Değerlendirilmesi Hücre Mechanosensing ve Durotaxis için Basitleştirilmiş Sistemi<em&gt; İn Vitro</em

Özet

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

Özet

Ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mekanik özellikleri, doku tipleri arasında oldukça değişkendir. Bu bağ dokusu stroma ölçüde çeşitlilik etkileri, hücre davranış hücre çoğalması, farklılaşması, yapışma sinyalizasyon ve yön göç de dahil olmak üzere, normal ve patolojik süreçleri düzenler. Bu bağlamda, bazı hücre tiplerinin doğal yeteneğini durotaxis olarak ifade edilir, bir katı ya da daha az uyumlu bir matriks substrat tabakasına doğru göç. Bu olgu, embriyonik gelişim, yara iyileşmesi ve kanser hücresi yayılımını tamamen sırasında önemli bir rol oynar. Burada, polidimetilsiloksan (PDMS) alt tabakalar kullanarak, in vitro olarak durotaxis çalışma için basit bir deney tarif eder. Odaları durotaxis tarif hazırlanması nispeten yumuşak PDMS jel ve katı bir cam lamel arasında bir sertlik arabirimi oluşturur. Verilen örnekte, cdc42 bir rol göstermek için bu durotaxis odaları kullandık / Rac1 GTPaz aktive protecdGAP bölgesi, mechanosensing ve insan U2OS osteosarkoma hücrelerinde durotaxis düzenlenmesinde. Bu deney, mechanosignaling ve durotaxis bunların rollerini araştırmak için başka hücre tipleri ve / veya önemli diğer proteinlerin demonte kolaylıkla uyarlanabilir.

Giriş

Hücre dışı matris (ECM), kolajen, fibronektin ve laminin gibi yapısal ve çapraz bağlama proteinlerinin karmaşık bir dizi oluşur. De ECM hücre dokular için önemli bir yapısal destek sağlar tespit edilmesine rağmen, hücreler aktif olarak, hücre hayatta kalması, farklılaşma ve hücre göçü de dahil olmak üzere çok çeşitli hücresel işlemleri düzenleyen kendi ECM ortamında fiziksel değişikliklere yanıt olduğunu belirtmek için artan kanıtlar vardır. Sert (~ 25 kPa) yüzeyler osteojenik farklılaşma ¹ teşvik Örneğin, ECM sertlik farklılıklar yumuşak yüzeylerde (~ 1 kPa) nörojenik soy teşvik ile, farklı soy karşı mezenkimal kök hücrelerin sürebilirim. Benzer şekilde, stromal matrisi katılıkta bir artış çevre doku ^2,3 halinde meme epitelyal hücre tümörogenez ve işgali teşvik ettiği gösterilmiştir.

Bu mechanosign için özellikle ilginç bir yönüHücreler daha sert bir alt-tabaka ^4,5 doğru tercihli olarak göç ettiği durotaxis olarak bilinen bir işlemde aling etki gösterir. Hücreler sürekli ECM bağlanarak integrin reseptörü yoluyla hücre dışı ortamın fiziksel özelliklerini hissederler. Bu da, fokal yapışmalarda ve fokal temas ^6,7 olarak bilinen yapıştırma yapıların oluşumunu sürücü sitoplazmik alanlarında çok sayıda yapısal ve sinyal proteinlerinin birikimi teşvik eder. Integrinlerinin hiçbir doğasında enzimatik aktiviteye sahip olduğundan, sinyaller değişen çevre ⁸ hücrenin yanıtı koordine etmek, bu aksesuar proteinleri aracılığıyla ECM'den aktarılmaktadır. Buna göre, mechanosignaling ve durotaxis düzenleyen kilit rol oynayan proteinlerin belirlenmesi ve karakterizasyonu araştırılması gereken önemli bir alandır.

Çeşitli model sistemler durotaxis in vitro incelemek için geliştirilmiştir, ancak çoğu varkullanılan kollajen kaplı poliakrilamid yüzeyler ^4. Bununla birlikte, poliakrilamid substratlar hazırlanması teknik olarak zor olabilir ve bu deneylerde kullanılan kollajen alt-tabaka ⁹ kimyasal olarak çapraz bağlanmış olması gerekir. Polidimetilsiloksan (PDMS) alt-tabakalar poliakrilamid alt tabakalar ¹⁰ için karşılaştırılabilir mekanik özellikler göstermektedir gösterilmiştir. Bununla birlikte, alt-tabakalar, sadece çapraz bağlayıcı madde PDMS bazın bir karıştırma oranı ile hazırlanabilir ve bu alt-tabakalar bu şekilde PDMS hücre davranışı üzerindeki sertlik etkilerini incelemek için daha kolay bir araç yapan kimyasal çapraz bağlama için gerek kalmadan ECM proteinleri ile kaplanabilir. Bu yazıda, yumuşak bir PDMS substrat sert cam lamel ile entegre edildiği bir basit durotaxis odasını nasıl hazırlanacağını açıklar.

Deney aşağıda açıklandığı gibi, durotaxis incelemek için hızlı ve basit bir yöntem temin etmektedir. Bu çalışma için siRNA aracılı ile birlikte, insan osteosarkoma hücreleri kullanılır U2OScdGAP demonte durotaxis ¹¹ bu fokal yapışma proteininin rolünü araştırmak için. Önemli olarak, bu protokol, kolaylıkla kişisel gereksinimlere uyarlanabilir. Diğer hücre tipleri U2OS hücreleri için ikame edilebilir ve herhangi bir protein düşürülmüş olup durotaxis sırasında hücre davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek için aşırı ifade edilebilir. Ayrıca, bu protokol dinamiklerini ve davranışları kullanılarak sıkı bağlamak ya da yaklaşımlar FRET analizi, floresan etiketli proteinler dahil adapte edilebilir.

Protokol

Durotaxis Chambers hazırlanması 1.

1. Bir 6-yuvalı doku kültürü plakası hazırlanması için, 50 ml konik tüp ile denge dara. 50-ml tüp PDMS baz çözeltisi yaklaşık 10 gr tartılır (çözüm oldukça viskoz).
2. 90: 1 substrat (~ 1 kPa Uyum), gerekli çapraz bağlayıcı çözeltisinin doğru miktarını belirlemek için 90 ile tüp içinde PDMS baz çözeltisi ölçülen kilo bölün. Aynı tüp PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi hesaplanan miktar ekleyin.
   Örnek: 10 g / 90 = 0.11 g. PDMS baz çözeltisine PDMS çapraz bağlayıcı çözeltisi 0.11 g ekleyin.
   NOT: Baz ve çapraz bağlayıcı çözümleri hem PDMS kit sağlanmaktadır.
3. Şiddetle küçük bir spatula kullanılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PDMS baz / çapraz bağlayıcı karışımı karıştırın. Bu aşamada kanşım hava kabarcıkları çok sayıda içerir.
4. Bub çıkarmak için oda sıcaklığında 50 x g'de 5 dakika boyunca, bir tezgah üstü santrifüj içinde PDMS substratı santrifüjbles. Varsa hala tekrar 5 dakika, santrifüj sonra kabarcıklar.
5. 90 pipetle 1 ml: Doku kültürü her oyuğuna 1 PDMS alt-tabaka 6 oyuklu plaka işlemden geçirildi. PDMS mevcut olan herhangi bir geri kalan hava kabarcıkları, bir 21 G iğnesi kullanılarak bunları haşhaş bu aşamada elimine edilebilir. PDMS oyuk 30 dakika boyunca yaymak için izin verir.
6. Kaynama 12 mm cam # 5 dakika için damıtılmış su içinde 1 lamelleri. Iki kez tekrarlanır ve damıtılmış su içinde lamelleri saklayın.
7. Yavaşça PDMS üzerine lamel damla PDMS çözeltisi içine lamel bir tarafını dokunarak doku kültür plakasının her bir oyuğuna, bir kurutulmuş, lamel yerleştirin. Lamel yerleşir gibi, PDMS lamel kenarları boyunca tecâvüz başlayacak, ama tamamen kapsayacak olmaz. Bu (B Şekil 1A bakınız) sertleştikten sonra PDMS ve cam arasında bir arayüz oluşturur.
8. PDMS tedavi (sertleşmesine) 16 saat için bir fırın içinde 70 ° C 'de plaka inkübe edin. Plat yerleştirinBir hücre kültürü kaputu ve UV e 10 dakika süreyle sterilize edin.
   NOT: Bu kullanım bir kaç gün içinde plakaları yapmak en iyisidir. Bununla birlikte, levha Herhangi bir tampon maddesi olmadan Parafilm ile sarılmış ve kalitede herhangi bir fark azalma olmadan, 2 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

2. Hücre Ekimi

NOT: siRNA aracılı demonte etkisini inceleyerek varsa, üreticinin talimatlarına veya seçim hücre tipi için optimize edilmiş protokolü kullanılarak demonte gerçekleştirin.

1. Kaplama, her 37 ° C 'de 1 saat süre ile, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın / ml fibronektin PBS içinde 10 ug 1 ml bölmeyi durotaxis. Seçenek olarak ise, fibronektin, 4 ° C'de 16 saat boyunca / ml fibronektin PBS içinde 10 ug PDMS inkübe ile analizden önce gün tatbik edilebilir. Tüm yüzey PBS çözüm fibronektin batmış olduğundan emin olun.
2. Isı ile denatüre edilmiş,% 1 BSA hazırlayın. 0,5 g BSA tartılır ve 50 ml PBS içinde çözülür.Filtre 12 dakika boyunca 80 ° C 'de, 0.22 um'lik bir filtreden ve ısı yoluyla çözüm sterilize edin.
   Not: Bu çözüme 4 ° C'de kaplama ve mağaza hücre öncesinde güne hazırlayın.
3. Fibronektin solüsyonu aspire edildi ve PBS ile 3 kez yıkayın. Her bir oyuğa, PBS içinde ısı ile denatüre BSA 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
4. Durotaxis odaları ısı denatüre BSA ile bloke ederken Trypsinize ve seçim hücreleri saymak.
5. Levha seçim, belirli bir hücre tipi için gerekli ortam kullanılarak durotaxis bölmesinin her bir kuyunun içine 2 ml lik bir hacim içinde, 1 x 10 ⁵ hücre. Hücreler uygun ve% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 4 saat süre ile alt-tabaka üzerinde yayılmasına izin verir.
   Not: U2OS hücreleri rutin 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 10 lU / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş,% 10 FBS bulunan DMEM içerisinde muhafaza edilir.
   NOT: Bu örnekte kullanılan hücre sayısı için optimize edilmiştirU2OS hücreleri. Diğer hücre türleri için optimizasyon gerekebilir. Bu yoğunluk hücreleri, diğer hücrelerle önemli etkileşimler olmadan geçirmek için yeterli oda verir.

3. Canlı hücre Görüntüleme

1. 10X amacı ile faz kontrast kullanarak, ters bir mikroskop canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Mikroskop, uzun vadeli görüntüleme sırasında 37 ° C sıcaklığın kontrol edilmesi ve% 5 _CO2 sağlayan kapalı bir çevre, nemli bir bölmede ile donatılmış olmalıdır.
2. Hücreler yaklaşık 3.5 saat boyunca yayıldı sonra, mikroskop odasında plaka monte edin. Örnek (ler) 30 dakika boyunca oda içinde dengelenmeye bırakın.
3. Varsa mikroskop ziyaret otomatik, çok noktalı ayarlayın. 90 arasındaki arayüze odaklanın: 1 PDMS ve cam lamel ve tüm durotaxis odasına başına 40 sayılık bir ortalama ile arayüzü etrafında görüntü noktaları seçin. Resim hücreleri kadar 16 saat boyunca her 10 dakikada bir.
   NOT: Yenidenilgi gion lamel kenarı ve PDMS ve kapak arasında fiili bir arayüz karşılık gelen iç hat karşılık gelen dış hat ile, iki çizgi olarak görünür. Şekil 1B bakınız.

4. Veri Analizi

1. Tablo 1 deki gibi bir elektronik tablo oluşturur.
2. Üretilen her film cam yüzey ve tersi PDMS gelen geçiş olaylarının sayısını. Excel uygun sütununda geçiş olaylarının numarasını kaydedin.
   NOT: Bir geçiş olayı her iki yönde PDMS ile cam arasındaki sınır üzerinden geçen hücre çekirdeğinde olarak tanımlanır.
3. Birden geçişleri ölçmek için, hücre arayüzü geçti sayısını saymak. Bu sayı, hücre filmin sonunda yer edildiği yüzeye karşılık gelen excel sütunda kayıt altına alınmalıdır. T arayüzü haçlar her hücre için analiz tekrarlayınO film. Görüntüleme sırasında görüş alanının dışına göç hücreleri hariç.
   NOT: Bu hücrelerin fibronektin kaplı PDMS ve cam lamel yüzeylerine eşit olarak yapışır mümkün olduğunu, denemenin başında sayma hücre tarafından, doğrulamak için de önemlidir.
4. Cam yüzey (yani, durotaxis yapıldı) için PDMS göç hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. Yumuşak sert ve geçiş olaylarının toplam sayısına göre sert ve bölmek tarihinde sona eren birden geçiş olaylara olayları kapısı sayısını ekleyin.
5. Geçitlerin toplam sayısına göre birden geçişleri sayısına bölünmesiyle birden geçişleri yüzdesini hesaplayın.

Sonuçlar

Durotaxis bölmesinin şematik Şekil 1A 'de gösterilmiştir. Yumuşak PDMS alt-tabaka (90: çözüm çapraz bağlayıcı PDMS baz 1 karışımı) 6 iyi bir çanak içinde yayılır ve bir cam lamel böylece bir ara yüzey oluşturarak, daha sonra kısmen lamel üst yüzeyini kaplayan PDMS, üst üste yerleştirilir Farklı uyum iki alt tabaka arasında yer almaktadır. Yumuşak PDMS alt-tabakanın sertliği cam sertliği yaklaşık GPa'dır ^{01-02 Ocak} iken, beyin dokusu tipik bir uy...

Tartışmalar

Bu yazıda hücrelerin taşınmasıyla durotaxis incelemek için basit bir tahlil açıklar. Bu deneyde önemli bir gücü PDMS kullanarak durotaxis odaları hazırlamak kolaylığıdır. Alt-tabakaların sertliği, kolayca deneyinde, çeşitli katılıklarının bir çalışma sağlamak için bir çapraz bağlayıcı PDMS baz çözeltisi oranı değiştirilerek kontrol edilebilir. Ancak, sistemin bir potansiyel sınırlama daha sofistike sistemlerin ⁴ tarafından sağlanan bir sertlik degrade yaşandığı k...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
6-well plate	Celltreat	229106
DMEM	Cellgro	15-017-CM
L-Glutamine	Cellgro	25-005-CI
Sodium Pyruvate	Fisher Scientific	BP356-100
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
Fibronectin	BD Biosciences	610077
PBS	Invitrogen	21600-044
Falcon tubes	Celltreat	229456
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
U2OS cells	ATCC	HTB-96