Basit ve Bilgisayar destekli Fareler için Koku Testi

Özet

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Özet

Koklama yüksek türler arasında muhafaza edilir ve üreme ve hayatta kalma için gereklidir.

İnsanlarda, olfaction da yaşlanma ile etkilenir duyu biridir ve nörodejeneratif hastalıkların güçlü bir belirleyicisidir. Böylece, olfaction testi erken nörolojik açıklarının tespit etmek için bir non-invaziv tanı yöntemi olarak kullanılmaktadır. Koku ağ duyarlılık altında yatan mekanizmaları anlamak için, kemirgenlerde koku araştırmalar son on yılda ivme kazanmıştır.

Burada, biz önceden yiyecek veya su kısıtlaması gerek kalmadan farelerde doğuştan koku algısı ve duyarlılık çok basit, zaman verimli ve tekrarlanabilir koku test yöntemi sunuyoruz. Testler farelere tanıdık bir ortamda gerçekleştirilir, kokular ve odorant maruz kalma 2 dk oturumu sadece gerektirir. Analiz ImageJ bilgisayar destekli komutları kullanarak, post-hoc yapılır ve bu nedenle olabilirBir araştırmacı tarafından başından sonuna kadar yürüttü.

Bu protokol, herhangi bir özel donanım veya kurulum gerektirmez ve koku algı ve hassasiyeti test ilgilenen herhangi bir laboratuvar endikedir.

Giriş

Olfaction memelilerde en gelişmiş ve önemli duyu işlevlerinden biridir. Koku aktivitede herhangi bir değer düşüklüğü kötü durum senaryosu gıda alımını, sosyal davranış ve hatta hayatta kalma etkileyebilir. İnsanlarda, koku bozulma ¹ bağımlı yaş ve nörolojik bozukluklar ² güçlü bir belirleyicisi olarak kabul edilir ^{- 6.} Pennsylvania Üniversitesi tarafından geliştirilen koku kimlik testi şu anda erken nörolojik defisit ⁷ değerlendirmek ve yüksek olasılıkla demans ^8,9 ilerlemesini tahmin edebilirsiniz en çok kullanılan non-invaziv ve ölçülebilir, tanısal testlerin birini temsil eder.

koku alma sistemi ve kemirgenler koku duyusunun öne erişilebilirlik, altında yatan mekanizmaları koku fonksiyonları ¹⁰ adresleme araştırma yoğun bir çizgi yol açtı. Daha önce sinyal alınmasından fonksiyon kaybının göstermiştirya Notch1 koku kaçınma ¹¹ etkiler. Bu protokolde koku performansı incelemek için nöronların veya glia sinyalizasyon ligandı, Jagged1 eksik fareler, kullanın.

Doğuştan koku alma algısı olarak üç parametre, koku ve koku hassasiyeti ⁴ arasındaki ayrım olarak tanımlanır. Kemirgenlerde Koku kontrol çeşitli şekillerde yapılabilir ve bazı davranış çalışmalarda belli bir buhar konsantrasyonlarda ve hassas bir zaman dilimi ¹² hayvana bir kokunun sağlanması olfactometers yararlanabilirler ^{- 14.} Bununla birlikte, bu enstrümantasyon pahalı ve sadece uzman tesislerde mevcut olabilir. Bizim çalışmamızda, uçucu koku kullanılarak gerçekleştirilen bir basit, hızlı ve yeniden üretilebilir bir koku test protokolü, sağlar. testler cezbedici veya itici koku tedbir algısını açıklanan ve koku ve su ^11,15,16 arasındaki ayrımcılığı değerlendirir. W, aynı kurulumu kullanarake farklı konsantrasyonlarda ^16,17 bir koku hassasiyeti ölçebilirsiniz. Page ve arkadaşları ¹⁸ çalışmalarından esinlenerek post-hoc bilgisayar destekli görüntü işleme, deneysel Körlemenin ve tüm deneyi yürütmek için bir tek kişi için izin gerek kalmadan tarafsız sonuçlar sağlar.

Bu protokol, farelerde koku alma davranışı incelemek için bir başlangıç ​​noktası sağlamak için tasarlanmıştır.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması konusunda AB Direktifi 2010/63 / AB ile uyumlu olan ve (Canton of Fribourg, İsviçre) yerel Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlanması

1. Deney hayvanları
   1. Yetişkin erkek vahşi tip ve yaş 3-5 ay transgenik farelerin (C57BL / 6 background) üzerinde deneyler yapın. farelerin üç grup vahşi tip yavru kontroller karşılık (grup A, Jagged1 flox / flox ¹⁹⁾ ve iki koşullu KO fare hatları (B grubu, Jagged1ncKO ve C, Jagged1gcKO).
   2. 12 saat kontrollü aydınlık / karanlık döngüsü ile havalandırılmış bir odada standart laboratuvar koşullarında Ev fareleri, ve yiyecek ve su ad libitum sağlar.

2. Deneysel Kurulum

1. Deneysel arena
   1. Deneysel arenada için, temiz bir steril fare kafesini kullanın (36 cm uzunluk x 20,5 cm genişlik x 13.5 cm yükseklik) (Şekil 1A).
   2. 3 cm yüksekliğinde taze yatak, bir numaralı kafes her fare atayın. Kafesleri yeniden ise, koku hassasiyeti testinde olduğu gibi, koku ve fareler arasında çapraz bulaşmayı önlemek için aşağıdaki önlemleri alacaktır.
      1. Su tarafı işaretleyin.
      2. % 70 etanol, her tarafı için biri ile püskürtülür iki doku kağıtları ile kafesleri dar duvarları temizleyin.
      3. Farelerin genotip göre kafesleri yığmak ve laminar kaputun altında geçici olarak saklamak.
2. Kamera
   1. Kafes (Şekil 1A) altından 58 cm amacı ile özel bir tripod üzerinde kamera monte edin. Tripod ve kafesin konumunu düzeltmek ve kamera kafesinin üst merkezli olması için izin vermek için işaretleriyle sınırlandırmak.
   2. X 240 piksel, MOV dosyaları olarak saniyede 15.08 kare 320 piksel Video kaydetme.
3. Kokular
   1. Scen yeniden süspansebelirtilmedikçe, TH, bir çözücü içinde ki bu çözünürdür.
   2. Tercih testi kullanım fıstık ezmesi için. Yer fıstığı yağı, fıstık yağı (ağ / hac% 10) yeniden süspanse edin.
   3. Kaçınma testi kullanımı saf 2-metilbutirik (2 MB) asit (% 98) için.
   4. Duyarlılık testi için, aynı fare kolonisi ve arka plan (C57BL / 6) kadın idrar kullanın.
      1. Kolaylık sağlamak için koku testi 1-2 gün önce idrar toplamak. Dizginlemek ve kafes ızgara üzerinde karnı ile kaputun altındaki fareyi tutun. Kafes ızgara altında idrar damla toplamak için plastik bir petri yerleştirin.
      2. 1.5 ml tüp içinde her kadın idrar toplayın ve hayvanlar arasındaki değişkenliği normalleştirmek için tüm idrar örnekleri karıştırın. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın.
      3. Deney gününde, idrar çözülmesi ve 10 bir seyreltme faktörü ile iki kere damıtılmış su içinde 4 seyreltileri, yerine (1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10,000).

3. Koku Testi

Not: Güçlü cezbedici (fıstık ezmesi ve kadın idrar) veya güçlü kovucu (2-MB asit) ¹⁵ olarak algılanmaktadır kasten seçilmiştir Bu protokol kokuları içinde. Bu koku davranışı ile herhangi bir müdahale olasılığını ortadan kaldırmak için kaçınma testi öncesinde keyifli kokulara tercih ve duyarlılık testleri yürütmek önemlidir. Bununla birlikte, bu kağıt, tercih ve kaçınma testinde basitlik, hem algı test altında açıklanacaktır. Her davranış oturumu alışma aşaması ile başlar.

1. Alışma Faz
   1. Temiz atanan kafeste hayvan koyun ve 5 dakika (Şekil 1B) için inceleyelim. Deneysel kafesin çevre evde kafes tanıdık olduğundan, bu kısa süre alışma izin vermek için yeterlidir.
   2. Duyarlılık testi bir günde tamamlanması durumunda, uygulamanıza önce sadece bir kez alışkanlık gerçekleştirmekEn yüksek sulandırılmış koku n. Duyarlılık testi farklı günlerde yapılır, her gün yeni bir temiz kafes bir alışma aşaması gereklidir.
2. Algı Testi
   1. Alışma sonra kamerayı etkinleştirmek ve hemen altındaki (Şekil 1C) yaklaşık 10 cm kafesin zıt duvarlarına hoş koku (fıstık ezmesi) 60 ul ve nötr koku (musluk suyu) 60 ul pipetle.
   2. Fare 2 dakika (Şekil 1D) için kokuları inceleyelim. Bundan sonra, fotoğraf makinesini kapatın.
   3. Bu noktada, bir sonraki fare alışkanlık aşamasından devam edin. Kovucu koku 60 ul (2-MB asit) ve su içinde 60 ul uygulanarak aynı şekilde tam olarak Uzak Durma testi gerçekleştirir.
3. Hassasiyet testi
   1. 1: aşağıdaki sırayla bir kadın idrar artan konsantrasyonlarda erkek farelerin gözde eşik değerlendirir 10,000; 1: 1,000; 1: 100; 1:10 ve saf idrarı.
   2. Alışma sonra, daha önce 3.2.1'de açıklandığı gibi deneyci tarafından pipetle yüksek seyreltme her fare maruz bırakmaktadır.
   3. Bir video kamerada 2 dk zaman diliminde, su karşı idrar keşif davranışlarını kaydedin. Tüm farenin kohort yüksek seyreltme (1: 10,000) açısından test edilir sonra, yukarıda belirtildiği gibi, idrar, daha yüksek bir konsantrasyona maruz kalmaktadır.

4. Post-hoc Veri Analizi

Not: açıklanan tüm davranış testleri veri analizi talimatları izleyerek post hoc işlenir.

1. Windows sistemler için ImageJ MOV dosyaları açın
   1. Http://www.apple.com/quicktime/download özelleştirilmiş ayarları kullanarak Java için Quick Time yükleyin.
   2. ImageJ sitesinde (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html) den Quick Time eklenti yüklemek.
   3. Kütüphane EXTENS içine: ( Program Files QuickTime QTSystem C) QTJava.zip İthalatImageJ iyon (.ImageJ jre lib ext).
   4. Plugins klasörüne kopyalayın de QTJava.zip ve QTJava.jar olarak yeniden adlandırın.
   5. Makro klasöründe bağlı altı komut takın (ImageJ plugins Makrolar).
   6. Açık ImageJ sonra yakın ImageJ derlemek ve Quick Time eklentisi çalıştırmak ve.
   7. Quick Time kullanarak> ImageJ yeniden açın ve Dosya> Al'ı kullanarak MOV dosyasını açın.
2. Video Ayar
   1. Video dosyası ImageJ açıldığında, deneyi kafes (T0) içine Koku moleküllerini pipetle olan zaman sabit bir 2 dakika keşif elde etmek için video kesti. (Yığınları ToolsSlice sökücü ImageJ Image) 1 artışlarını kullanarak önceki çerçeveleri T0 tekabül çerçeveyi belirlemek ve kaldırmak. 2 dk keşif aşan tüm kareleri silmek için aynı komutunu kullanın.
   2. Kafes merkezli olduğundan emin olun ve gerekli kullanım Image> Transform eğer> Döndür komutunu hizalamak için.
3. Bakınızo İşleme
   Not: video işleme tamamen bilgisayar destekli ve bu kağıdı eşlik eden makrolar komutları kullanır.
   1. 127 piksel x 218 piksel boyutu kafes üzerine alanını kısıtlamak amacıyla Plugin> Makrolar> Çalıştır komutu Adım 1 makroyu çalıştırın. Kafes (Şekil 2, Adım 1) üzerinde sabit bir dikdörtgen getirin.
   2. Adım 2 makro (Şekil 2, Adım 2) kullanılarak faiz (ROI) bölgede kafes alanını kırpın.
   3. Bir eşik sinyali atama despeckling ve sinyal değişimini filtreleyerek kökenli fare görüntüsünü çıkarmak için Adım 3 makro kullanın. Z ekseni arsa çıkış değerleri 2 dk keşif sırasında "su haznesinin" nin ROI içinde hareket fare gölge yoğunluğuna karşılık, ortalama gri değerlerini gösterir. Bir elektronik tablo dosyasına ROI (Şekil 2, Adım 3) 'e göre adlı bir çalışma sayfasına sonuçları kopyalayın.
   4. Adım 4 makro kullanınROI "koku odasına" fare ortalama gri değerleri ayıklamak. 4.3.3 aynı elektronik tablo dosyasındaki ROI (Şekil 2, Adım 4) 'e göre adlı bir çalışma sayfasına sonuçları kopyalayın.
   5. Daha fazla ROI "su çevre" fare hareketi analizi kısıtlamak amacıyla Adım 5 makro kullanın. 4.3.3 aynı elektronik tablo dosyasındaki ROI (Şekil 2, Adım 5) göre adlandırılır çalışma sayfası üzerine sonucunu kopyalayın.
   6. ROI "koku çevre" fare hareketi analizi kısıtlamak için Adım 6 makro kullanın. 4.3.3 gibi ROI elektronik tablo dosyası (Şekil 2, Adım 6) göre adlandırılır çalışma sayfası üzerine sonucunu kopyalayın.
   7. Tüm videoları işlemek ve hayvanların başına kare sayısını tutarlılık açısından kontrol edin. Burada, 2 dk keşif oturumuna gelen 1.810 kare için tüm hayvanları kayıt.
   8. Her bir hayvan için ve sıralama çerçeveleri ortalama gri va her ROI içinlues büyük 0. Divide daha değerlere göre kare sayısı 1 saniye tekabül ve her ROI harcanan saniye edinin.

5. İstatistiksel Analiz

1. Her test için http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/ bulunan formülü kullanarak Bartlett testi ile gruplar / genotipleri içinde varyans homojenliği doğrulayın.
2. Zaman Bartlett testi sonuçlarına bağlı olarak eşit veya eşitsiz varyansları varsayarak bir yönsüz Student t-testi kullanılarak tek grup içindeki koku karşı su ile harcanan arasında cazibe ve kaçınma testinde, karşılaştırmalar yürütmek. Bonferroni post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile genotipler arasındaki su ile harcanan zaman çıkarılır kokuları ile harcanan süreleri karşılaştırın.
3. Duyarlılık testinde Wate ile harcanan zaman çıkarılır koku ile harcanan zaman karşılaştırmalar analizBonferroni post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile idrar belirli bir seyreltilerde gruplar arasında r. Bonferroni post-hoc testi ile tekrarlı 2-Yönlü ANOVA büyüyen koku konsantrasyonları gruplar arasında duyarlılık karşılaştırın.
4. Cazibe ve kaçınma testinde genotipleri ve tedaviler arasındaki etkileşim Bonferroni post-hoc testi ile 2 yollu ANOVA ile incelenmiştir.

Sonuçlar

algı testi 2-MB asit fıstık ezmesi ve kaçınma için cazibe ölçer. Farelerin üç grup test edilir ve su ile karşılaştırıldığında "koku çevre" harcanan zaman ölçülür. Su (t ₈ = 2.52, p <0.05) ile karşılaştırıldığında tercih testte, kontrol grubu ve bir koku önemli tercih gösterir. Öte yandan, B grubu fıstık ezmesi önemli cazibe görünmüyor ve su (t ₆ = 3.22, p <0.05) daha fazla zaman harcıyor. Böylece, kontrol grubu A (F _1,7 = 26,39, p...

Tartışmalar

kokulara karşı algısını, kokulara, su ve duyarlılık karşısında kokular arasındaki ayrım: Bu protokol önerilen testler farelerde doğuştan koku davranış farklı yönlerini değerlendirmek için izin verir. Bu protokol daha önce ¹⁵ gösterilen tercih ve kaçınma ölçeğine göre herhangi bir koku uygulanabilir. Protokol keşif faaliyeti dayalı yana fareler kendi hareketini etkileyecek ve koku keşif engel olabilir herhangi bir motor bozukluğu ya da kaygı görüntü yok önemlidir. tarif ed...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis