler) ya da metalik bileşen katkı bakır sülfat ile ya, bakır ve sistin oluşmaktadır. Sentez biyolojik koşullar (37 ° C) ve 24 saat sonra kendi kendini monte kompozit malzemelerin oluşturulması altında sıvı içinde gerçekleştirilir. Oluşturulduktan sonra, bu kompozitler hem sıvı ortam içinde ve kuru halde son derece stabildir. Kompozit uzunluğu aralığı Mikro-nano ölçekleme ve birkaç mikron çapı 25 nm. Enerji dispersif X-ışını spektroskopi (EDX) ile alan emisyonu tarama elektron mikroskobu böylece nihai nanokompozitlerin kükürt kaynağı olarak sistin teyit başlangıç ​​CNP malzemeden yokken kükürt, NP-türevi doğrusal yapılar içinde mevcut olduğunu gösterdi . Bu lineer nano ve mikro-kompozitlerin sentezi str uzunlukları ve çeşitli aralığındauctures sentez teknesine oluşturulmaktadır. Sentezden sonra, sıvı karışımın sonikasyonu sonication artan zamanla ortalama uzunluğu azaltarak yapıların ortalama boyuta kontrol edilmesine yardımcı olduğu gösterilmiştir. Oluşan yapılar yüksek toplanma olmayan, kararlı, sıvı faz içinde oluşturulmaktadır olduğu için, santrifüj, aynı zamanda konsantre edilmesi ve oluşturulan bileşikler ayrılmasında yardımcı olmak için kullanılabilir.

Giriş

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions ^1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form ^3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels ⁵. In studying the potential toxic effects of nanomaterials ⁴, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 °C and 5% CO₂), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.

By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called “urchin” and “nanoflower” type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 °C or greater ^6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described.

One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells ⁴. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs ⁹. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells.

In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media ^10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported ⁹. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described “coffee ring effect” ¹² and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deney 1. Planlama

1. Sentezi için gerekli olan bakır nanokompozitlerin hacmini belirleyin. Bu temelde, küçük hacimli şişeler (25 ^cm2), ya da malzemelerin hazırlanmasında, aşağıda gösterildiği gibi daha büyük bir şişe bir dizi seçim.
2. Bu sentez için,% 5 _CO2 ve en az% 40 nem ile 37 ° C inkübatör kullanın. Böyle bir inkübatör mevcuttur ve tekrar tekrar sentez döneminde (yaklaşık 24 saat) boyunca rahatsız olmayacak emin olun.
   DİKKAT: Tekrarlanan açma ve inkübatör kapanış kesinlikle nanokompozit yapılarının değişmiş sentezinde neden olabilir sıcaklık dalgalanmalarını neden olacaktır.

Malzemelerin 2. Hazırlık

1. Sentezi başlatmak için hemen önce çözücü maddeler, katı maddeleri ekleyerek, bir deney başlamadan önce taze tüm malzemeleri hazırlayın. Uzun zamanlar b sıvı içinde sistin ve bakır başlangıç ​​maddelerinin stok çözümleri tutulmasıefore Deney tavsiye edilmez ve değişken sonuçlara yol açabilir. Bir kez Parafilm ile kabın üst sararak kuru başlangıç ​​malzemeleri, satıcıdan devam açıldı.
   Not: Aşağıdaki protokol sistin 7 ul steril su 6643 ul ve KNP'lerle 350 ul kullanılarak 25 cm ² hücre kültürü şişesi içinde tepkimesi için bir örnek olarak kullanılmıştır.
2. KNP'lerle en az 2 mg tartılması bakır nanopartiküller bir 2 mg / ml çözeltisi hazırlayın. Cilt ile KNP'lerle olası temasını önlemek için bu adımı sırasında tek kullanımlık eldiven giyin. Boş bir steril 16 ml cam şişede nanopartiküller yerleştirin.
   1. KNP'lerin içeren şişeye, 2 mg / ml'lik bir çözelti oluşturmak ve sentez başlamadan önce nanopartiküllerin dağılmasını temin etmek için 20 saniye için çözüm vorteks uygun hacimde steril deiyonize su ekleyin (en az 1 mL toplam hacim tavsiye edilir). Bu vorteks karıştırma inhibe edecek şekilde su ile şişe yarısından fazlası yol doldurmayın. KNP'ler will hızla şişenin dibine yerleşmek ve (siyah gri) rengi koyu görünecektir.
   2. Sentezi başlamadan önce KNP'lerle maksimum dağılım temin etmek üzere, oda sıcaklığında 17 dakika boyunca CNP çözeltisi sonikasyon. Periyodik KNP'ler Sonication nedeniyle karıştırma emin olmak için kontrol edin. Başarılı Sonikasyon sonrasında, KNP'ler en az 30 dakika süre ile çözelti içinde askıda kalır ve çözelti, koyu renkli olur.
3. Sentezi için bir 72.9 mg / ml çözelti yapmak için sistin yeterli kütleye tartılır. Sistin su içinde doğrudan çözünür olmadığı için, antistatik tartım kabında tartılır sistin yerleştirin.
   1. Sistin tamamen eriyene kadar tartım kabı içeren sistin için, steril, 1 M NaOH yeterli hacmi ekleyin. Örneğin, bir 72.9 mg / ml çözelti elde edilerek, 1 M NaOH içinde 100 ul tam sistin 7.29 mg çözülür.
   2. Steril akış doku kültürü kaputu bu adımı yürütmek, steril koşullar korumak için.
      UYARI: NaOH1 M konsantrasyon yakıcı ile, yani deri ile konsantre NaOH temasını önlemek için bu adım sırasında atılabilir giyim eldivenleri
4. Steril doku kültürü kaputu çalışan birinci steril sentezi şişeye steril su 6643 ul sistin 7 ul, ve şişe kapağı ile 37 ° C'de kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe edin etkili sağlamak için (gevşek) havalandırılmış Karıştırma. KNP'ler sonikasyon aşamasından sonra yerleşmiş çünkü, 30 saniye boyunca girdaplanarak 2 mg / ml CNP solüsyonu yeniden süspanse edin.
   1. Sentezini başlatmak için 25 cm ² hücre kültürü şişesi steril su, 50 parça KNP'ler ve 949 parça 1 parça sistin birleştirmek: Aşağıdaki bileşen oranları korumak için (steril tekniği kullanarak) sentez şişeye yeterli CNP çözüm ekleyin. Örneğin, bir 7 mi sentezi hacmi için, sistin stok çözeltisi 7 ul, KNP'lerle 350 ul steril su 6643 ul birleştirir. Balona kapağını takın ve böylece secur olduğunu sıkıne.
   2. Sentez için tüm bileşenleri birleştirdikten sonra, yavaşça 4-5 kez dönen tarafından şişede karıştırın. _CO2 inkübatör şişeyi koyun ve ve sentez sırasında balonun dışına gaz değişimi olacak şekilde kapağı gevşeterek şişeyi havalandırma.
5. Sentez yaklaşık 24 saat inkübatör çalışmasına izin ver. Sentez sırasında, bir, mikroskopi ve gözle yüksek doğrusal kompozit oluşumunu gözlemleyebilirsiniz.
   Not: yapı oluşumu süreci yapıları tespit etmek için ilk olarak sabit olduğu anlamında anda meydana gelebilir, o zaman görünümü artan bir yoğunluğa hızlı bir şekilde ilerler. Formasyon bu nedenle 24 saat önce oluşabilir. yapılar büyük ve yoğunluğu artar haline kez süreç aynı zamanda gözle görülebilir. Yapıların üretimi daha sonraki zaman noktalarında mikroskop altında ve göz zaman içinde görülmekte iken, sürekli biçimde sentez koşullarının kesintiye ve sıcaklık zayıf yol açacaktırSentez sonucu.
6. Sıkı sentezi şişesi kapak kapama ve bir buzdolabına (4 ° C), teknenin depolayarak biocomposites sentezini iptal eder. Bir kez üretilen yapıları, en az bir yıl boyunca bu şekilde sabit kalır. Kullanılan bileşenlerin sentez tarihi ve sona ermeden sentez inkübasyon süresi de dahil olmak üzere sentez koşulları ile balon etiketleyin.

Bakır Sülfat Kullanılması 3. Sentezi

1. Bakır sülfat tuzu ile KNP'lerin değiştirerek kendini montaj sentezini yürütmek. Steril teknik kullanılarak, 2 mg / ml'lik bir solüsyon yapmak için, steril deiyonize su, yeterli hacimde bakır sülfat, en az 2 mg çözülür. bakır sülfat kristalleri kolayca bu konsantrasyonda çözelti içine gitmek, ama gerekirse flakon vorteks ve tüm kristalleri çözülür sağlamak için göz tarafından kontrol edin.
2. Daha önce tarif edilen, ancak bakır sülfat ile KNP'lerin değiştirilmesi gibi bakır sülfat hazırlanmasından sonra, sentez yapmak.
   Not: Bir başlangıç ​​malzemesi olarak, bakır sülfat kullanarak kendi kendine bir araya nanokompozitler KNP'lerle sentezlenen yapılar için daha kesin bir şekil çok daha tutarlı olduğu bulunmuştur.
3. CNP kompozitler gibi bakır sülfat biocomposites sentezini sonlandırma (2,6 aşama) ve 4 ° C de, uzun dönemli saklayın.

4. Karakterizasyonu ve Biocomposites Post-sentez taşınması

1. KNP'lerle gelen ve beyaz ışık mikroskobu ⁹ bakır sülfat gelen ve elektron mikroskobu ⁹ türetilen biocomposites karakterize.
   1. Kompozit bir şişeye, düz döşeme birkaç dakika içinde şişenin alt yüzeyine yerleşmek gibi karakterizasyonu ve biocomposites beyaz bir ışık mikroskobu ile sentez sonrası incelenmesi için, bir ters mikroskop kullanarak ve daha sonra odak noktası haline getirilebilir. Biocomposites ve sıvı ortamın arasındaki kontrastı en üst düzeye çıkarmak için mikroskop parlak alan ayarını kullanın. KNP'lerle ve polis türetilen kompozitlersülfat başına hem renkli opak açıkça görünür, ancak girmemiş CNP agrega rengi çok koyu görünecektir.
      1. Kompozit görüntü yakalamak için mikroskop bağlı bir dijital kamera kullanın. Ayrı ayrı yapılar için uzunluklarının bir aralığı gözlenecektir.
   2. Karakterizasyonu ve biocomposites sentez sonrası denetimi ve 4 ° C'de depolamadan sonra, şişeler mikroskopi görüntüleme yaparken odaklama etkili belirsiz olacaktır buzdolabından çıkarıldıktan üzerine ilk yoğunlaşmayı oluşturmak gibi şişeler, en az 15 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin. Oda sıcaklığına dengede bırakıldıktan sonra, mikroskopi görüntü kalitesi üst düzeye çıkarmak için temiz bir kağıt havlu ile balonun üst ve alt yüzeylerini silin.
   3. Buzdolabında ise oluşturan kompozit kümeleri ayırmak için 30 saniye boyunca uzun süreli saklanan ya da görüntüleme kompozitler, girdap şişesi çalışırken. Vorteks sonra ters mikrofon ile yapıları incelemekroscope agrega ayrışmış emin olun ve gerekirse vorteksleme tekrarlamak için.
   4. KNP'lerin kullanarak belirli bir deney için sentez etkinliğini değerlendirmek için ters beyaz ışık mikroskobu kullanarak. Örneğin, bu tür sentez süresi olarak farklı parametrelerle şişelerinden CNP türetilmiş biocomposites için kullanılan sentez şişelerinde reaksiyona girmemiş KNP'lerle varlığını ya da yokluğunu belge.
      Bağımsız KNP'ler bir ışık mikroskobu ile gözlenmek için çok küçük, ancak reaksiyona girmemiş CNP yüksek en boy oranı, doğrusal bir biçime sahip olacaktır başarıyla sentezlenmiştir CNP-kompozitler aksine, yuvarlak şekil ve koyu renkli bir nesne olarak görülür agregatlar ve Not: Farklı uzunluklarda bir dizi olacaktır. Bu bir kez meydana getiren bireysel yapılar halinde dağılması zor olan yüksek ölçüde dallanmış "kestanesi" tipi yapılarda neden olacağı için, sona önce bir süre çok uzun için sentez gerçekleştirilmesi kaçının.
   5. Etkinliğini değerlendirmek için ters beyaz ışık mikroskopisi kullanınBakır sülfat kullanılarak, belirli bir deney için sentez. Bakır sülfat, bu protokolü kullanarak çözelti içine tamamen gider yana, çözüm KNP'lerin kullanarak sentezden çözümün daha az karanlık görünür. Böyle bir fesih öncesi sentez zaman gibi farklı sentez koşulları şişeler karşılaştırarak bakır sülfat kompozit boyutunu ve kapsamını belgeleyin.
      Not: Başarıyla sentezlenen kompozit farklı uzunluklarda bir dizi gösterecektir. Bu "kestanesi gibi" bir yapıda olacaktır bazıları kompozitler, yüksek ölçüde dallanmış agrega neden olacağı için, sona önce bir süre çok uzun için sentez gerçekleştirilmesi önlemek ve hangi bir kez meydana getiren bireysel yapılar halinde dağılması zor olan .
2. Biocomposites sonrası sentezi, bir santrifüj tüpü içinde kompozitlerin santrifüj çözümler yoğunlaştırmak. 15 ml santrifüj tüpüne CNP-türevi yapılar ya da bakır sülfat türevi yapılar, ya 6 ml ilave edilir. 10 dakika boyunca santrifüjoda sıcaklığında, 500 x g'de topak elde etmek için. Daha küçük miktarlar için, 0.6 ml boyutlu tüpler çözüm yapıların 500 ul ekleyin. En az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında 2000 x g'de santrifüjleyin bir topak oluşturmak için.
   1. Yeterli bir süre boyunca (mikrofüjler için en az 10 dakika) santrifüje tabi tutulmasının ardından yapıları dikkatli bir şekilde pelet üzerinde yüzer sıvının çıkarılması ile konsantre edilir tüpün altındaki gözlemlenebilir pelet kaydedin. Bakır sülfat elde edilen Biyokompozit yapıları renk ve KNP'lerle türetilen yapılarda mavi koyu (siyah gri) vardır görünür.
   2. Bu tüp daha kompozitler ekleyin ve istenirse yapıları konsantre aynı tüpte işlemi tekrarlayın. Konsantre granül dağıtmak için, 10-30 saniye süre ile, istenen tüp çözeltisinin hacmi ve vorteks ekleyin.
3. Sonikasyon yapılar bir zamanlar değerlerini düşürmek için yapıların ortalama nüfus büyüklüğü (uzunlukları) taşımak için, kurdu. En le steril deiyonize su ve sonikasyon yerleştirin yapılarıast 10 dk. Zamanla, bu yöntemi kullanarak, yapılar parçalanmış, ortalama uzunluk (metin bakınız Şekil 6) daha küçük hale gelir. Ters beyaz ışık mikroskobu ve dijital kamera kullanarak farklı sonication kez kompozit boyutlarda Belge değişir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1, bu çalışmada tarif lineer biocomposites oluşturmak için sentez adımlarına ait bir akım şeması şemasını göstermektedir. Başlangıç ​​materyalleri olarak KNP'ler ya da bakır sülfat, 2 mg / ml'lik bir çözelti oluşturmak üzere, steril su ile birlikte, bu çözüm, karıştırılır ve eşit bir karışım sağlamak için sonike ve bu çözelti daha sonra, bakır sentezi için, aşağıdaki oranda karıştırılır edilir: 949 parça, steril su: 50 parça bakır ka...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

KNP'lerle dahil Nanomalzemelerin potansiyel toksik etkileri değerlendirirken, uzun vadede, KNP'ler büyük, birleştirilmiş forma başlangıçta daha dağınık partikül dağılımı (Şekil 2) dönüştürülmüş olduğu gözlendi. Bazı durumlarda, biyolojik şartlar altında, hücre kültürü çanağı üretildi, bu son derece birleştirilmiş formasyonlar "kestanesi" içeren daha önce tarif edilen bakır andıran merkez agrega oldukça lineer çıkıntılar oluşturulmuştur ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini Vortexer	VWR (https://us.vwr.com)	58816-121
CO2 Incubator Model # 2425-2	VWR (https://us.vwr.com)	Contact vendor	Current model calalog # 98000-360
Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)	Labnet (http://labnetinternational.com/)	C2500-R	Model Prism R
Cell Culture Centrifuge Model Z323K	Labnet (http://labnetinternational.com/)	Contact vendor	Current model Z206A catalog # C0206-A
Sonicator (Ultrasonic Cleaner)	Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)	1510R-MTH
Balance	Sartorius (http://dataweigh.com)		Model CP225D similar model CPA225D
Olympus IX51 Inverted Light Microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Olympus DP71 microscope digital camera	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
external power supply unit - white light for Olympus microscope	Olympus (http://olympusamerica.com	TH4-100
10X, 20X, and 40X microscope objectives	Olympus (http://olympusamerica.com	Contact vendor
Scanning Electron Microscope	Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)	model S-4800
Transmission Electron Microscope	Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)	model Libra 120
Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench	Envirco (http://envirco-hvac.com)	model PNG62675	Used for sterile cell culture technique