Ağır Metal ve Mikroalglerden Verimlilik Diğer İnorganik Bulaşanlar Kantitasyonu

Özet

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Özet

Yenilenebilir yakıtlar için artan talebi gibi mikroalglerin gibi alternatif feedstocks, fizibilite araştıran araştırmacılar vardır. Kalıtsal avantajlar atık akışları ile potansiyeli yüksek verim olmayan ekilebilir arazi kullanımı ve entegrasyonu yer alıyor. büyük ölçekli mikroalg üretim sisteminin besin gereksinimleri gibi baca gazı ve atık sudan besin karbon dioksit gibi endüstriyel atık kaynakları, yetiştirme sistemleri kaplini gerektirecektir. Bu atıkların mevcut inorganik kirleticiler potansiyel olumsuz verimlilik ve sınırlayıcı uç kullanımını etkileyen mikroalg biyokütle biyolojik birikme yol açabilir. Bu çalışma etkisi deneysel değerlendirilmesi ve Nannochloropsis salina büyüme üzerinde 14 inorganik kirleticiler (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V ve Zn) kaderi üzerinde duruluyor . Mikroalgler büyüme m pH 7'de 984 ľmol m ^-2 sn ışıklı fotobiyoreaktörler yetiştirilen ^-1 ve muhafaza edildiseviyelerde inorganik kirleticiler ile kirlenmiş edia ticari kömür baca gazı sistemlerinde bulunan bileşimine dayalı beklenen. Biyokütle ve 7 gün büyüme dönemi sonunda ortamda bulunan kirleticiler analitik, Hg ve As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni için indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi sayesinde soğuk buhar atomik absorpsiyon spektrometresi ile ölçüldü Pb, Sb, Se, Sn, V ve Zn'den en. Sonuçlar N. göstermek salina bu kirleticilerin giriş yieldwith biyokütlesindeki istatistiksel azalma ile çoklu metal çevreye duyarlı bir türdür. Burada sunulan teknikler alg büyümesini miktarının ve inorganik kirleticilerin kaderini belirlemek için yeterli.

Giriş

Geleneksel karasal bitkileri ile karşılaştırıldığında mikroalg doğasında daha yüksek güneş dönüşüm verimliliği ^1,2 nedeniyle daha yüksek bir biyokütle ve lipit verimi elde etmek için gösterilmiştir. Yüksek verimlilik oranları microalglerin Yetiştirme harici karbon kaynağı dahil olmak üzere çeşitli besin kaynağı gerektirir. Bu büyük ölçekli büyümesi tesisleri üretim maliyetlerini en aza indirmek için bu tür endüstriyel baca gazı gibi endüstriyel atık akımlarının ile entegre ve aynı zamanda, çevre iyileştirme sağlayabilir olması beklenmektedir. Endüstriyel atık karbon gaz karbondioksit şeklinde tipik ve olumsuz mikroalg üretimi etkileme potansiyeline sahip kirleticiler içerebilir. Spesifik olarak, kömürden türetilmiş baca gazı da dahil olmak üzere kirletici maddelerin çeşitli ancak yanma ürünleri, su ve karbon dioksit gibi sülfür ve nitrojen, ince toz, örneğin dioksin ve furanlar gibi organik kirletici oksitleri ve inorganik con bunlarla sınırlı değildirağır metaller gibi kirleticileri. microalgae verimlilik üzerindeki ağır metaller olarak bilinen bazıları ile inorganiklerin dahil olmak üzere bu kirleticilerin çoğunluğunun etkisi araştırılmış değil. Bu unsurların bazıları, uygun konsantrasyonlarda besin olabilir ancak yüksek konsantrasyonlarda onlar hücre disfonksiyonu ve hatta ölüme ^3. üretebilir.

Endüstriyel baca gazıyla mikroalg entegrasyonu doğrudan büyüme ortamı içine inorganik kirletici maddeleri tanıtmak için potansiyele sahiptir. Kömür göre baca gazı, inorganik elementler (örneğin, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V ve Zn, As) bazıları, düşük çeşitli konsantrasyonlarda bir çeşitlilik vardır konsantrasyon, mikroalg büyümesi için besin temsil etmektedir. İnorganik kirletici yüksek afiniteli bir mikroalg bağlamak için ve daha fazla besin maddesi taşıyıcıları aracılığıyla dahili emdirilebilecek sahiptir. Bazı inorganik kirletici maddeler (örneğin, Co, Cu, Zn, Mn) içeren enzim parçası besin olanfotosentez, solunum ve diğer fonksiyonlar ^3,4 d. Ancak, aşırı metal ve metaloidlerin toksik olabilir. Böyle Pb, Cd, Sn, Sb, Se, As ve Hg gibi diğer unsurlar, herhangi bir konsantrasyonda hücre fonksiyonunu desteklemesi ve olumsuz kültür büyüme ^3,5,6 etkileyebilecek olmayan besin metalleri temsil etmek bilinmemektedir. Bu kirletici maddelerin herhangi birinin mevcudiyeti mikroalg hücre fonksiyonu üzerinde olumsuz etkileri üretme potansiyeline sahiptir. Ayrıca, mikroalg ile birden çok metal etkileşimi büyüme dinamiği karmaşık hale getirmekte ve bir büyüme etkisi potansiyeline sahiptir.

Büyük ölçekli ekonomi doğrudan yetiştirme sisteminin ^7-19 verimlilik bağlantılı olmuştur. Bu kütlenin 99.9 ve% 99.4'ünü, sırasıyla ²⁰ temsil Dahası, açık kanal havuzlarda (ORP) veya fotobiyoreaktörler biri için mikroalg büyüme sistemi (PBR) orta geri dönüşüm önemlidir. medyada inorganik kirleticilerin varlığı sonuçta m sınırlayabiliricroalgae verimlilik nedeniyle kirletici birikmesi Medyanın geri dönüşüm. Bu çalışma deneysel, (Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V ve Zn, As) mikroalg yetiştirme sistemlerinin entegrasyonu beklenen konsantrasyonlarda 14 inorganik kirleticilerin etkisini tespit Kömür N. üretkenliğine, baca gazı kaynaklı olan salina airlift PBRs yetişmektedir. Bu çalışmada kullanılan kirletici maddeler yalnızca kömür bazlı baca gazı, ancak belediye atık göre baca gazı, biyolojik katı maddeler bazlı baca gazı, belediye atık su, üretilen suyun, bozulmuş yeraltı suyu ve deniz ^21-23 mevcut vermeye gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan konsantrasyonlar mikroalg büyüme sistemleri ticari PBR sistemleri ²⁰ gösterildiği, bir alım verimle bir kömür bazlı _CO2 kaynağı ile entegre takdirde beklenebilecek olana dayanmaktadır. Ağır metaller ve inorganik kirleticilerin konsantrasyonlarının destekleyen detaylı hesaplamalar Napan sunulmuşturve ark., ²⁴ analitik teknikler biyokütle, medya ve ortamda metallerin çoğu dağılımını anlamak için kullanıldı. sunulan yöntemler inorganik kirletici stres ve bitiş kader miktarının altında microalglerin verimlilik potansiyelinin değerlendirilmesini sağladı.

Protokol

1. Büyüme sistemi

Şekil 1. Mikroalgler büyüme sistemi. (A) Hava rotometre, (B) CO ₂ rotometre, solenoid ile (C) pH kontrolörü, (D) data logger, (E)-line hava filtreleri, (F) hava dağılımı başlığı, (G) floresan ışık bankası, (H), pH metre, (I) soğutma sistemi, (J) su banyosu, (K) termokupl teli, (L) hava asansör foto-biyo (M) ısıtıcı, (N) walk-in dumanının davlumbaz, (O) havalandırma, (P) hava teslim kılcal tüp, (Q) hava filtreleri, (R) örnekleme borusu, (S) PBR silikon kapak ve (T)Silikon kapağı pH de. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. Aşağıdaki microalgae deneysel büyüme sistemi (Şekil 1) oluşturun.
   1. Cam tüp reaktör çapı 4.5 cm ve silikon kapaklı 1,1 L'lik bir kültür kapasitesi olan yükseklik 80 cm oluşan on iki hava ikmal PBRs elde edin. 10 cm (PBR başına 3) ve uzunluğu 85 cm (PBR başına 1) ve önceden kesilmiş cam kılcal boruları (5 mm'lik dış çapa ve 1 mm iç çap) elde edin.
   2. -80 ° C derin dondurucuda silikon kapaklarını dondurun. Gliserol ile bir matkap yağlayın ve kapaklar tatbikat havalandırma, numune alma ve gaz iletim kılcal tüpler barındırmak için 3 delik ve 17 mm çapında 1 delik dondurulmuş ise pH probu barındırmak için.
   3. Pbr altından 2 cm uzayan uzun tüp ile yerine 3 kılcal tüpler yerleştirin. Diğer kılcal tüp içinde bir silikon tüp wi ekleyinarzu edilen bir numune alma noktasına uzanan diğer ucuna bağlı bir kılcal tüp Th. Bir silikon tıpa boyutu 21D ile pH metre deliğini kapatın.
   4. Su aracılığıyla köpüren ile ortam havasını nemlendirmek ve hava dağıtım başlığına nemlendirilmiş havayı teslim. 0.2 mikron filtre ile gaz Pass ve uzun cam teslim kılcal tüp yoluyla alg süspansiyon teslim.
   5. Kültür süspansiyon içinde 7.0 ± 0.1 nötr pH değerini muhafaza etmek için, nemlendirilmiş hava akımı içine sıkıştırılmış _CO2 sağlayın. Alg kültür pH'ı 7.1 ulaşır ve pH 6.9 de kapandığında manyetik selenoid açan otomatik CO ₂ dispanser sistemi (pH kontrolörü) ile CO ₂ doğum oranını kontrol edin.
   6. 984 ľmol m ^-2 sn ^-1 açık koşullara zirve benzer bir ortalama aydınlatma sonucu 24 T5 floresan lambalar kullanılarak ışık sağlar.
   7. M için bir su banyosu içinde PBRs bırakınyaklaşık 25 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta AINTAIN. Bir sirkülasyon soğutucu ve otomatik ısıtma sirkülasyon su banyosu ünitesi denetimi kullanarak sistem sıcaklığını kontrol edin.
   8. Gerçek zamanlı olarak sıcaklık ve pH değeri Monitör ve data logger ile kaydedin.
   9. Mikroalg büyüme sisteminin tüm bileşenleri düzgün özellikle mikroalg inokulum hasat ya da muhafaza edilemez gibi inorganik kirleticileri hazırlamadan önce, çalıştığından emin olun.

2. Laboratuvar Gereçleri Hazırlanması

1. Sabun ve musluk suyu ile hacimsel matara, PBRs, damacanalar ve herhangi kapları, yıkayın. Deiyonize su (DW) ile durulayın.
2. Asit inorganik kirletici izlerini ortadan kaldırmak için laboratuar gereçleri yıkayın. Bu iki yoldan biriyle yapılabilir:
   1. Nefes dumanı, konsantre nitrik asit, bir duman hoo şiddetli yanma ve toksik dumanlar, işi üretebilir Do not: lab eşya O / N% 10 eser metal dereceli nitrik asit (DİKKAT batırınnitril eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü) ile d.
   2. % 50 eser metal dereceli nitrik asit içinde 15 dakika boyunca laboratuar gereçleri bekletin.
   3. DW ile tüm asit kaldırılır emin iyice en az 3 kez laboratuar eşya durulayın. Bu PBRs iyice özellikle örnekleme tüpleri ve kılcal tüpler durulanır önemlidir. Bunun yapılmaması büyüme orta ve olası inhibisyon asitlenmesini üretecek. Tüm asit doğrulamak için durulama suyunun pH test kaldırıldı.
   4. En az 30 dakika boyunca 120 ° C'de ve standart atmosfer basıncında, onları otoklav ile PBRs, konteyner ve şişeler sterilize edin.

3. N. salina Orta Hazırlık

1. Çözelti A'nın Hazırlanması: Kısmi DW ile 1 L'lik bir volumetrik balona doldurmak. Manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve diğer sonra Tablo 1 'de gösterilen bir kimyasal madde ekleyin. Her madde bir sonraki bileşenin eklenmesinden önce çözülür emin olun. Mıknatısı çıkarın ve th doldurmak1 L'lik hacim işaretinin e şişe.

Bileşen	Eklemek Tutar (g)	Nihai konsantrasyonu (g / l)
H 3 BO 3	0.900	0.900
Na 2 MoO 4 · 2H 2 O	0.012	0.012
MnCl2 · 4H 2 O	0.300	0.300
ZnSO 4 · 7H- 2 O	0.060	0.060
CuSO 4 · 5H 2 O	0.020	0.020

Tablo 1:. Çözelti A tarifi Miktarları konsantre çözelti 1 L hazırlanmasında gerekli miktarlardır.

2. Vitamin çözeltisinin hazırlanması: Üç ayrı volumetric şişeler steril bir kaba steril 0.2 um şırınga filtre ile Tablo 2'de gösterildiği gibi. vitamin eklemek için, her vitamin çözeltisi ise filtreden. Karanlıkta ° C'de -4 vitamin korumak.

Vitaminler	Tutar (mg)	Nihai hacmi (mi)	Nihai vitamini konsantrasyonu (mg / L)
Biotin	12.22	500	24.43
B12 vitamini	13.50	100	135.00
Tiamin hidroklorür	977,63	500	1,955.27

Tablo 2:. Vitamini çözeltisi tarifi Miktarları konsantre Solu hazırlanması için gerekli miktarlardıryon.

3. Kısmen DW ile 20 L Otoklavlanabilir kabı dolduracak ve bir manyetik karıştırıcı çubuğu yerleştirin. Bir manyetik karıştırıcı plaka üstüne kabı yerleştirin ve (vitamin hariç) Tablo 3'te gösterilen kimyasal ekleyin birbiri ardına ve her tam eridikten sonra bunları bir ekleme. 20 L. ulaşmak için konteyner doldurunuz

Bileşen	Tutar ortamına eklemek	Birim
NaCl	350.00	g
CaCI2 · 2H 2 O	3.00	g
KCI	9.60	g
Na 2 SiO 3 · 9H 2 O	1.14	g
MgSO 4 · 7H 2 O	29.60	g
KNO 3	20.40	g
KH 2 PO 4	1.36	g
Amonyum ferrik sitrat	0.10	g
Çözüm A	20.00	ml
Biotin solüsyonu *	818,00	ul
Vitamin B12 çözümü *	296,20	ul
Tiamin hidroklorür çözeltisi *	521,60	ul
* Soğutmalı otoklava medya ekle

Tablo 3: N. salina orta tarifi. Miktarları besin açısından zengin bir ortamda 20 L hazırlanmasında gerekli miktarlar vardır.

4. 30 120 ° C'de ve atmosfer basıncında dakika süre ile otoklavlama sureti orta sterilize edin. Orta coo edelimRT aşağı l.
5. Bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde kap yerleştirin. Adım 3.2 hazırlanan vitamin ekleyin ve iyice orta karışımı sağlar.

4. İnorganik kirleticiler hamur hazırlama

1. Kısmen DW ile Tablo 4'te belirtilen hacimsel şişeler dolgu ve listelenen bireysel tuz ekleyin. Gerekli nihai hacme DW ile doldurun ve iyice karıştırın. Bazı unsurları duvarları şişeyi adsorbe olarak bu stokları korumak etmeyin
   DİKKAT: tuzlar işlerken Bu protokolde kullanılan çeşitli inorganik kirleticiler, kanserojenik, teratojenik ve mutajenik olan bir yüz maskesi, eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek.

Analit	Tuz kaynağı	Stokta hacmi hazırlamak için (L)	Tuz şişeye ekleyin60; (Mg tuzu)	Analit konsantrasyonu kültüre ilave (mg analit / L)
Olarak	NaAsO 2	0.1	14.8	7.74E-02
CD	CDC 2	0.5	13.5	1.50E-02
Co	CoCl2 .6H 2 O	0.5	34.7	1.56E-02
Cr	Na 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O	0.1	40.6	1.29E-01
Cu	CuCl 2 .2H 2 O	0.1	38.3	1.30E-01
Hg	HgCl 2	1.0	14.6	9.80E-03
Mn	MnCl2 .4H 2 O	0.1	58.8	1.49E-01
Ni	NiCl 2 'nin .6H 2 O	0.1	112.0	2.51E-01
Pb	PbCl 2	0.5	39.9	5.41E-02
Sb	Sb 2 O 3	0.5	26.7	4.06E-02
Se	Na 2 SEO 3	0.5	11.8	9.80E-03
Sn	SnCl2 .2H 2 O	0.5	3.9	3.76E-03
V	V 2 O 5	0.1	22.2	1.13E-01
Zn	ZnCl2	0.1	99.9	4.36E-01

Tablo 4:. 1.1 L PBR ortamına bu konsantre stok 1 ml konsantre inorganik kirletici maddeler hamur hazırlama Eklenen son sütunda gösterilen nihai konsantrasyon üretir.

2. Steril 0.2 um şırınga filtresi üzerinden geçirilmesiyle inorganik kirletici stokları sterilize ve steril bir tüp içinde süzülen madde toplanır.

5. N. salina Aşı Üretim

1. 500 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi, adım 3'te hazırlanan ortam 200 ml ilave edilir ve daha sonra ağar, 3 g ekleyin. 120 ° C 'de 20 dakika süre ile alüminyum folyo ve otoklav ile şişesi örtün. Steril petri kaplarına çözüm dökün ve sertleşene kadar serin olsun. Bu, steril bir başlık ya da en azından kontaminasyon riskini azaltmak için temiz bir ortamda bir alev yakınında tamamlanmalıdır.
2. Streak N. steril petri-dis içinde salina hücrelerihes steril tohumlama döngü kullanarak adım 5.1 hazırlanan. Oda sıcaklığında muhafaza T12 ışıkları ile aydınlatılmış bir masanın üzerine petri çanağı kültürleri yerleştirin. Koloniler görünür olana kadar mikroalg büyütelim.
3. Aktarım kolonileri besleyici zengin ortam 200 ml aşama 3'te hazırlanan ve ışıklı çalkalama tablası (1000 RPM) üzerine tutmak içeren Erlenmeyer bölmeli şişeler, steril etmek. Orta yeşil olana kadar kültür büyümesine izin.
4. 1.1 L steril PBR için mikroalglerin aktarın. Bir sirkülasyon soğutucu ve otomatik ısıtma sirkülasyon su banyosu kumanda ile 23 ° C'de 200 ľmol m ^-2 sn ^-1 T8 floresan ışıkları ile aydınlatılmış ve tutulan bir inokulum su banyosunda PBR yerleştirin. Sırasıyla ^-1 dk dk ^-1 2.5 L ve 25 cc hava ve CO ₂ rotometers ayarlayın.
5. Yeni ortamı içeren yeni 1 .1 L PBRs içine büyüme bölünmüş biyokütle bir hafta sonra ve kuru ağırlık biyokütle olan en az 28 gr toplam kadar büyümesine izinOptik yoğunluk yoluyla belirlenebilir iki reaktör arasında elde edilmiştir.
6. Kirlenmesini önlemek için steril bir santrifüj şişeleri ve steril teknikler kullanılarak, 10 ° C'de 15 dakika boyunca 2054 x g'de santrifüjleme ile hasat biyokütle aşı. Süpernatant atınız ve gerektiği gibi hücre konsantrasyonunu devam edin.
7. Bir kez tüm biyokütle santrifüjlenir, taze, steril ortam 300 ml hücrelerin yeniden askıya.
8. DW 3 ml mikroalg kültürünün 0.1 ml seyreltilir ve daha sonra DW 3 ml yeni çözeltinin 0.1 ml seyreltin. Örnek sağlamak iyice karıştırılır. 750 nm'de mikroalg konsantresi optik yoğunluk (OD) ölçün () hemen bir spektrofotometre kullanılarak.
9. (1) konsantre biyokütle miktarını belirlemek için denklem kullanın.
   Denklem (1) N (g / L ^-1), total askıda katı madde karşılık arasındaki doğrusal regresyon analiziyle elde edildi: Not Salina (R = 0,9995 ^2). Denklem 1 spectr için geliştirilmiştirBaşka bir spektrofotometre modeli kullanılarak eğer Malzeme Tablo modeli ophotometer, yeni bir kalibrasyon oluşturur.
   1. Denklem (2) kullanarak (L) mikroalg konsantresi hacmi hesaplamak (L), bir PBR 1.1 L hacminde bir 4 g / L ^-1 Kültür yoğunluğu elde etmek için gerekli.

10. Steril teknik kullanılarak, mikroalg hacmi, 4 g / ^L-1 bir ilk kültür yoğunluğa ulaşmak için otoklavlanmış PBR adım 5.9 bulundu konsantre ekleyin. 6 PBRs aşılanır kadar 1.1 L. orta PBR doldurun bu adımı yineleyin. Inokulum su banyosunda PBRs yerleştirin.
11. PBRs içinde mikroalg 8 gün büyümesine izin ve ardından (yinelenen adımlar 5,6-5,7) tarafından hasat biyokütle. Adımı yineleyin 5.8 başlangıç ​​hesaplamak1 g / L ^-1 bir başlangıç ​​kültürü yoğunluğu aşı hacmi.

6. Deneysel Reaktörler

1. Kullanılarak steril teknikler 12 asit durulanmıştır steril PBRs her bir aşama 3'te hazırlanan ortamın yaklaşık 1 L ilave edin. Deneysel büyüme sisteminin su banyosunda PBRs yerleştirin. ^-1 Dk 1.5 L üzerinde serpme havayı açın.
2. % 70 etanol ile temizleyerek kalibre pH metre sterilize edin. PBR ortamın pH'ı ölçün ve pH yaklaşık 7.0 olduğundan emin olun; değilse, 2 numaralı adımı yineleyin asit durulama aşamasından süzülen asidi uzaklaştırmak için.
3. Etanol (% 70) kullanılarak problar dezenfekte etmek ve sonra da kapak PBRs bunları eklemek tamponu, pH 7 ile her bir pH denetleyicisi kalibre edin.
4. (Kontrol PBRs hariç) her bir PBR kirleticilerin tamamen PBR karıştırın olsun aşama 4'te hazırlanan steril inorganik kirletici maddeler stoklar her 1 ml. PBRs inorganik kirleticilerin nihai konsantrasyonu göstermek vardırn Tablo 4'te son sütununda ve kömür yakıtlı enerji santrali entegrasyonu tahmin maksimum konsantrasyonları bekleniyor.
5. Kontrol PBRs steril DW 14 ml ekleyin.
6. 1 g / L ^-1 başlangıç ​​kültürü yoğunluğunun elde edilmesi için, deneysel PBRs adım 5.11 'de elde edilen konsantre mikroalg inokulum ekleyin. Iyice biyokütle karışımı edelim.
7. Yüksek ışık yoğunluğu ışıklar (984 ľmol m ^-2 sn ^-1) ve pH kontrolörleri açın ve 30 cc min ¹ CO ₂ ayarlayın. 50 cc dak CO ₂ akışını ^-1 sonradan 3 gün artması. İlk düşük _CO2 akış hızı nedeniyle gaz / sıvı transferi ve pH ölçümü gecikmelere pH büyük değişiklikler önlemek için kritik öneme sahiptir.
8. Tedbir ve gerektiği gibi örnekler alabilir. Örnekleme sonra su seviyesini işaretlemek için emin olun. (DİKKAT: pbr bazı inorganik kirleticiler, kanserojenik, teratojenik ve mutajenik olduğu, kullanım eldiven ve capped konteynerler) örnekleri işlerken.
9. Buharlaşmaya bağlı kayıpları telafi etmek için PBRs günlük steril DW ekleyin.
10. Büyüme 7 gün sonra, 9936 x g santrifüjleme ile hasat biyokütle ve -80 ° C de, her iki, biyokütle ve süpernatan ortamı muhafaza eder.
11. 0.1 mbar ve -50 ° CO / N de biyokütle kurumaya dondurun. Toz biyokütle (santrifüj tüp içinde toz biyokütle bir spatula kullanın). -80 ° C'de dondurularak kurutuldu biyokütle korur.

Numunelerin sindirimi Destekli 7. Mikrodalga

biyokütle örneklerinin sindirimi ICP-MS analizi için, bir ön işleme adımında, gereklidir.
Not: Bu adımlar kontrollü basınç rahatlaması ile kapalı bir kap mikrodalga sindirim sistemini kullanın. (DİKKAT: Yüksek basınç, asit sindirim sırasında geliştirmek sindirim gemileri ve kalkan fiziksel bütünlüğünü incelemek ve her kullanımdan önce mikrodalga sindirim damar kapaklarını yeniden şekillendirmek).

1. Sabun ve suyla yıkayın Teflon mikrodalga sindirim gemiler, DW ile durulayın ve gemilerin hava kurumaya bırakın. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi damarlarda eser metal kontaminasyonu temizlemek için asit sindiremez.
2. Mikrodalga sindirim damar kapakları yeniden şekillendirme ve sıkıca şişeleri kapatın.
3. Her bir nitrik asit 10 ml ilave edilir.
4. Emniyet kalkan gemi tanıtın. Hiçbir biyokütle, su ya da herhangi bir reaktif maddeler güvenli kalkan zarar görmesini önlemek amacıyla emniyet kalkanı duvarlarında ya da sindirim gemilerin dış duvarlarında kalmadığından emin olun. Emniyet valfi flakon bahar aynı hizada emin emniyet kalkanı Cap. Kapak delikleri, dış satırda ve içeri doğru iç satırda dışa bakacak şekilde rotor üzerindeki kalkan bulun.
5. Damar bir numaralı günü, seramik termovel ve sıcaklık sensörü takın. Bu termometre şişede gerçek iç sıcaklığı izler ve sindirim progr yürütmek kontrol parametre olarak hizmet vermektedirduyuyorum. Şişe numara bir başka şişeleri aynı numune ve reaktif miktarlarını içerdiğinden emin olun.
6. Girdi sindirim parametreleri Tablo 5'te gösterilen ve sindirim başlar. Program tamamlandığında onlar RT ulaşana kadar, hava şişeleri serin.

Adım	Durulama Şişeler			Örnek sindirim
	Sıcaklık (° C)	Süre (dk)	Max. gücü (W)	Sıcaklık (° C)	Süre (dk)	Max. gücü (W)
1	RT 190	25	1000	RT 180	15	1000
2	190	10	1000	180	15	1000
Egzoz	-	20	-	-	20	-

Tablo 5: mikrodalga sindirim programda kullanılan parametreler.

7. Davlumbaz içinde, kapak delikleri ile kalkan kapağındaki basınç tahliye aracı sizden uzağa işaret yerleştirin. (: Biyokütle sindirim asit kullanılarak beri davlumbaz içine her zaman açık sindirilir şişeler toksik dumanlar üreten DİKKAT) Basınç kapağını açık bırakılır kez.
8. Asit atınız. DW 3 kez ile Teflon gemileri durulayın. Kuru hava flakon edelim.
9. , Biyokütle sindirmek mikrodalga sindirim gemilere dondurularak kurutulmuş biyokütle 50 mg ekleyin. Kalite kontrol (KK) aşağıda şişeleri hazırlanması için: ekleme iki farklı şişelerde ya da seviye 7 ICPMS 5 ml ya da kademeleri 9.1 ve viyalden 10.1 (sindirilmiş olan çözelti içinde hazırlanmış Seviye 7 Hg CVAAS standart 5 mi takviye laboratuvar adlandırılır Boş (LFB)), başka bir şişe boş (sindirilmiş çözüm bırakınBu tüpten Laboratuar reaktifi olarak adlandırılan boş (LRB)).
10. , Orta sindirmek 10 mi asidi durulandı mikrodalga sindirim damarları kuru süpernatan ortamı ekleyin. Kalite kontrol (KK) aşağıda şişeleri hazırlanması için: İki farklı şişeler içinde 10 ilave bir şişe adım 9.1 ve 10.1 (LFB adlandırılan bu şişeden sindirilmiş çözelti) hazırlanmıştır Seviye 7 ICPMS ya CVAAS metal standardı, 5 ml ilave DW ml (Bu şişeye sindirilen çözeltisi LRB olarak adlandırılır).
11. Mikrodalga sindirim damar kapakları yeniden şekillendirme ve sıkıca şişeleri kapatın.
12. Konsantre edilerek eser metal dereceli nitrik asit 7 ml ve her bir şişeye 3 ml hidrojen peroksit ekleyin. Yavaşça çözüm dönen tarafından içeriğini homojenize. (Tablo 5'te örnek sindirim için mikrodalga sindirim parametreleri kullanmak) adımları 7,4-7,7 tekrarlayarak flakon içeriğini Digest.
13. Artan iyileşme DW gemiler durulama, 25 ml volümetrik şişeye sindirilen örnek ekleyin. DW ile ölçülü balona doldurunİşaretlemek.
14. Transfer şapkalı kap örnekleri sindirmek. Analiz tamamlanana kadar 4 ° C'de örnekleri korur. Bu çalışmada analiz için Hg ve diğer elemanlar için üç gün içinde aynı gün yapılır.

8. Kalite Kontrol (QC) Örnekleri

Not: Deneysel örneklerden sonuçların güvenilirliğini sağlamak amacıyla QC örnekleri analiz edin.

1. Kısmen DW ile 1 L hacimsel şişesi durulanır bir asit doldurun. (Bu çözüm de boş bir çözüm olarak adlandırılır) konsantre iz metal dereceli nitrik asit 280 ml ekleyin ve iyice karıştırın (DİKKAT: Her zaman ekzotermik reaksiyon şiddetli olabilir gibi asit su ekleyin, suya asit asla ekleyin). Oda sıcaklığına soğutun çözelti olsun.
2. Adım 7.9 ve 7.10 hazırlanan kalite kontrol örnekleri ek olarak aşağıdaki QC örnekleri hazırlanır.
   1. Devam kalibrasyon doğrulama (CCV) için: bkz hazırlanması için kalibrasyon standardı ile bir polistiren tüp (Filladım 9.2 ve 10.1). CVAAS raf ve ICPMS ICPMS alıcısı içinde standart çözüm üzerinde Hg standart solüsyonu koyun.
   2. Ve devam eden kalibrasyon boş (CCB) için: Boş (adım 8.1) içinde hazırlanan solüsyon iki polistiren tüpler (16 mi) doldurun. Bir CVAAS rafa örnek ve ICPMS otomatik numune alıcı diğer örnek yerleştirin.
   3. Laboratuvar güçlendirilmiş matriks (LFM) için: rasgele numune her tür (örneğin, biyokütle veya orta) için her 12 numune 1 örnek seçin ve bir LFM hazırlamak için kullanabilirsiniz. ICPMS, bir polistiren tüp ICPMS standart seviyede 7 ve (biyokütle ya da ortam ya da gelen) ile sindirilmiş deney örneği 3 ml, 0.5 ml ilave ediniz.
   4. Içeriğini karıştırın ve ICPMS otomatik numune üzerinde şişeleri yerleştirin. CVAAS için bir polistiren tüp 2 ml Hg standart Seviye 7 ve (biyokütle veya orta birinden) sindirilmiş deneysel örnek 6 ml ekleyin. CVAAS rafa içeriği ve yeri şişeleri karıştırın.
   5. Yinelenen örnekler için: Rastgele şimdiye kadar 1 örnek seçinmatrisin her türü için 12 numune y (örneğin, biyo-kütle, orta LFM veya seyreltilmiş matris) ve flakon çoğaltmak için kullanılır. ICPMS otomatik numune alıcı ve CVAAS rafa tekrar şişeleri yerleştirin.
   6. Kopya örnekler için: Rasgele matris (örneğin, biyo-kütle, orta, LFM veya seyreltilmiş matris) her bir tipi için, her 12 örneklerinin 1. örnek seçmek ve şişe çoğaltmak için kullanılır. ICPMS otomatik numune alıcı ve CVAAS rafa tekrar şişeleri yerleştirin.
3. Çalışmada veri kalite kriterlerini tanımlayın. Bu çalışmada için Eaton, Clesceri, Rice ve Greenberg ²⁵ tarafından kurulan kalite kriterlerini çoğaltmak. QC kurulan parametreler şunlardır: ±% 10 ²⁵ ± 70-130% ²⁵ içinde, LFB yüzde kurtarma (% R) (Pb ve Sb, tartışma bakın hariç), LFM yüzde dahilinde CCV için yüzde farkı (% D) kurtarma (% R) 75-125% ²⁵ içinde, ve göreli yüzde farkı (RPD) ±% 20 ²⁵ içinde ve sürekli cayöntem raporlama limiti (MRL) ^{25 yaş altı} libration boş (CCB). Adım 9.7 hesaplama denklemleri bakın.

Plazma Kütle Spektrometresi Coupled İndüktif tarafından 9. Kantitasyonu (ICPMS)

1. Analiz gününde, polistiren tüpler için yaklaşık 5 mi sindirilmiş numunenin transferi ve ICPMS otomatik numune alıcı koyun. Polistiren tüplere sindirilmiş numune yaklaşık 15 ml ilave edilir ve CVAAS rafa yerleştirin.
2. Analiz aynı gün kalibrasyon standartları hazırlamak. Satın alınan ICPMS standart solüsyonu ilave edin ve Tablo 6'da tarif edildiği gibi boş (adım 8.1) içinde hazırlanan solüsyon ile doldurmak asit durulanmıştır volumetrik balonlara (malzeme Tablo l'de standart çözelti açıklamasına bakınız).

Parametre	Seviye 1	Seviye 2	Seviye 3	Seviye 4	Seviye 5	Seviye 6	Seviye 7
Satın alınan standart eklenecek (ml)	-	-	-	-	-	-	10.0
Seviye 7 eklenecek (mi)	0.0	1.0	2.5	5.0	20.0	25.0	-
Nihai hacim * (ml)	-	50.0	50.0	50.0	100.0	50.0	100.0
Nihai konsantrasyon (ug / L),
75 As	0.0	2.0	5.0	10.0	20.0	50.0	1000,0
111 Cd	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25.0	50.0
59 Co	0.0	10.0	25.0	50.0	100.0	250.0	500.0
52 Cr	0.0	2.0	5.0	10.0	20.0	50.0	100.0
63 Cu	0.0	5.0	12.5	25.0	50.0	125.0	250.0
55 Mn	0.0	3,0	7.5	15.0	30.0	75.0	150.0
60 Ni	0.0	8	20.0	40.0	80.0	200.0	400.0
208 Pb	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25.0	50.0
121 Sb	0.0	12.0	30.0	60.0	120.0	300.0	600.0
51 V	0.0	10.0	25.0	50.0	100.0	250.0	500.0
66 Zn	0.0	4,0	10.0	20.0	40.0	100.0	200.0
* Aşama 8.1 hazırlanan çözeltisi ilave edilerek, bu hacim elde

Tablo 6: Kalibrasyon standartlarının Yoğunlaşma 7 Düzeyleri 1..

3. ICPMS gelen kozalakları çıkarın ve DW 1 dakika onları sonikasyon. Kozalakları kurutun ve enstrüman onları geri koydu.
4. Su soğutucu açın, gazlar (Ar, H ₂ O), ICPMS, iç standart fiş hatları ve otomatik numune kapları doldurmak durulama (DW,% 10 nitrik asit,% 1 nitrik asit +% 0.5 hidroklorik asit) .
5. Tablo 7 parametrelere ayarlanmış yöntem Masshunter Workstation yazılımını açın ve plazma, melodi ICPMS açmak ve yükleyin.

Parametreler	Değerler
İç standartlar	72 Ge, 115,
Rf güç	1.500 W
Plazma gaz akış hızı	14.98
Nebülizatör gaz akış hızı	1.1 L / dk (taşıyıcı ve seyreltme gaz kombine - 0.6 + 0.5 L / dk)
Örnekleme konisi	X lens Nikel
Kevgir koni	Nikel
Örnek alım oranı	0.3 rps
Nebulizatör pompa	0.1 rps
S / C sıcaklık	2 ° C
Tarama koşulu	Süresi 1 sn, tekrarında 3 sayısını Dwell
H2 gaz akımı	N / A
O gaz akışı	4.3 ml / dak

Tablo 7: ICPMS çalışma koşulları.

6. Alıcısı içinde kalibrasyon standardı, QC örnekleri ve deneysel örnekleri yerleştirin. ICPMS yazılımında analiz dizisi eklemek ve örnekleri analiz eder. Elementler iyonize plazmaya enstrümanın içindeki örnek aspire. Sonra bir vakum bir sayaca iyonlarını çeker. iyonlar hafif gelen ağır onların atom ağırlığına bağlı olarak ayıracaktır.
   DİKKAT: Tehlikeli muhafaza içinde ICPMS atık toplamak ve bertaraf için uygun anlaştım.
7. Her bir metal ya da metalsi için kalibrasyon eğrisi için korelasyon katsayısı (r) değeri 0,995 ²⁴ daha büyük olduğundan emin olun.
8. 6 ^{ila 26} denklem 3'te tarif edildiği gibi örnek analizi sırasında,% R,% D ve RPD hesaplamak ve 8.3 proje veri kalitesi kriterlerine sonuçları karşılaştırın.
   1. Yüzde kurtarma (% R) Laboratuvar müstahkem bla dan kazanıyor / zararları belirlemek için hesaplayınlaboratuvar güçlendirilmiş matriks (LFM) den nk (LFB) ve matris girişim.

2. CCV örnekleri çalıştırırken zamanla enstrüman performans değişiklikleri belirlemek için yüzde farkını (% D) hesaplayın.

3. Deneysel örnekleri çalıştırırken zamanla yöntem hassas değişiklikleri belirlemek için bağıl yüzde farkını (RPD) hesaplayın.

9. 3 (örnek: DW) matris girişimi (kabul edilebilir aralığın dışında% R) azaltmak için, bir oranı 1 zayıf% R örnekleri sulandırmak.

10. Soğuk Buhar Atomik Absorpsiyon spektrofotometresiyle Hg miktar (CVAAS)

1. Kalibrasyon standartları analiz aynı gün hazırlayın. Bir 100 ml'lik volümetrik bir şişeye satın Hg, standart çözeltinin 1 ml ilave satın Hg standart seyreltilir ve aşama 8.1 'de hazırlanmış solüsyon ile doldurun.
   1. (Bu yeni çözüm Seviye 7 Hg standart), 100 ml hacminde bir şişeye Bu çözeltiye 2.5 ml ilave edilir ve aşama 8.1 'de hazırlanmış solüsyon ile doldurun. Hacimsel şişelere seyreltilmiş Seviye 7 Hg standardını ekleyin ve boş ile doldurun (adım 8.1 hazırlanan solüsyon.) Tablo 8 (Malzeme Tablo satın Hg standart çözeltisi açıklamasına bakınız) açıklandığı gibi.

Parametre	Seviye 1	Seviye 2	Seviye 3	Seviye 4	Seviye 5	Seviye 6
L7 Hg standart eklenecek (ml)	0	1	2.5	5	20	25
Nihai hacim * (ml)	-	50	50	50	100	50
Nihai konsantrasyon (ug / L),	0	0.5	1.25	2.5	5	12.5
* Aşama 8.1 hazırlanan çözeltisi ilave edilerek, bu hacim elde

Tablo 8: Hg kalibrasyon standardının Konsantrasyon 6 Düzeyleri 1..

2. Ar gaz ve hava vanasını açın, Atom absorbsiyometri açmakyon Spektrofotometre ve Akış Enjeksiyon Atomik Spektroskopi (FIAS). , CVAAS Winlab yazılımını açın Hg lambasını açmak ve yazılımın enerji parametresi 79. yükleyin Tablo 9'da parametrelerle Hg analizi için bir program erişene kadar ısınmasını bekleyin. Maksimum geçirgenlik vermek için enstrüman ışık yolu ayarlayın.

Parametreler	Değerler
Taşıyıcı gaz	Argon, 100 ml / dakika
Lamba	Hg electrodeless deşarj lambası, 185 mA kurulum
Dalga boyu	253.7 nm
Yarık	0.7 nm
Hücre sıcaklığı	100 ° C
Numune hacmi	500 ul
Taşıyıcı	% 3 HCI, 9.23 ml / dakika
Indirgeyici	% 10 SnCl2, 5.31 ml / dakika
Ölçüm	Tepe yükseklik
Çoğaltır Oku	3

Tablo 9: CVAAS çalışma koşulları.

3. % 3 eser metal dereceli hidroklorik asit yapılmış taşıyıcı çözümüne hattını takın.
4. % 3 eser metal derecesi, hidroklorik asit (Hg analizi için uygun olan)% 10 kalay klorür yapılan indirgeyici madde çözeltisine çizgiyi takın. Atmosferik oksidasyona eğilimli olduğu gibi bu çözüme analizinin aynı gün hazırlayın (DİKKAT: Kalay klorür çok tehlikeli olduğunu onunla çalışırken koruyucu aşınma kullanmak tehlikeli muhafaza içinde CVAAS atık toplamak ve düzgün atmayın.).
5. CVAAS Winlab yazılımında CVAAS raf ve giriş sırası Hg standartları, QC örnekleri ve deneysel örnekleri yerleştirin. Standartlar çalıştırın ve kalibrasyon denklemini oluşturmak.
6. Run QC samPles ve deneysel örnekler. CVAAS aracı haline numunenin yaklaşık olarak 5 ml çizer elemental Hg (Hg ⁰⁾ gaz numune Hg mevcut azaltır ve kapalı bir sistem içerisinde bir taşıyıcı gaz (Ar) ile çözelti gaz temizler. Hg buharı Hg lamba yolunda bir hücreye geçer. Bir detektör 253.7 nm'de absorbe ışığı belirler ve konsantrasyona ilişkilendirir. (DİKKAT: Hg buharı zehirlidir, enstrüman egzoz kaput yerinde olduğundan emin olun).
7. Analizi sırasında adımda 9.7% R,% D ve RPD hesaplayın ve proje veri kalitesi kriterlerine sonuçları karşılaştırın.

Sonuçlar

Biyokütle verimleri

N. üretimi salina Bu çalışmada kullanılan PBR sistemi içinde 8.5, 1 g / ^{L-1 ila} ± 0.19 g / ^{L-1 (n} = 12), kontrol reaktörleri ve 4.0 ± 0.3 g / ^{L-1 (n} = 12) büyümüştür Çoklu metal 7 gün içinde kirlenmiş. Deneyler üçlü reaktörler ve çoklu toplu genelinde tekrarlanabilir veriler üretti. Şekil 2A üç bağımsız PBRs numune dayalı çok küçük standart hata ile ortalama kültür yo...

Tartışmalar

Tuzlu mikroalg N. salina başarıyla tekrarlanabilir sonuçlar ve yüksek biyokütle verimleri ile tasarlanmış büyüme sisteminde yetiştirilen olabilir. Hava İkmal 7 gün büyüme dönemleri boyunca en az hesaplaşmanın veya biyolojik kirliliğe ile iyi karma askıya kültür için izin karıştırma. Floresan ışık banka genelinde minimum ışık değişkenliği de büyüme fark farklılıkları üretmek değil gösterilmektedir.

Çalışma ağır metal kömür baca gazı o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate	Fisher Scientific	S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
Potassium nitrate	EMD Chemical	PX1520-5
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Ammonium ferric citrate	Fisher Scientific	I72-500
Boric acid	Fisher Scientific	A73-500
Sodium molybdate, dihydrate	EMD Chemical	SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	C489-500
Biotin	Acros Organics	230090010
Thiamine	Acros Organics	148990100
Vitamin B12	Acros Organics	405920010
Copper (II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	221783-100G	Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride	Sigma-Aldrich	268690-250G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate	Sigma-Aldrich	398063-100G	Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	223387-500G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite	Sigma-Aldrich	71287	Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908-10G	Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride	Sigma-Aldrich	215465-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate	Fisher Scientific	T142-500	Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Vanadium (V) oxide	Acros Organics	206422500	Dangerous to the Environment
Carbon dioxide	Air Liquide	I2301S-1	Compressed
Hydrogen peroxide	H325-500	Fisher Scientific	30% in water
ICP-MS standard	ICP-MS-6020	High Purity Standards
Mercury standard	CGHG1-1	Inorganic Ventures	1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon	Air Liquide		Compressed
Helium	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Hydrogen	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Nitric acid	Fisher Scientific	A509-P212	67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A508-P212	35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer	Steris	31626A	SV-120
Centrifuge	Thermo Fisher	46910	RC-6 Plus
Spectrophotometer	Shimadzu	1867	UV-1800
pH controller	Hanna	BL981411	X4
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-151-SSV	T31Y
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-26-SSV	T35Y
Water bath circulator	Fisher Scientific	13-873-45A
Compact chiller	VWR	13270-120
Freeze dryer	Labconco	7752020
Stir plate	Fisher Scientific	11-100-49S
pH lab electrode	Phidgets Inc	3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer	Agilent Technologies	7700 Series ICP-MS	Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100	Perkin Elmer Instruments	B0506520
Atomic absorption spectrometer	Perkin Elmer Instruments	AAnalyst 800
Cell heater (quartz)	Perkin Elmer Instruments	B3120397
Microwave	Milestone		Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor	Milestone		Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-0425
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-1650
0.45 μm syringe filter	Thermo Fisher	F2500-3
Polystyrene tubes	Evergreen	222-2094-050	17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars	Fisher scientific	14-513-60	Magnets encased in PTFE fluoropolymer