Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Özet

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Özet

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Giriş

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

Protokol

Yerli Çözünür Kolajen Çözüm 1. Hazırlık

1. Hazırlama ya da 1-3 mg / örneğin Piez ve arkadaşları tarafından rapor edildiği gibi standart ayırma protokollerini kullanarak ml. ¹⁵ de sıçan kuyrukları kolajen asitleştirildi çözünür, tip 200 mg satın
2. Modifiye edilen kollajen çözeltilerinin istenen son hacmine bağlı olarak, başlangıç ​​malzemesinin miktarını Scale. Yaklaşık çözünebilir doğal kolajen 200 mg, 3 mg / ml metile edilmiş 25-30 ml ve süksinillenmiş kolajen çözeltilerinin 25-30 ml her biri tercih.

2. Kolajen Metilasyon

1. Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak.
2. 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Bulanık olma çözüm neden kollajen çökelti gözlemleyin.
3. 25 dakika boyunca 3000 x g'de çöktürülmüş kollajen çözüm aşağı doğru döndürün. Berrak bir jel-benzeri çökelti tüplerin alt görünür olmalıdır. Aspire ve düzgün süpernatant sıvı atmayın.
4. 0.1 N HCI ile metanol içinde 200 ml çökelmiş kollajen yeniden süspanse edin ve metilasyon reaksiyonu 4 gün boyunca oda sıcaklığında karıştırma ile oluştuğu sağlar. Kollajen erimesi olmaz, ama çözüm bulutlu hale getirecek çok küçük görünür parçalar halinde parçalayın gerekir.
5. Metilasyon sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g'de çözüm metıle kollajen pelet. Aspire ve asitli metanol süpernatant atın.
6. Tekrar pipetleme ile yaklaşık 3 mg / ml'lik bir konsantrasyona vererek, steril PBS 25 ml metile edilmiş kolajen çözündürülür ve bir 60 um'lik bir hücre süzgecinden çözelti filtre edin. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın.
7. Concentratio değerlendirinticari bir sıçan kolajen ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözümün n. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir.
8. Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak metillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin metıle kollajen olan üst kat.
9. 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'da, çözelti saklayın.

3. Kolajen Succinylation

1. Buz soğukluğunda steril su ile mi, 0.5 mg / lik bir konsantrasyon yerli asitlendirildi (pH 2-3), kolajen çözeltisi, diğer 100 mg seyreltilir ve jelleşmesini önlemek için buz üzerinde çözüm tutmak.
2. 1 N NaOH ile birkaç damla 9-10 kolajen çözeltisinin pH değeri ayarlamak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. Kollajen bulanık olma çözüm neden çöktürmek gerekir.
3. Suc 40 mg çözülür(kolajen çözeltisinin hacmi ^inci 20/01) 10 ml aseton içinde cinic anhidrid (kolajen mg'ı başına 0.4 mg) eklenir. Yavaş yavaş (yaklaşık 0.5 mi artışlarla) sürekli pH değerine karıştırılarak kolajen çözeltisi bu karışıma ekleyin. PH 9.0 yaklaşırken 1 N NaOH, 1 veya 2 damla eklenerek pH 9.0'ın üzerinde muhafaza edin.
4. Aseton içinde süksinik anhidrit katan 120 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin. Süksinillenmiş kollajen erir olarak açık hale çözüm gözlemleyin. Periyodik olarak 9.0 üstünde kalmasını sağlamak için pH değeri kontrol edin.
5. 1 N HCI 20 ul artışlarla 4.0 çözeltinin pH ayarlayın. Süksinillenmiş kollajen çökeltiler gibi yine bulutlu çözüm gözlemleyin.
6. Succinylation sonra santrifüj 25 dakika boyunca 3000 x g'de çözüm süksinillenmiş kollajen pelet. Aspire ve reaksiyona girmemiş süksinik anhidrit ile asidifiye süpernatant atın.
7. Succinylated kolajen çözülürsteril PBS, 25 ml, 60 mikron hücre süzgecinden çözeltisi tekrar pipetle ml / yaklaşık 3 mg'lık bir konsantrasyonunu vermek ve filtre bölgesi. 1 N NaOH ile 20 ul artışlarını kullanarak 7.3-7.4 çözeltinin pH ayarlayın.
8. Ticari bir kollajen sıçan ELISA kiti ya da hidroksiprolin tahlil kiti kullanılarak çözeltinin konsantrasyonunu değerlendirin. 3 mg / steril PBS ile ml çözeltisi ile seyreltilir.
9. Dikkatli bir şekilde şişenin altındaki kloroform 3 ml katman, bir vidalı başlık ile cam bir şişe aktararak süksinillenmiş kolajen çözeltisi sterilize, şişe, 4 ° C, O / N ayarlayın ve daha sonra aseptik olarak kaldırıp saklamak için izin süksinillenmiş kollajen olan üst kat.
10. 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'da, çözelti saklayın.

Kollajen Değişiklikler 4. Doğrulama

1. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kollajen çözeltilerin her birinden 1 mi örnekleri hazırlayın ve konsantre seyreltinHidrojen iyonu titrasyon için steril saf su ile 0,1 mg / ml arasında entration. Bundan başka, en azından 4 saat için her 10 kDa kesme membraneusing 3 çözeltisi değişiklikler ile suya karşı diyaliz ile tampon, en az 1000 kat seyreltilir.
2. NaOH ve HCl az miktarda 7.3 çözeltilerin pH ayarlayın. Doğal olarak metile edilmiş ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri için titrasyon eğrilerini oluşturmak için Tanford ¹⁶ tarafından tarif edildiği gibi rasgele bir referans olarak pH 7.3 kullanarak, örneğin her biri hidrojen iyon titrasyonu yapın.
3. Asit hacminin ilişkili H ^+, molekül başına elektron sayısına karşı eklenirler pH değişimine çizilir. Yüksek pH "Amino" sınıfı, nötr noktasına doğru süksinillenmiş kolajen bir kayma (amin gruplarının kaybı) göstermelidir ve düşük pH "karboksil" sınıfı için metile kollajen sola doğru bir kayma (karboksil gruplarının kaybı göstermelidir ) ve süksinillenmiş kollajen bir sağa kayışı (karboksil grubunda bir kazançs), doğal kolajen ile karşılaştırıldığında.
4. Standart protokoller ^17,18 takiben, 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBA) kolorimetrik yöntem kullanılarak succinylation ile ikame nativ kollajen amino gruplarının% belirleyerek succinylation reaksiyonunun etkinliğini değerlendirmek.

Mikroakışkan Cihazlar ve Hücre Yayımlamak 5. Fabrikasyon

1. Standart yöntemler kullanılarak ⁹ mikroakışkan cihazları imal. 100 mikron boyunda 0,4-1,5 mm genişliğinde ve hücre büyümesi için uzun kanallar 1-10 mm mikroakışkan hücre kültürü oda oluşturmak için fotolitografi kullanarak tanımlanan silikon üzerinde SU-8 ustaları PDMS çoğaltma kalıp kullanın.
2. Cihaz ve bir bardak slayt yüzeyini okside plazma temizleyici kullanın ve sonra bağ birlikte basın. En az 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılarak sterilize aygıtı sonra steril PBS içinde 50 ug / ml fibronektin bölmeyi doldurup, 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Fenotipinde veya farklılaşma hali stabilizasyonu için kolajen jel gerektiren primer sıçan ya da insan hepatositleri gibi hücreler, cihazı Tohum. Bu cihaz başına 14 x 10 ⁶ hücre / ml'de tohumlanmıştır taze izole edilmiş fare primer hepatositlerinde ^7,19 ya da ticari olarak temin edilebilir dondurulan primer insan hepatositleri 20 ul kullanımı.
4. Hücreler 4-6 saat takmak ve ardından serbest hücrelerin yıkayın ve büyüme ortamı ile kaplama medya yerine izin verin. Yayılma, tam hücre sağlamak ve hücrelerin konfluent tek tabaka oluşturmak için O / N inkübe edin.

6. katman-katman, bir kollajen depolanmasının

1. Laminer akış, doku kültürü kaputu, cihaz başına her çözeltinin 10 uygulamalar için metil ve süksinillenmiş kolajen çözeltileri, yeterli miktarda, yanı sıra ortam birkaç ml hazırlar. Buz üzerinde çözüm tutun. Biz cihaz başına katmanın başına kollajen 20 ul (10-15 kat, toplam cihaz hacmi) kullanın.
2. Olmakmetilatlanmış (Polikatyonik) çözümü ile çırçır, daha sonra 20 metillenmiş bir ul ve sahip cihazlar yıkama alternatif her uygulama arasında 1 dakika bekledikten kolajen çözümleri succinylated. Aygıtı yaklaşık 20 dakika sürer solüsyon başına 10 kez, toplam yıkayın. Hücreler medya olmadan süreyi en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın.
3. Yavaş yavaş büyüklüğüne bağlı olarak giriş / çıkışında biriken kollajen gözlemleyin. Sıvı Akış arttıkça direnci, medya ile bir veya iki kez aygıtı yıkayın ve sonra katmanlarını devam edin.
4. Tüm katmanları uygulandıktan sonra, taze medya ile iki kez cihazı durulayın ve inkübatör dönmek. Hücre tipine bağlı olarak, hepatositler geliştirilmiş polarizasyon gibi hücre dışı matris ile indüklenen morfolojik değişiklikler, bir kaç saat içinde görünür olmalıdır.
5. Kollajen matrisin mevcudiyetini doğrulamak için standart yöntemler kullanılarak ⁹ transmisyon elektron mikroskopisi için temsili cihazlar hazırlayınkültürlenmiş hücrelerin üzerine montajı.

Hücre Fenotip ve Fonksiyon 7. Stabilizasyon

1. Resim hücre tipi için standart yöntemler kullanılarak hücre morfolojisi, canlılık ve polaritesi. Hepatositlerde için, kollajen birikimi etkilerini göstermek için apikal polarizasyon faz mikroskobu, canlılığı için LIVE / DEAD boyama ve CMFDA boya kullanılarak 14 gün boyunca görüntüleri toplamak.
2. Hücre morfolojisi için, durulama, 20 ul PBS ve görüntüyü faz kontrast mikroskopisi kullanılarak cihazı enjekte PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca cihazı yıkayın.
3. Ölü / canlı boyama için, durulama, üretici talimatlarına göre hazırlanır DAPI ile ölü / canlı boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme, 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir, durulama Cihaz tekrar 20 PBS ul ve görüntünün floresan mikroskobu kullanarak cihazı ile.
4. Safra Canaliculi boyama, imalatçının talimatları izlenerek, 37 ° C de 30 dakika inkübe hazırlanan DAPI ile 2 uM CMFDA boyama çözeltisi 20 ul enjekte etmek için durulama PBS 20 ul ile pipetle giriş boyunca aygıtı temizleme ile tekrar cihazı yıkayın 20 ul PBS ve görüntü floresan mikroskobu kullanarak cihazı.
5. Harcanan ortam toplamak ve hücre fonksiyonunu belirlemek için, kültür süresi boyunca uygun zaman noktalarında hücresel metabolik ürünlerini ölçmek. Hepatositler için, harcanan ortam içinde albumin ve üre miktarını ölçer.
6. Böyle değerlendirmek enzim aktivite düzeyleri, antikor boyama ya da RNA analiz gibi hücreler kendilerini, üzerinde son nokta fonksiyonel analizler gerçekleştirin. Hepatositlerde için, neden ve sitokrom P450 enzim faaliyetleri veya faz II konjugasyon enzim glutatyon S-transferaz ölçün.

Sonuçlar

Yerli kollajen tabakası-katman birikimi kullanmak için polikatyonik ve polianyonik kollajen çözümleri oluşturmak için metilasyon ve succinylation kullanılarak değiştirilebilir. Succinylation sukkinil grupları ile nativ kollajen ε-amino grupları değiştirir ve metilasyon, bir metil grubu (Şekil 1A) ile saf kollajenine karboksil gruplarını değiştirir. Kollajen proteini amino asit yan zincirlerine Bu modifikasyonlar çözeltiler pH titrasyon eğrilerini değiştirebilir. Metilasyon, amin...

Tartışmalar

Ultra ince saf kolajen düzenekleri değiştirilmiş kolajenlerin katman-katman birikimi ile şarj hücreleri veya malzeme yüzeylerinde yatırılabilir. Bu çalışmanın sonuçları, metilasyon ve yerli kolajen succinylation hücreleri (Şekil 2) ile ilgili ultra ince kollajen matris, derlemeleri yatırmak için katman-katman tekniği kullanılabilir (Şekil 1) ve diğer yüklü polikatyonik ve polianyonik kolajen çözümleri oluşturmak göstermektedir Malzeme yüzeyler. Böyle ultr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content