Üretim ve Darbeli Düşük Frekanslı Ultrason Kantitatif Analiz neoplastik Hücreler Tedavi edilmeyen Sonic Duyarlılık belirleyin ve Tedavi için

Özet

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

Özet

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

Giriş

Ultrason insan işitme kapasiteleri üst sınırından daha yüksek bir frekansa (~ 20 kHz) ¹ ile herhangi bir salınım ses basınç dalgası değinmektedir. 20-60 kHz aralığında düşük frekanslı ultrason doku hasarı için, nükleik asit çıkarma hücre örneklerinin hazırlanması, emülsiyonlar üretilmesi için bir araç olarak laboratuarda kullanılan ve diğer testler için çeşitli edilmiştir. Düşük frekanslı ultrason yarar çeşitli temizlik malzemeleri, kaynak için endüstri ayara genişletilmiş ve malzeme işleme edilmiştir. Piyasada mevcut ultrason jeneratörleri 100-1,200 W. gelen elektrik gücü miktarı 18-60 kHz arasında değişen frekanslarda gelir ve tam ölçekli

Ultrason uzun tanısal görüntüleme için klinik ortamda kullanılmasına rağmen, ancak son zamanlarda bir tedavi yöntemi olarak uygulanmaktadır. Ultrason ≥1 MHz th güvenle idrar taşlarının (böbrek taşları) ve safra taşı kesintiye (taş yeteneğine sahiptirHastaların e safra kesesi veya karaciğer) semptomları ^2,3 azaltmak için. Ekstrakorporeal shockwave litotripsi (ESWL) olarak bilinen bu yaklaşım, günümüzde yaygın kliniğe (bir milyondan fazla hastada sadece ABD'de ESWL ile yılda ⁴ tedavi edilir) uygulanan ve bir modalite sunuyor hangi non-invaziv ile taşı kırmak olduğunu dışarıdan uygulanan, odaklanmış, yüksek yoğunluklu akustik bakliyat ^2-4 kullanımı yoluyla asgari teminat hasar.

Nedeniyle yüksek yoğunluklu ultrason tarafından oluşturulan benzersiz doğrudan kesme kuvvetlerinin yanı sıra kavitasyon baloncukları ile, bu metodolojiler yüksek yoğunluklu olarak bilinen bir yaklaşım içinde kastrasyon dirençli prostat karsinomu ve pankreas adenokarsinomu tedavisi için kanser terapisinde incelenmiştir odaklanmış ultrason (HIFU ) ^5-8. ESWL'nin çok benzeyen bir şekilde, HIFU'nun çok ultrason dalgalarının kullanır ve 60 ° C ya da HIG sıcaklıkları oluşturmak için seçilen bir fokal alanına bunları odaklanıronun hedef dokuda ⁵ koagülasyon nekrozuna neden olan akustik enerji kullanımı ile. Termal ablasyon diğer yöntemler şu anda (radyofrekans ablasyonu ve mikrodalga ablasyon) mevcut olmasına rağmen, HIFU sadece non-invaziv bir yöntemdir hipertermik ⁵ olması bu yöntemleri üzerinde ayrı bir avantaj sunuyor. HIFU klinikte karışık sonuçlar elde ve şu anda klinik çalışmalarda ^8-11 yalnızca kullanılabilir olmuştur. Bununla birlikte, elde edilen sınırlı başarı, ve klinik öncesi memeli modellerinde elde edilen in vivo veriler, çok umut verici bir kanser terapisi ultrason potansiyelini göstermiştir.

HIFU geliştirmek için bir çaba olarak, araştırmacılar sonochemotherapy bir form oluşturmak için uygun bir antineoplastik ajanlar ile birlikte ultrason birleştirmek için çalışılmıştır. Sonodynamic terapi (SDT) in vitro ve hem de etkileyici antineoplastik aktiviteyi göstermiştir umut verici bir roman tedavi yöntemidir In vivo çalışmalar ^1. Bu zarar verir, tercihen, bu hücrelerin normal histoloji ^1,5 arasındaki boyutu farkı göre malign hücreler bu ultrason gösterilmiştir. SDT neoplastik hücrelere karşı ultrason tarafından uygulanan tercihli hasarının derecesini arttırmak için sonosensitizers olarak bilinen özel maddeler içermektedir. SDT terapötik uygulamalar önceden incelenmiş olsa da, kullanılan ultrasonik sistemler tipik olarak daha yüksek frekanslı ultrason (≥1 MHz) istihdam ve düşük kHz frekans ultrason etkileri henüz tam olarak keşfedilmeyi vardır. Ultrason alt frekansları nedeniyle fizikokimyasal hasar ^12-14 uyaran mikrokabarcıkların hızlı çökmesi, genellikle atalet kavitasyon, hücrelerin imha sonuçlanan bir fenomen üretmek daha yetkin. MHz ve düşük kHz ultrason arasındaki atalet kavitasyon nesil bu fark daha düşük dalga frekansları Kabarcığa olanak gerçeği atfedilmiştirAşağıdaki sıkıştırma yarım döngüsü ¹² sırasında dolayısıyla daha şiddetli çökme üreten, genişleme yarım çevriminde rektifiye difüzyonla büyümek için daha fazla zaman s.

Biz daha önce U937 insan monositik lösemi hücreleri düşük frekanslı ultrason (23.5 kHz) duyarlı olduğunu göstermiştir ve bu duyarlılık belirgin hücre iskeleti ¹⁵ karıştırmayı antineoplastik ajanlar uygulaması ile arttırılabilir. Ayrıca, biz hücreler tercihen yüksek ultrasonik hassasiyeti gösteren büyük hücreler, boyutuna göre hasarlı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, benzer hücre boyutlarına de normal insan hematopoietik kök hücreler (hHSCs) ile lökositler geçici olarak düşük frekanslı ultrason tercihan normal doku varlığında malign hücrelere zarar için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir, bunların neoplastik meslektaşları ¹⁵ daha sonikasyon çok daha dirençlidir.

Ayrıca benzersiz pervane incelemek içinPotansiyel terapötik kullanım için düşük frekanslı ultrason erties, bizim şimdiki sonication sistemlerinden biri etkinliğini ve güvenilirliğini artırmak için temizlik ve istikrar prosedürlerini geliştirdik, bir 20 mm boynuz ile donatılmış Branson Model SLPe 150 W, 40 kHz Hücre Parçalayıcı, hazır 7.62 cm'lik kabına. Ayrıca, hidrofon bir kavitasyon metre ve osiloskop kullanarak 40 kHz aralığında doğru örnek kavitasyon enerjileri yanı sıra tutarlı dalga formları ve genlik belirlemek mümkün olmuştur. Rafine ve protokolleri sistematize ederek, bize nicelik farklı histogenetik soy neoplastik ve normal hücrelerin sonik hassasiyetlerini karşılaştırmak için izin, bizim deneysel sonikasyon tutarlılık kurmak mümkün olmuştur. 40 kHz sistemi için protokol ilgilenen laboratuarlar için sipariş karşılaştırılabilir deneyler yeteneğine sahip olması ve ortaya çıkardığı antineoplastik etkileri bizim bulgularının değerlendirilmesi için geniş detaylı sunulmuşturDüşük frekanslı ultrason. (Şekil 1 MeβCD), bir kolesterol tüketen maddesi, U937 ultrasonik duyarlılık ve THP1 insan monositik lösemi hücreleri artan ek olarak, metil-β-siklodekstrin doza bağlı etkileri incelenmiştir.

Protokol

1. Temizleme Hücre Sonifier Sistemi

1. Boynuz ve dönüştürücü kullanılarak kloroform ve pamuk çubukla arasındaki birliği temizleyin. Bundan başka, metal talaşı, pas ya da oksidasyon oluşumunu kaldırmak için boynuz ve dönüştürücü dişlerine hafif yağ veya mineral yağ uygulanır.
2. Yağ ile konuları silerek sonra sendika yağ ve diğer kirleri çıkarmak için kloroform kullanın.

2. Hücre sonifier Reassembling ve Sistem kurma

1. Dönüştürücü korna takın. Düzgün bir şekilde sistemi tork, fincan (Şekil 2A) alt dışarı boynuz çekerek fincan montaj monte dönüştürücü ve boynuz çıkarın. Dönüştürücü (Şekil 2B) üst kısmına yakın üç küçük deliklerden biri içinde bir yuva anahtarı yerleştirin. Daha sonra, boynuz (Şekil 2B) oluklu parçası üzerinde yarım inç karga ayağı ile donatılmış bir tork anahtarı yerleştirin. S sıkıntork metre 54,23 N okuyana kadar saat yönünde ^tandard. m (Şekil 2C), üretici tarafından tavsiye edilen ¹⁶ tork. Sıkılır dönüştürücü takın ve arka fincan içine boynuz ve dik bir pozisyonda bir halka sehpasına korna ve dönüştürücü monte edin. Deneysel darbe dozaj için sistem ayarlamadan önce güç kaynağına dönüştürücü takın.
2. Darbeler arasında 1 sn ile sonication 1 sn kullanarak darbe dozaj için sistem ayarlayın. Farklı dozlama modelleri diğer deney koşulları için kullanılabilmektedir. Su hacmi ve korna çapı gibi birçok değişken, potansiyel olarak bu doz değişiklikleri gerektirecektir. Bahsedilen hücre örneği türleri, hacim ve konsantrasyonu kullanılarak, deneysel veriler ve gözlem, bu dozaj rejiminin formülasyonuna yol açmıştır.
3. İstediğiniz genlik sistemi ayarlayın. Bu protokolde, sonosensit etkinliğini kılacak tam hücre yıkımını önlemek için% 33 ve% 50 genlik kullanınzor veya imkansız oranla biraz ölçmek için.
   NOT: genlikleri karşılaştırıldığında bu çalışmada.

3. Sistem Yoğunluk ve Fonksiyon değerlendirilmesi

1. Numune Sonication seviyesi 1.5 cm, en kavitasyon cihazı tutun. Sistem beklenen yoğunlukta çalıştığını değerlendirmek için okuma unutmayın. Mevcut sistem ve su seviyeleri kullanarak, 100-110 W / 33% genliği ve 115-125 W / 50% genliği için cm ² cm ² arasında bekliyoruz. Doğrudan / W cm ² kavitasyon enerjisini temsil göstergeden kavitasyon sayaç okumaları unutmayın. Suyun yüzeyinde bu okumaları alın ve hiçbir kabarcıklar metre prob karşısında mevcut olduğundan emin olun.
   NOT: Bu işlemler korna üzerindeki erişim için kapağı olmadan yapılabilir olduğunu not etmek önemlidir. Her sonikasyon sonra tekrar gerekli değildir. Aksine, onlar sadece, temizlik yeniden monte ve sistemi kurduktan sonra yapılmalıdır.
2. Tam hidrofon sensörü sokmak için su 12,5 ml ihtiva eden bir numune şişesine hidrofona yerleştirin. Halka standı kullanarak hidrofona Askıya.
3. Dalga özelliklerini değerlendirmek için osiloskop girişine hidrofona takın. Anormal dalgalar üreticisinin özelliklerine sistemin frekansını değiştirebilir olarak, net bir sinüs dalgası için osiloskop inceleyin. Kavitasyon metre ve osiloskop Hem hatalı sistem veya uygunsuz montaj göstergesidir anormal dalgalar gösterecek bir frekans okuma, ancak osiloskop verir.

Hücreler ve Orta 4. hazırlanması

1. 240 ml Iscove Modifiye Dubecco Ortamı (IMDM) içinde 50 ml cenin sığır serumu ile orta hazırlayın. Sıcaklık hızlı artışlar, serum istikrar bir uzlaşmaya yol açabilir gibi bir sıcak su banyosu içinde fetal sığır serumu çözülme etmeyin. Ul gentamisin 50 mg / ml 240 ve 5 ml penisilin birleştirin/ Standart kültür şişelerinde 100x streptomisin ve orta ekleyin. 4 ° C'de orta saklayın.
2. Tohum U937 hücreleri de ~ 4 x 10 hazırlanmış ortam kullanılarak 25 cm ² şişede ⁴ hücre / ml olmuştur. Bir TC20 hücre sayacı kullanarak konsantrasyon ve canlılığı için hücreleri değerlendirmek ve bir mikro-santrifüj tüpüne hücreleri ve 15-20 ul tripan mavisi 15-20 ul yerleştirerek ve içeriğini karıştırarak mavi dışlama tripan. Pipette15-20 bir TC20 örnekleme slayt içine bu karışımı ul ve TC20 hücre sayıcı içine slayt koyarak sayıları başlatırlar.
3. 37 ° C'de ve% 5 _CO2 ile inkübe hücreleri, ve tripan mavi dışlama ve TC20 hücre sayacı kullanılarak hücre canlılığı edin. Hücreler uygun bir yoğunlukta ve / veya uygun bir zaman dilimi için sonosensitizers, aktarım, bir 20 ml'lik bir cam sintilasyon şişesi kültür şişesi hücre 3 mL ile muamele edilmiştir zaman. Bu protokol, 48 saat süre ile U937 hücreleri büyütmek ve daha sonra 0.5, 1 ile tedavi,ya da 30 dakika boyunca 5 mM MeβCD yeterli sonikasyon öncesinde hücrelerin kolesterol tüketmek için.

5. Hücre Sonikasyon

1. Degas deiyonize bir vakum ve Buchner şişesi kullanılarak distile su. Fincan boynuz su aktarın ve boynuz üstünden 15 mm seviyesine doldurun. sonikasyon işlemi birkaç dakikalık bir süre için su Daha fazla gazdan arındırmadan neden olur, ve sistem sonikasyon örnek önceki seferden değilse deney boyunca tutarsızlıklara yol açabilir. Bu nedenle, sonication örnek öncesinde ~ 7 dakika süreyle sistemi çalıştırmak.
2. Tutma cihazına hücreleri içeren sintilasyon flakonu takın. Ardından, fincan boynuz üstüne tutma cihaz takmak ve (sürgülü mekanizmasını kullanarak su yüzeyinde) korna üstünden 15 mm'lik bir yüksekliğe ayarlayın.
3. Hücreler tipik olarak 1 sn bu darbeler her birinin arasına aralık ile, ultrason, üç 1 sn darbeleri kullanılarak sonike edilmiştir. Bunun içinprotokol, yukarıda belirtilen darbe doz kullanılarak% 33 ve% 50 genlikte sonikasyon hücreleri.

6. Hasar Sonrası sonication için Hücreleri değerlendirilmesi

1. Tripan mavisi ve TC20 hücre sayacı kullanarak hasar ve canlılığı için askıya hücreleri değerlendirin. Buna ek olarak, bir Z2 sayacı kullanarak örnek analiz. (: 1 oranında 200) Z2 sayacı analizi için, 20 ml izotonik serum fizyolojik içine 100 ul hücre süspansiyonu pipetle. Analizden önce, izotonik serum fizyolojik kullanılarak en az iki kez Z2 parçacık analizörü diyafram yıkayın. Sayaç tutucuya Z2 örnek yerleştirin ve sayıları başlatmadan önce diyafram platformu yükseltmek.
2. Üreticisi tarafından sağlanan yazılımı kullanarak TC20 ve Z2 sayaçları verileri edinin. Hücre hasarı, canlılığı ve sonikasyon hücresel enkaz oluşturulması için bu verileri analiz edin.

7. XTT Deneyi Hücre Canlılık belirleyin ve Tedavi U937 ve THP1 Hücrelerinin Mitokondriyal Etkinlik için

1. PrioXTT değerlendirmeleri R, aynı koşullar altında U937 ve THP1 hücreleri büyür. Önceden, sonikasyon işlemine 30 dakika boyunca MeβCD aynı konsantrasyon aralığı ile hücrelerin ön işlemden geçirin. Hücreler artık 1-3 bir saniye bakliyat bir dizi kullanarak soniklendi olması dışında daha önce olduğu gibi aynı ultrason parametrelerini kullanın değerlendirmek için XTT kiti için hasar bir dizi geliştirmek için bir saniye aralıklı.
   Not: Bu adımların birçoğu XTT kiti kılavuzuna doğrudan alınır ve sadece ilgi laboratuvarlarının kolaylık sağlamak için tekrarlanır.
2. 10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır. Büyüme ortamında yeniden süspanse hücre topağı daha önce tarif edildiği. ~ 1 x 10 ⁵ hücre / ml'de yeniden süspanse hücreleri. Daha sonra 100, üç kopya halinde a-düz tabanlı 96-çukurlu mikro-titre plaka içine göz başına ul ve en Tohum U937 hücreleri ayrı bir 96-kuyucuklu plaka kullanılarak THP1 hücreleri için tekrarlayın. Tam büyüme ortamı tek başına boş olarak absorbans okumaları 100 ul içeren 3 kontrol kuyuları ekleyin. Ardından, 2 inoküle plakalar inkübe4 saat.
3. XTT reaktifi ve kullanımdan önce 37 ° C 'de aktivasyon tepkin maddesinin iki alikotları çözülmesini sağlayın. Girdap tümbölenler hafifçe açık çözümler elde edilinceye kadar. Bir 96-yuvalı mikrotiter plakası deneyi için yeteri kadar aktive XTT çözeltisi oluşturan XTT reaktifi, 5.0 ml aktivasyon reaktifi 0.1 ml ilave edilir. Diğer plaka için işlemi tekrarlayın.
4. Her bir oyuğa aktive-XTT çözeltisi 50 ul ekle. 2 saat boyunca hücre kültürü CO ₂ inkübatör plaka dönün. Nazikçe eşit pozitif kuyularda turuncu renk dağıtmak için kuluçka dönemini takiben plaka çalkalayın. Bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak 450-500 nm dalga boyu arasında bir dalga boyunda hücreleri ihtiva eden test gözlerine ve işlenmemiş Art alan kontrol oyukları absorbansı ölçülür.
5. Ya boş kontrol kuyuları kullanarak mikrotiter plaka okuyucu sıfır veya belirli sonuçlarından ortalama değer çıkarın. Bir waveleng tekrar tüm tahlil kuyuların absorbansı ölçülürinci 630-690 nm arasında 450-500 nm ve elde edilen değerlerden değerleri çıkarmak. Not: Bu ikinci absorbans tayini tahlil sonuçlarından non-spesifik okumaları ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. XTT deneyi Her iki hücre hattı için dört kez yinelenmiştir.

Sonuçlar

Sistem kararlılığı tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar elde önemlidir. 54,23 ^N. m uygun tork şartname Şekil 3B örnek şişesine içindeki ölçümler göstermektedir. dalga tutarlılık, bir osiloskop ve hidrofon (Şekil 3A) kullanılarak değerlendirilen ile dönüştürücü ve Sonotrode ² uygun kaplin elde ve Şekil 3C fincan boynuz içinde istikrarı değerlendirir. Beklendiği gibi bazı enerji cam tarafından emilerek nedeniyle, genlik biraz düşürüldü. Bununla birlikte, dalga biçimi bozulmuş ya da örnek sonik enerji güvenilir bir doğum için gerekli olan her iki panel B veya C, çarpıtılan değildi. Net bir tekil sinüs dalgası olarak görünmüyor bir dalga hatalı transdüser veya yanlış kurulum gösterir. Bu, çoklu olarak anormal dalgaları göstermektedir, Şekil 3B, bir sinüs dalgası net olmaması ifade edilir, ve bir frekans bir okumat düzgün işleyen bir sistem ile beklenen. Kavitasyon enerji üretilir (Şekil 4) ölçmek için kullanılan kavitasyon ölçer 100-110 W /% 33 genliğinde ^cm2 ve 125-130 W /% 50 genliğinde ^cm2 olarak ses yoğunluğu bulunamadı.

40 kHz sistemi uygun şekilde ayarlanır ve bütünüyle (Şekil 5) bir araya getirildikten sonra, her iki TC20 ve Z2, sayaçlar (Şekil 6) tarafından tespit edildiği üzere, güvenilir bir hücre harabiyeti, hali hazırda, elde edildi. Beklendiği gibi, daha geniş bir hücre hasarı yerine% 33 genliğinde daha% 50 sonike hücre popülasyonlarında gözlenmiştir. Bununla birlikte,% 33 genlik o fark hasar üretir, uygulanan ajanların potansiyel sonik hassaslaştırıcı etkilerini tespit etmek için bir başlangıç ​​noktası olarak yararlıdır, ancak ajanlar ultrasonik hassasiyet onların potansiyelini değerlendirmek için uygulandığında daha fazla hasar tespit için yer bırakır. Bu durum, Şekil 7A, gösterilmektedir buradaU937 hücreleri, ultrasonik duyarlılığını güçlendirmek ilgili MeβCD doza bağlı etkileri sunulmaktadır. Olmayan sonike MeβCD ile muamele edilmiş hücreler olmayan sonike, muamele edilmemiş hücrelere canlılığı çok benzer olmasına rağmen, canlılık belirgin uygulandı 1 sn 40 kHz ultrason üç darbe takiben düşmüştür. Buna ek olarak, sonikasyon sonrasında canlılığı azalma, 5 mM MeβCD en 1 mM ardından hücre sayısında bir düşüş, ve daha sonra 0.5 mM MeβCD üretilen, doza bağımlı olduğu görülmektedir.

Hücre canlılığı ve mitokondriyal aktivitesi üzerinde benzer etkilere XTT kiti (Şekil 7B) ile değerlendirildiği gibi, önceden, sonikasyon işlemine MeβCD değişen konsantrasyonları ile muamele edildi, her iki U937 ve THP1 hücrelerinde gözlenmiştir. THP1 hücreleri U937 hücrelerden daha dirençli biraz daha sonic gibi görünseler de, her ikisi de insan lösemi hatları doza bağımlı bir şekilde zarar görür. MeβCD yüksek konsantrasyonlarda ve ultrason eşya fazla bakliyathücre canlılığı ve mitokondriyal aktiviteyi azaltmak için karşılık gelen, U937 ve THP1 hücreleri için çözünür, parlak turuncu türevine XTT düşük azalma uced.

Metil β-siklodekstrin Şekil 1. moleküler yapısı. (A) Metil-β-siklodekstrin (MeβCD) tam yapısı. (B) MeβCD H ya da _CH3, ya bir R grubu yedi tekrar birimlerinin bir polimeridir. Moleküler Formülü: C ₅₆ H ₉₈ O _35. Moleküler ağırlık = 1331,36.

Şekil 2. Düzgün 40 kHz ultrason sistemi torqueing. (A) korna ve dönüştürücü fincan pri kaldırılırya torqueing için. (B) kendi konumlarında yuva anahtarı ve tork anahtarı yerleştirin. (C) fincan korna ve dönüştürücü reattaching önce saat yönünde tork 54,23 ^N. M uygulayın.

Ultrasonik sistemin dalga biçimini karakterize bir osiloskop 3. Kullanımı Şekil. (A) 'hidrofon olan bir osiloskop genlik ve dalga biçimi tutarlılığını değerlendirmek için de kullanılabilir. (B) bir kayıt 1.5 cm doğrudan boynuz üzerine fincan çekilmiş ve% 33 genlik ayarlayın. (C) 'de resimde dalga hidrofon 20 ml'lik bir cam sintilasyon şişesi içine yerleştirilmiş olduğunda elde edilen bir okuma arasındadır. Şişe boynuz üzerinde 1.5 cm yerleştirilmiş ve yeniden% 33 genlik ayarlanır. (D) Bir osiloskop ekran oArızalı sistem veya boynuz dönüştürücü birliğinin uygunsuz bağlama ile beklendiği gibi anormal frekansları ile fa sistemi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir kavitasyon metre Şekil 4. ultrason sisteminin ses yoğunluğu karakterize etmek için. Burada görülen kavitasyon ölçer W / ^cm2 kavitasyon enerjisini temsil etmek için kullanılır. Bu örneğe göre olan enerji tutarlılığını değerlendirmek için çok önemli bir araçtır.

40 kHz ultrason sisteminin Şekil 5. Ana bileşenler. Ultrasonik sistem fincan boynuz ile tam gösterilmiştir ( A), ısıtma tertibatı (B), dönüştürücü (C) ve örnek konumlandırma mekanizması (D). Bu tasarım boynuz (F) Yukarıdaki örnek (E) kolay konumlandırma için izin verir.

TC20 ve Z2 sayaçları kullanarak U937 hücrelerinde ultrasonik lizis üzerinde genliği farklı düzeylerde Şekil 6. Etkileri. Hücreler her arasında 1 sn aralıklı, ultrason, üç 1 sn darbeleri kullanarak% 33 genliği 40 kHz hücre Dismemrator (100-110 W / cm ²⁾ veya% 50 genlikli (125-130 W / ^cm2) ile selenlenmiştir Bu darbelerin. (A) Z2 sayacı yazılımı bir ekran U937 hücreleri üzerinde sonication etkisini göstermektedir. TC20 sayacı (B) veri sonucu tekrar üretilebilirliğini gösteren bir grafik derlendis. Bu veriler, toplam canlı hücre sayımları yanı sıra tripan mavisi değerlendirilen hücre canlılığı bulunmaktadır. Barlar 4 bağımsız hücre popülasyonları için ortalama (SEM) standart hata yansıtmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

U937 ve THP1 hücrelerinin ultrasonik duyarlılığını güçlendirmek ilgili metil β-siklodekstrin Şekil 7. etkileri. (A) U937 hücreleri önce 40 kHz ultrason (105 W / cm sonike edilmeden 30 dakika boyunca MeβCD konsantrasyonunun değiştirilmesi ile tedavi edilen ² ) üç 1 sn darbeleri kullanarak birbirinden 1 sn aralıklı. Hücre popülasyonları ≥12 um ve ≥17 mikron gruba ayrıldı. (B), U937 ve THP1 hücreleri daha değişen konsantrasyonlarda ile muamele edildi30 dakika boyunca önceden 1 sn ultrason 1-3 darbeleri kullanarak 40 kHz sistemi ile sonicated olmanın MeβCD rasyonlarına 1 sn aralıklı. Hücre canlılığı ve mitokondriyal aktivite XTT kiti ile değerlendirildi. 100 ul hücre, bir düz tabanlı 96 oyuklu bir mikrotiter plakası içine, göz başına tohumlanmıştır. Plaka önceden XTT çözeltisi ilave edilmeden 24 saat süreyle inkübe edildi. Dalga boyu okundu önce Hücreler daha sonra, ilave bir 2 saat süre ile inkübe edildi. Barlar 4 bağımsız hücre popülasyonları için SEM yansıtmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Optimum sonuçlar elde etmek için, özel bakım dikkatle örnek yerleştirin ve dönüştürücü-boynuz birliğini temizlemek için önlemler alınmalıdır. boynuz numunenin yerleştirilmesi boynuz mesafeyi değiştirerek Örnek maruz enerjisini değiştirir, bu nedenle akustik odaklar değiştirebilir ve gibi, uyumlu hücre yıkımı elde edilmesi için önemlidir. fincan boynuzu içinde akustik enerji, maksimum kavitasyon konumunu bulmak için kavitasyon ölçer kullanılarak eşlenebilir. Buna ek olarak, osiloskop ile birlikte kavitasyon metre, hücreler maruz ediliyor ses yoğunluğunu yanı sıra dalga homojenliğini belirlemek için hayati öneme sahiptir. Bu nedenle, bu enstrümanlar sistemi ile ilgili sorunları tespit ve giderme sistem kararsızlığına düzeltmek için gerekli olabilir belirlemek yardımcı olmak için kullanılmalıdır.

Daha önce belirtildiği gibi, düşük frekans sistemi aday değilse deney boyunca daha gaz çıkışına su hareket edebilirsonication örnek birkaç dakika önce. Bu ilk çalıştırma deneyleri sırasında nispeten gazı alınmış sonikasyon orta ve böylece tutarlı sonuçlar elde etmek için yapılmalıdır. Sensitizasyon gerçek ölçüde değerlendirilmesi zor olurdu, sonosensitizers etkinliğini değerlendirmek Buna ek olarak, hücreler ya da maksimum genlik yakınındaki sonikasyona tabi olmamalıdır. 40 kHz sistemi üzerinde% 33 genlik kullanarak bu önemli hasar üretir, ideal bir ayardır, ancak U937 ve THP1 hücreleri (Şekil 7) karşı MeβCD ile gösterildiği gibi, onların etkinliğini göstermek için sonosensitizers bol bol yer sağlar. Bu veriler aynı zamanda MeβCD doza bağımlı bir şekilde, düşük frekanslı ultrason birden fazla lösemi hatları karşı duyarlı olduğunu teyit etmektedir.

Sonikasyon ^17-19 aracılığıyla oluşturulan zar içi Kavitasyon kabarcıklarının göstergesi olan 8 MHz 0.75 MHz aralığında daha yüksek frekans ile yapılan bir dizi deney yapılmıştır. Bununla birlikte, questioHala ultrason kaynaklı hücre parçalama ¹⁸ tam mekanizması açısından kalır ns. Biz düşük frekanslı ultrason ^15, diğer laboratuvarlar ^20, gösterdiği bir olguyu kullanarak hücre iskeletinin akışkan hale arasında bir bağ olduğunu göstermiştir ve sonik hassasiyet artmıştır ^21. Ayrıca, bu tür sitokalasin B olarak microfilament bozucu maddeler birden fazla lösemi ultrasonik hassasiyetini potansiyalize bulduk aktin polimerizasyonu engellediği fikrini hatları, ancak hHSCs veya ²² lökositleri, özellikle ilgi çekici bir sonosensitizing mekanizması olabilir. Ayrıca belirgin şekilde, akut miyeloid lösemi, kronik miyeloid lösemi, akut lenfoid lösemi dahil olmak üzere, in vitro olarak, farklı lösemi tipleri ultrasonik hassasiyeti artar, vinkristin, tübülin polimerizasyonunu ^{23, 24} inhibe eden bir mikrotübül bozucu ajan gözlemledik. Buna karşılık, iskelet parçaları stabilize iskelet yönlendirilmiş ajanlar (paklitaksel bird jasplakinolid) hücre parçalama ²² daha düşük oranlarda yansıyan, sonication hücrelerine karşı dirençli hale getirmek için görünür. Birlikte ele alındığında bu veriler, neoplastik hücrelerin sitoskeletal komponentleri akışkanlaştırma hipotezi gerçekten de SDT ²⁵ etkinliğini artırmada önemli bir faktör olduğunu destekler. Bu çalışma aynı zamanda, kolesterol tükenmesi MeβCD ile muamele edilmiş U937 hücreleri belirgin 40 kHz ultrasona duyarlı olarak ayrıca neoplastik hücrelerin ultrasonik duyarlılığını güçlendirme hangi bir yöntem olabilir göstermektedir.

Bizim sonikasyon protokolleri, in vitro olarak belirgin antineoplastik aktivite göstermiştir birlikte, mevcut metodoloji, sonication için kullanılan şişelerde uyabileceğini kültürü ve küçük omurgalı modellerinde çalışması ile sınırlıdır. Bu güvenli bir şekilde palslı düşük frekanslı ultrason (20 kHz) kullanılarak sonikasyona tabi tutulmuş olabilir zebrafish göstermiştir ve kemoterapötik maddelere karşı toleransı kantitatif karşılaştırılabilir olduğunutümör taşıyan zebrafish öne murin modellerinde ²⁶ tarafından tolere doz, bu protokollerin in vivo antineoplastik aktiviteyi değerlendirmek için, ön araştırmalarda kullanılabilir. Bununla birlikte, önceden memeli modelleri sonication, kemoterapötik ajanların verilmesini MHz aralığında ^{1 'de} rapor edilmiştir ve bu protokoller muhtemelen düşük frekanslı ultrason gibi kolesterol-tüketici değildir ve sitoskeletal yönelik maddeleri de kapsayacak şekilde genişletilebilir.

SDT bu tür potansiyel klinik uygulamaları antineoplastik ajanlar intravenöz (iv), kan önce sonikasyon ²⁵ kaldırılmakta ki ekstrakorporal kan sonikasyon içerebilir. Bu yöntem, insan anatomisi yarattığı potansiyel ses engelleri kaldırır ve solid tümörlerin gelen lösemili patlamaları yanı sıra metastazları zarar için etkili bir yol olabilir. O kolesterol tüketen ve iskelet yönettiği ajanlar olabilir de mümkündürZaten, bu tedavi yönteminin etkinliğini arttırmak amacıyla klinikte incelenmektedir HIFU'nun protokollerinde kullanılabilir.

Bu çalışmada tarif edilen yöntemler, bu yardımcı arttırabilmektedir potansiyel sonosensitizers değerini ve ayrıca sistem arıtma değerlendirmek yeteneğine sahiptir. Ancak, güç kaynağı kalitesi, akustik odaklar ve dönüştürücüler arasında bireysel varyasyon dahil olmak üzere bu ultrasonik vasiyetler, kullanırken dikkat edilmesi gereken pek çok değişken bulunmaktadır. Bu nedenle, gelecekteki araştırmalar sonik dalgalar görselleştirilmesi ve sonuçları üzerinde nüfuzlarını anlamak üzerinde durulacak. SDT in vitro hücre lizizine arttırdığı gösterilmiştir ve elde edilen memeli modellerinde in vivo veriler daha fazlası, klinik olarak uygulanabilir olduğunu kanıtlayabilir. Birden çok maddeleri ve ultrason kapsayan kötü huylu hücrelerin diğer potansiyel olarak işletilebilir özelliklerinin yanı sıra, çeşitli kombine yöntemleri inceleyen deneyler laboratuvarda devam etmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes	Life Technologies	12440079
Amphotericin B Solution	Sigma-Aldrich	A2942
Penicillin/Streptomycin 100x Solution	Life Technologies	10378-016
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn	Branson Ultrasonics	101-063-726	sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater	Brisk Heat	SDCJF1A-GBH1000-1	heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software	Beckman-Coulter	6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	145-0102
Gentamicin 50 mg/ml	Sigma-Aldrich	G1397
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks	Fisher Scientific	353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl	Lonza	17-605C
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps	Beckman-Coulter	A35473
AccuJet Pro Auto Pipet	BrandTech Scientific	26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets	USA Scientific	1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips	USA Scientific	1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette	Wheaton	851164
1,000 μl Micropipette	Wheaton	851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides	Bio-Rad	145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator	Forma Scientific	3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope	Tektronix	DPO2002B	used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter	PPB Megasonics	PB-500	used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone	Teledyne	TC4013-1	connects to the oscilloscope
Wheaton 250 ml Flasks	Sigma-Aldrich	Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials	Sigma-Aldrich	Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution	Beckman-Coulter	N/A	diluent for Z2 counter
Chloroform 99%	Sigma-Aldrich	C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous	Sigma-Aldrich	459836
Mineral Oil	N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit	ATCC	30-1011K
96-Well Microplate Reader	Cole-Palmer	EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells	ATCC	CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells	ATCC	TIB-202