Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Özet

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Özet

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Kültür Ortamı Antibiotics hazırlanması 1. ve 2- [2-nitro-4- (triflorometil) benzoil] -1,3-sikloheksandion (NTBC)

1. Uygun birimlere LB suyu (% 1 Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 NaCl, H _{2 O)} ve kısım sağlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayınız.
2. 100 ml LB agar (% 1 tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 0.25 _NaCl, H2 O% 1.5 ağar) 250 ml'lik şişelere sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. Agar tabak içine dökülmeden önce eritilir emin olun.
   Not: 4 plakayı verecektir LB agar 100 ml ihtiva eden şişeler. LB agar miktarı tayini için gereken levha sayısı uygun şekilde değiştirilebilir.
3. (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM _Na-2 HPO _4, 2 mM KH ₂ PO ₄₎ ¹⁶ PBS sağlayın. Oda sıcaklığında otoklav veya filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin.
4. Gentamisin antibiyotik stok çözümleri hazırlayın, kanamisin, bird tobramisin.
   1. P. uygun antibiyotik stok konsantrasyonları hazırlayın 100 mg / ml gentamisin, 30 mg / ml kanamisin ve 10 mg / ml tobramisin ihtiva eden aeruginosa suşu. 4 ° C'de su, filtre ile sterilize (0,2 um) ve deposunda antibiyotik çözülür. Çalışılan bakteriye bağlı antibiyotik ve konsantrasyonları değiştirin.
5. NTBC stok çözümleri hazırlayın. DMSO 400 ul NTBC 10 mg eritin. Bu 75,9 mM NTBC bir konsantrasyon elde edilir. -20 ° C'de saklayın NTBC stok çözümleri. Oda sıcaklığında çözülme çözümler gerektiği gibi.
   NOT: NTBC Farklı kaynaklardan çözünürlüğündeki farklılıklar var. Üreticinin önerilerine dayanan NTBC çözülür ve Adım 1.5 buna göre ayarlamak için hangi uygun araç belirleyin.

2. Bakteriyel Suşlarının NTBC Titrasyonları

1. Suşların kurmak gecede kültürleri test edilecek. 2 ml LB suyu 16 x 150 mm test tüpünü ekles (suş başına bir tane) ve her bir suş 1 izole koloni aşılamak. Bir hava kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator havalandırma ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Ertesi gün, LB suyu NTBC arasında titrasyonları hazırlar. Farklı suşları NTBC duyarlılık farklılıkları beri 0'dan 900 mcM NTBC bir başlangıç ​​aralığı kullanın.
   1. Suş başına 4 ila 5 test tüpleri (16 x 150 mm) 1 ml LB suyu ekleyin.
   2. Bir konsantrasyon aralığında test tüpleri (16 x 150 mm) NTBC stok solüsyonu (75,9 mM) eklenir. LB brot, 1 ml eklemek NTBC konsantrasyonları ve karşılık gelen hazır hacimleri için Tablo 1'e bakınız.
3. Gece boyunca kültürler OD ₆₀₀ ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD ₆₀₀ okuma almadan önce kültürleri yıkayın.
   1. 2 dakika boyunca 16.000 x g'de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Süpernatantı ve herhangi gevşek pelet hücreleri ile kaldırBir mikropipet ve 1 ml LB katı hücre pelletini
4. OD ₆₀₀ 0.05 titrasyon tüpleri inoküle edin. Tüpleri aşılamak için gerekli yıkanmış kültür miktarını hesaplayın.
   NOT: Bu olmamalı pyomelanin beri ekimlerde için yıkanmış kültürleri kullanın.
5. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C sıcaklıkta yaklaşık 24 saat için titrasyon inkübe edin.
6. Titrasyon tüpleri fotoğraf ve MIC ve oksidatif stres testleri için kullanmak NTBC miktarını belirlemek için içinde ve suşları arasında pigment üretimini karşılaştırın. Hücre içermeyen kültür süpernatanında pyomelanin miktarını belirlemek ve hücre yoğunluğu belirlemek için OD ₆₀₀ değerlendiriniz.
   Not: hücrelere kültür yüzey maddesinde pyomelanin OD ₆₀₀ oranı NTBC ile muamele edildikten sonra pyomelanin üretim farklılıkları ölçmek için hesaplanabilir.

3. Antibiyotik Asgari inhibitörlerinin96 oyuklu plakalar içerisinde edici Konsantrasyon (MİK) Deneyi

1. Suşların ayarlama gece boyunca kültürler ile NTBC olmadan LB içinde test edilmelidir.
   NOT: Bu protokol, 300 mcM NTBC temsilcisi seviyesini kullanarak tarif edilir. Kullanılacak NTBC uygun düzey Aşama 2,6 belirlenir.
   1. 2 ml LB 300 uM NTBC ekleme Herhangi bir NTBC durum için 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim.
   2. Steril kürdan kullanarak, bakteri, bir izole edilen bir koloninin Tüpleri inoküle. NTBC ile tek kültür ve her bir suş için NTBC olmadan tek kültür olacak. Havalandırma, bir kuluçka makinesi içinde bir doku kültürü rotator kullanılarak 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Ertesi gün, MIC tahlil kurmak için LB + NTBC ve LB + DMSO usta çözümleri yapmak. Aşı ilave edildiğinde, bu da 600 uM bir konsantrasyonda NTBC ekleyin 300 uM'lik bir nihai konsantrasyon verecek şekilde, iki kat seyreltilmiş olacaktır.
   1. Bir antibi test etmek içintek zorlanma, 2 ml LB 600 mcM NTBC ekleyebilir ve NTBC ana çözüm yapmak mix otik. 2 ml LB araç (DMSO), eşdeğer bir hacim ilave edin ve herhangi bir NTBC ana çözelti yapmak için karıştırın. Antibiyotik stok solüsyonları oluşturmak için hem de 96-yuvalı plakalar içinde bir seyreltme serisi ayarlamak için bu çözüm kullanın.
      NOT: Master çözüm formülasyonları pipetleme hataları hesaba ekstra bir çözüm sağlayacaktır. Test antibiyotik ve suşların sayısına bağlı olarak gerektiği gibi usta çözümleri yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir edilebilir.
3. LB + NTBC veya LB + DMSO usta çözümleri antibiyotik çözümler hazırlayın.
   Not: Bu çözeltiler antibiyotik konsantrasyonu iki istenen son konsantrasyonu olmalıdır. Yeterli çözelti 96 oyuklu bir plaka içerisinde dört gözeneğe 100 ul aktarma yapılmalıdır.
   1. Gentamisin +/- 64 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. 450 gentamisin stokunun 0.288 ul (100 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmakul LB + NTBC veya LB + DMSO ana çözüm.
      NOT: P. gentamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 32 ug / ml'dir.
   2. Kanamisin +/- 256 ug / ml NTBC stok solüsyonu olun. 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere kanamisin stokunun 3,84 ul (30 mg / ml) ekleyin, bu çözüm yapmak için.
      NOT: P. kanamisin maksimum konsantrasyon aeruginosa PAO1 128 ug / ml'dir.
   3. Tobramisin +/- 8 ug / ml NTBC stok çözelti hazırlayın. Bu çözelti yapmak 450 ul LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözümlere tobramisin stokunun 0,36 ul (10 mg / ml) ekleyin.
      NOT: P. İçin aeruginosa PAO1 tobramisin maksimum konsantrasyonu 4 ug / ml'dir.
      Not: Test edilecek bakteriler için antibiyotikler ve konsantrasyonlar ayarlanabilir.
4. Bir 96-yuvalı plaka içinde dört gözeneğe her 2x antibiyotik çözeltisinin 100 ul ekle. Exampl için satır A'da bu çözümleri yerleştirine, gentamisin A4 boyunca A1 yerleştirilmelidir, kanamisin A8 ile A5 yerleştirilmelidir ve tobramisin A12 ile A9 yerleştirilmelidir. Kurmak 96 oyuklu bir plakanın şeması için Şekil 1A bakınız.
   Not: Çoklu antibiyotik bir plaka olarak test edilebilir, ancak yalnızca tek bir suş başka türlerden gelen çapraz kirlenme ihtimalinin ortadan kaldırılması için plaka başına test edilmelidir.
5. 96 oyuklu plakanın H den satır B LB + NTBC ya da LB + DMSO ana çözeltisi 50 ul ekle. Bu bir tabak olun LB + NTBC ve bir tabak LB + DMSO olduğunu. Şekil 1A bakınız.
   1. LB + antibiyotiklerin NTBC LB + NTBC kullanın. LB + DMSO antibiyotikler için LB + DMSO kullanın.
6. Bir mikropipet pipet ipuçları değiştirmek, B. karıştırın çözüm satır satır A solüsyonu 50 ul aktararak antibiyotik iki kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek kullanarak ve satır B solüsyonu 50 ul transferi C. tekrarlayın satır remaining satırlar. Satır G sulandırarak sonra o satır ve artıklar gelen çözelti 50 ul çıkarın. Bakteriyel büyüme için hiçbir antibiyotik kontrol olarak satır H kullanın. Şekil 1B bakınız.
   NOT: G aracılığıyla her biri iyi satırlarda A şimdi 2X LB + NTBC veya LB + DMSO antibiyotiğin 50 ul nihai istenen konsantrasyon içerir. Satır H hiçbir antibiyotik LB + NTBC veya LB + DMSO içerir.
7. Gece boyunca kültürler OD ₆₀₀ ölçün. Medyada mevcut pyomelanin ortadan kaldırmak için OD ₆₀₀ okuma almadan önce tüm kültürleri yıkayın.
   1. 2 dakika boyunca 16.000 x g'de bir mikrosantrfuj kültür 1 ml santrifüj edilerek kültürleri yıkayın. Bir mikropipetöre ile Süpernatantı ve 1 ml LB hücre pelletini
8. LB içinde 2.75x10 ⁵ CFU / ml gecede kültürleri sulandırınız
   NOT: Bir OD ₆₀₀ adet P. 1x10 ⁹ CFU / ml eşdeğer olduğunu varsayalım aeruginosa. CFU / ml dönüşümleri OD d edilebilirDiğer bakteri ifferent.
9. Uygun kuyuya seyreltilmiş bakteri kültürü 50 ul ekleyin.
   Not: NTBC yetiştirilen kültürler DMSO içinde yetiştirilen NTBC ve kültürler DMSO ihtiva eden oyuklara ilave edilmelidir içeren oyuklara ilave edilmelidir. Şekil 1B bakınız.
   1. Her bir suş ve antibiyotik konsantrasyonu için üç kuyu bakteriler ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak hareket etmek dördüncü kuyuya LB 50 ul ekleyin. Şekil 1B bakınız.
   2. Boşlukların aşılanması için çok kanallı bir micropipettor kullanın. Komşu kuyuların kirlenmesini önlemek için inokulum eklerken ipuçları kuyuların dibine yakın olduğu pipet olun.
      NOT: kuyulara bakteri kültürü eklemek antibiyotik ve NTBC yoğunluklanyla iki kat sulandırmak olur.
10. Parafilm, 96 gözlü levhalar kapatılır ve 37 ° C'de yaklaşık 24 saat inkübe edilir. Bir hava kuluçka makinesi içinde, statik 96 oyuklu inkübe edin.
11. Incelemekkuyularda bakteriyel büyüme için plakalar. MIC bakteriyel büyüme her suşun her üç kopya için görülebilir olduğu en düşük antibiyotik konsantrasyonu.
    1. Görme büyüme için plaka incelemek veya _{OD 600} plaka okuyucu seti kullanarak okuyun.

Oksidatif Stres Tepki için 4. Nokta Plaka Testi

1. Aşama 3.1'de tarif edildiği gibi suşların ayarlama gece boyunca kültürler NTBC LB ve olmaksızın test edilecek.
2. Sonraki gün, bir oksitleyici zor olarak _{H2O 2} ihtiva eden LB agar plakaları hazırlamak. 0 ila 1 mM, H bir dizi ₂ O ₂ konsantrasyonları için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.
   1. LB agar şişeler eritin. Oda sıcaklığında, yaklaşık 50 ° C'ye soğutun ortam.
   2. Arzu edilen konsantrasyonlarda soğutuldu ortam doğrudan O ₂ H ₂ ekleyin. Girdap şişeler karıştırın. H konsantrasyonları için Tablo 2'ye bakınız ₂ O ₂ve konsantre _H 2 O 2 hacimleri ekleyin. Bu değerler, LB agar 100 ml dayanmaktadır.
   3. Hemen kabarcıklarını çıkarmak için _H 2 O ₂ ve alev yüzeyi ekledikten sonra plakaları dökün. Verim LB agar 100 ml başına 4 plakalarının. H _{2 O 2} konsantrasyonu ile plakaları işaretleyin.
   4. Plakalardan fazla nemi çıkarmak için 30 dakika boyunca çalışan fan ile biyolojik akış kaputu ele tabak yerleştirin.
      NOT: tabak onlar hazırlanır aynı gün kullanın. Bunu yapmamak tutarsız verileri neden olabilir.
      NOT: paraquat oksidatif stres, bu _tahlilde, H2O ₂ ikame edilebilir. Diğer oksidatif stres için kullanılan _{konsantrasyonlar,} H2O ₂ için kullanılanlardan farklı olabilir.
3. Yıkayın ve adım 3.7'de açıklandığı gibi OD gecede kültürlerin ₆₀₀ ölçün.
4. Bütün gece boyunca cu _OD 600 Normalesuşları seti için en düşük değere ltures denenmektedir. P. aeruginosa genel LB + NTBC ya da LB + DMSO içinde gece boyunca büyütülmüştür, yaklaşık 2.5 OD ₆₀₀ yer alır.
   1. 1 ml 'lik bir toplam hacim içinde düşük OD ₆₀₀ kültürün seyreltilmesi için ihtiyaç duyulan kültür hacminin belirlenmesi. Bir kültür OD 3 ₆₀₀ ve suşlar grubu için en düşük OD ₆₀₀ yer alır, örneğin, 2.5 olan aşağıdaki hesaplamayı gerçekleştirmek: (2.5) (1 mi) = (3) (x). x = 0.833 mi. Kültür 0,833 ml kadar bir mikrofüj tüpüne yerleştirilir.
   2. 1 ml kültür hacmi getirmek için gerekli LB + NTBC (300 uM) ya da LB + DMSO miktarını hesaplayın. Aşama 4.4.1 Örneğin, LB + NTBC ya da LB + DMSO miktarı 0,167 ml (- 0,833 ml kültür, 1 ml toplam hacim) olacak kültüre ilave edildi. LB + NTBC ve LB + DMSO stok çözeltileri, tüm suşları seyreltilmesi için gerekli hacme dayanarak bu dilüsyonları için kullandığınızdan emin olun.
   3. Kültür ve LB + N MixVorteks TBC veya LB + DMSO.
5. NTBC veya DMSO sabit bir konsantrasyonda kültürleri korumak için, PBS + NTBC veya PBS + DMSO normalize gece boyunca kültürler on kat seri dilüsyonları gerçekleştirmek.
   1. PBS + NTBC ve PBS + DMSO stok çözümleri olun. Bir suşu için seyreltileri bir set için, 720 ul bir toplam hacim elde etmek üzere 300 uM NTBC veya PBS ile eşdeğerli bir DMSO hacmi karıştırın. Test kaç suşları bağlı yukarı veya aşağı bu stokları Scale.
   2. 10 ^-7 seri seyreltme ile 10 ^-1 Label mikrofuge'de tüpleri. Uygun tüplere PBS + NTBC veya PBS + DMSO 90 ul ekle. LB + NTBC yetiştirilen suşları için PBS + NTBC kullanımı ve LB + DMSO içinde yetiştirilen suşları için PBS + DMSO kullanılır.
   3. Uygun 10 ^-1 seyreltme tüp kültür 10 ul ekleyin. Vorteks karıştırın ve 10 ^-2 seyreltme tüpüne 10 ^-1 seyreltme 10 ul aktarın. Tüm seyreltmeler perfo olmuştur kadar tekrarlayınonaylanmamis. Seyreltilerde arasındaki pipet ipuçları değiştirin.
6. Her bir suş için kopya halinde LB + H _{2 O 2} plakaları üzerinde 10 ^-7 seyreltileri 10 ^-3 Spot 5 ul. Noktalar kaplanır, en az seyreltilmiş (10 ^{-7 -3} 10) sulandırmak itibaren bir pipet ucu kullanın. İpucu veya sıvı plakasına kuruyana kadar plaka eğmeyin.
7. Suşuna bağlı olarak 37 ° C'nin (hava kuluçka makinesinde) de 24-48 saat süreyle inkübe edin.
   NOT: P. aeruginosa PAO1 inkübasyon 24 saat sonra LB iyi ölçekli koloniler olacaktır. Bunlar koloniler PAO1 ile yaklaşık olarak aynı boyuta sahip olana kadar suşları inkübe edin.
8. Bir transluminator üstünde bir CCD kamera kullanarak plakaları fotoğrafını. İsteğe bağlı olarak, aynı boyutta aksine ve ekme için fotoğraflarınızı düzenleyebilir. Oksidatif strese duyarlılık değişiklikleri belirlemek için her yerde koloni sayısını sayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

NTBC titrasyonları

NTBC P. pyomelanin üretimini azaltmak mümkün olsaydı NTBC titrasyonları belirlemek için kullanıldı aeruginosa ve aynı zamanda ortadan kaldırır ya da ek tahlillerinde kullanım için üretim pyomelanin azaltır NTBC konsantrasyonunu belirler. Farklı tekrarlamalı üretilen pyomelanin seviyelerindeki varyasyonlar olabilir, ama genel eğilimler sabit kalabilir. NTBC titrasyon testi, diğer bakterilerde pigment üretiminin etkileyebilecek diğer ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.