JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Özet

Organotipik kültürlerinin fonksiyonu ve in vivo doku meslektaşları fizyolojisini taklit hücre-hücre teması ve hücre-matriks etkileşimlerinin önemli bir 3 boyutlu bir ortamda tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu sadakatle epidermal farklılaşma ve tabakalaşma programı özetlediği Organotipik cilt kültürler tarafından örneklenmiştir. Birincil insan epidermal keratinositler genleri kolayca aşırı veya aşağı çalınabilecek retrovirüslere yoluyla genetik olarak manipüle vardır. Bu genetik olarak değiştirilmiş keratinositler daha sonra genetik yollar, darbe epidermal büyüme farklılaşmasını ve hastalığın ilerlemesini araştırmak için güçlü bir model sağlanması Organotipik bir deri kültürlerinde, insan epidermisi yeniden oluşturmak için kullanılabilmektedir. Burada sunulan protokoller cansız insan dermiş hazırlanması hem de genetik olarak Organotipik bir deri kültürü oluşturmak için primer insan keratinositleri işlemek için yöntemleri tarif eder. Rejenere insan deri downstr kullanılabilirBöyle gen ifade profilleme, immün ve yüksek verimlilik sıralaması takip kromatin İmmüno olarak eam uygulamaları. Bu nedenle, bu genetik olarak değiştirilmiş organotipik cilt kültürlerin nesil cilt dengesini sağlamaya yönelik kritik genlerin belirlenmesini sağlayacaktır.

Giriş

İnsan üst deri değil, aynı zamanda korumak için savunma bir birinci hattı olarak nem kaybını önlemek için sızdırmaz bir bariyer olarak hizmet eder bazal membran zone.The epidermis olarak bilinen hücre dışı bir matris boyunca yatan dermiş bağlanan bir tabakalı epitelyumdur yabancı ve zehirli maddelerden 1 vücut. Epidermisin derin katmanı bazal tabaka, epidermis 2 kalanını oluşturan farklılaşmış döl doğuran epidermal kök ve progenitör hücreler içerir. Epidermal progenitör hücrelerin ayırt olarak bunlar Spinoz tabakanın 3 olarak da bilinir farklılaşmış hücrelerin birinci tabakayı oluşturmak üzere yukarı doğru göç eder. Spinöz katmanda, hücreler daha sonra epidermis farklılaşmış katmanları fiziksel strese dayanma gücünü sağlayan keratinlerden 1 ve 10 ifadesi, açın. Spinöz tabaka hücreleri daha farklılaştırmak, onlar için epidermisin yukarı hareketplazma zarı altına monte edilir keratohyalin ve lameller granül oluşumunun yanı sıra, yapısal proteinlerin karakterize granüler tabaka m. Hücreler farklılaşma sürecinde devam ederken katmanlı granüller zengin koruyucu stratum corneum adı verilen bir lipidi 4 oluşturmak için hücreler ekstrüde edilirken, plazma membranı altından proteinleri birbirine çapraz bağlı bulunmaktadır.

Epidermal büyüme ve farklılaşma etkisi ~ nüfusun 5% 20 değişiklikleri içeren hastalıklar. Bu durumda, bu işlemin mekanizmalarının anlaşılması önem taşımaktadır. Bu hastalıkların birçoğu tezahürü hücre-hücre veya hücre-matris temas etmesine bağlıdır, insanın epidermisin 3 boyutlu bir ortamda yeniden oluşturulur Organotipik kültürler 6-10 oluşturuldu. Bu yöntemler, tipik olarak, cansız insan gibi hücre dışı matrisin üzerine ekildi primer ya da dönüştürülmüş keratinositlerin kullanılmasını içerirDermiş, Matrigel veya kollajen.

Epidermal büyüme ve farklılaşmasında önemli bir gen düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, genetik olarak keratinositler 2B kültür genleri demonte veya aşın ifade etmek üzere retroviral vektörler ile işlenmesi ve sonra 3D içinde yeniden edilebilir. Bu yöntemler, neoplazi 11-21 epidermal kök ve projenitör hücre kendini yenileme ve farklılaşma gibi ilerlemesinde rol oynayan genleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, retrovirüsler kullanımı yoluyla epidermal organotipik kültürlerinin gen ekspresyonunu değiştirmek için nasıl derinlemesine bir protokolü temin edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Insan derisi protokolü California Üniversitesi, San Diego'nun Araştırma Etik Kurulu kurallarına uygun olarak gerçekleştirildi. İnsan derisi atılır cerrahi örneklerden elde edilen ya da (cilt banka Malzeme / Ekipman Tablo listelenen) deri bankalardan satın alınabilir. Deri veya verici yaşı türetilmiştir Yer deney sürece dermişte bazal membran bölgesi proteinleri (kollajen / laminin) için kritik değildir bozulmuş değildir.

Güçsüz insan derisi hazırlanması 1.

  1. İnsan cildi aldıktan sonra, (~ 3-5 dakika) Çözülme doku kültürü kaputu doku yerleştirin. Cilt boyutuna bağlı olarak, steril bir tek 50 ml konik bir tüp ya da 125 ml şişe çözülmüş doku yerleştirin. Cilt bankadan cildin tipik boyutu 0.75 feet kare olduğunu.
  2. 1x PBS içinde 4x penisilin ve streptomisin (pen / strep) ile% 75 tam doldurun. Kuvvetli bir şekilde çalkalanır5 dakika ve sıvı atmayın. Bu adımı 3 kez daha tekrarlayın.
  3. Son yıkamadan sonra, yeni bir tüp / şişe doku transferi ve kabın% 75 doldurmak için taze 4x pen / strep / PBS ekleyin. 2 hafta epidermis, dermiş ayrılmasını sağlamak için, 37 ° C 'de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde, bu karışım inkübe edin.
  4. Steril koşullar altında, epidermis, dermis uzak soymak için forseps kullanabilir. Epidermis donör (Şekil 1A) yarış bağlı renklendirme sahip olurken dermis tamamen beyaz. İnsan dokusu ile başa çıkmak için kurumun protokolüne göre epidermis atın.
  5. Bir tüp veya şişe dermis yerleştirilir ve (4 kez 5 dakika yıkama) karışımı içinde çalkalanarak 1 x PBS içinde seyreltilmiş 4x pen / strep yıkayın. Son yıkamadan sonra, kullanıma hazır olana değin 4 ° C'de 4x pen / 1x PBS içinde seyreltilmiş strep ve mağaza yeni bir tüp / şişeye dermis aktarın. Dermis bir yıla kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

2. Genetik değiştirme İlköğretim İnsan Keratinositler

Not: primer insan keratinositleri enfekte virüs üretmek için tam DMEM ortamı [DMEM +% 10 fetal bovin serumu (FBS) + pen / strep] yetiştirilen kullanımlar amfotropik Phoenix hücreleri. Bu tür gag-pol ve zarf gibi proteinleri kodlayan viral paketleme genleri sabit şekilde bir retroviral vektör ile transfekte, virüs üretimi sağlar Phoenix hücre genomu içine entegre edilir. Phoenix hücreleri yüksek verim, yüksek viral titre üretimi için izin ile transfekte edilebilir. Bu paketleme hattı üretilen virüs aynı zamanda, insan da dahil olmak üzere memeli hücreleri büyük bir çeşitlilik bulaşabilir.

  1. Gün 1: Transfeksiyondan bir önceki gün, tam bir DMEM ortamında oyuk başına 800,000 hücrelik bir yoğunlukta 6-çukurlu plaka içindeki tohum Phoenix hücreleri.
  2. Gün 2: Transfeksiyon gün 3 retroviral vektörler ug oyuk başına kullanımı. 1.5 ml tüp içine retroviral vektör alikosu 3 ug. 100 mikron bir karışımını kullanınl DMEM artı vektörün her 3 ug için transfeksiyon reaktifi 6 ul. 1.5 ml bir tüp içinde 100 | il DMEM ile transfeksiyon reaktifi 6 ul karıştırın. (Kullanılan retroviral vektörler ekipman / malzeme tabloda listelenmiştir).
    1. 5 dakika boyunca inkübe ve retroviral vektörün 3 ug ihtiva eden ön aliquoted tüpe 106 ul karışımı ekleyin. Karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Phoenix hücrelerinin her oyuğuna, bu tüm karışım damla damla ekleyin.
  3. 3. Gün: Transfeksiyondan bir gün sonra, anka hücrelerinden ortamını çıkarın ve taze tam DMEM medya 2 ml ekleyin. Aynı gün, oyuk başına 75,000 hücrelik bir yoğunlukta 6-çukurlu tabak içine primer insan keratinositleri tohum. Antibiyotik, bir keratinosit, serum barındırmayan ortam (KCSFM) (pen / strep) 'de keratinositler tutun.
    NOT: Birincil insan keratinositler satın alındı. Hücreler (Malzeme / Ekipman tabloda listelenmiştir) satıcılarının çeşitli satın alınabilir.
  4. 4. Gün: HarŞimdi viral partikülleri içeren transfekte anka hücrelerinden, medya yelek. Bir şırınga kullanılarak, 0.45 um'lik bir filtreden geçirin ortamı (herhangi bir kirletici Phoenix hücreleri çıkarmak için) ve keratinositler üzerinde 2 mi yer (önceki gün / oyuk 75.000 hücre yoğunluğunda kaplanmıştır: adım 2.3). Enfeksiyon sürecine aracılık yardımcı ortama heksadimetrin bromür (5 ug / ml) eklenir. Virüs titrleri ~ 1 x 10 7 TU / ml.
    1. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 200 xg'de santrifüj 6 oyuklu plakalar dönerler. Spin sonra, virüs içeren ortamı çıkartın ve KCSFM eklemeden önce 1x kez PBS ile yıkama hücreleri.
  5. 5. Gün: tekrar adım 2.4 gibi keratinosit aynı toplu Infect.
    NOT: retroviral vektör üzerinde seçilebilir bir marker olması durumunda, bir ilaç kullanan keratinositleri seçip alt analiz veya organotipik kültürlerinin gibi uygulamalarda kullanım için genişletme.

3. Organotipik Cilt Kültürler Kurma

  1. Inşa etmekOrtak laboratuvar bulunan malzeme veya kasetlerden Organotipik kaset özel bir metal imalat dükkanı aracılığıyla yapılabilir (Şekil 2A - F). 3,5 cm doku kültür plakasının bu kasetleri yapmak için, bir 3,5 cm'lik bir tabak (Şekil 2A-B), kapağın merkezi bir 1,0 cm x 1,0 cm kare kaldırmak için bir koterizasyon kullanın. Steril koşullar altında bunu yapın.
    1. Net oje (Şekil 2C) kullanarak kaset (3.5 cm çanak kapak) alt kare mandal takın. Oje için 5 dakika kurumasını ve kare mandal (Şekil 2B) dayanan böylece kaseti ters çevirin izin verin. 6 cm çanak içine kaseti yerleştirin.
      NOT: Kare sanat ve zanaat mağazalar çeşitli satın alınabilir mandal.
  2. Keratinosit büyüme ortamı% 66 DMEM,% 22 Ham F12, 100 birim / ml penisilin / ml streptomisin,% 10 FBS, 2.67 ug / ml adenin 100 ug, 40 n oluşan (KGM) hazırlayınug / ml hidrokortizon, 10 ng / ml, kolera toksini, 4.94 / ml insülin ug, 5 ug / ml transferrin, 1.36 ng / ml triiyodo-L-tironin, 10 ng / ml EGF ve 10 ng / ml, siprofloksasin hidroklorür. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden medyayı Filtre.
  3. 4x pen / strep + PBS çözeltisi üzerinden dermis alın ve KGM içinde 2 kez yıkayın ve daha sonra kullanımdan önce iki gün boyunca 37 ° C'de inkübe KGM.
  4. 1,5 cm x 1,5 cm büyüklüğünde parçalar bir neşter kullanılarak dermis kesin ve sonra organotipik kaset üzerine yerleştirin. Yukarı bakacak şekilde dermis üst dermis yerleştirin. Dermis üst keratinositleri (Şekil 1B) ile temas durumuna gelir tarafında olacaktır.
  5. (Şekil 3A) yukarı bakacak şekilde dermis üst tarafı ile organotipik kaset kare delikten üzerine önceden kesilmiş dermis yerleştirin.
  6. Forseps kullanarak üzerinde dermis içeren tüm organotipik kaseti (Şekil 3B Çevir). Buz üzerinde hücre dışı matris çözümü çözülme. Kaset başına hücre dışı matriks solüsyonu 100 ul dışarı çekmek için bir iğne ve şırınga kullanın. Dermis (parlak tarafı) altına 5 damla ekleyin ve dermis (Şekil 3B) boyunca eşit dağılımını sağlamak için hafifçe sallayın.
  7. Ticari ekstra hücresel matris çözümü için 5 dk tamamen (Şekil 3C) sağlamlaştırmak için izin verin. Katılaşma sonrasında geri üzerinde kaseti çevirmek için forseps kullanabilir. 6 cm çanak KGM 4 ml ekleyin.
  8. Dermis (Şekil 3D) içeren organotipik kasetler üzerine 0,5-1.000.000 genetiği değiştirilmiş keratinositler yerleştirin.
    1. 5 dakika boyunca 10 cm plakalar üzerine% 0.05 tripsin 4 ml yerleştirilmesi ve tam bir DMEM ortamı, 4 ml ile söndürün ile Trypsinize keratinositler.
    2. Hemasitometre kullanarak keratinositleri sayın ve sonra 5 dakika boyunca 200 xg'de aşağı doğru döndürün. Yeniden süspanse 0,5-1000000 hücreleri 90 μ yılında (mevcut hücre sayısına bağlı olarak)ve KGM l dermis üzerine tüm hücreleri koyun.
      Not: Bu, yeniden oluşturulmuş epidermisin kalınlığı görülen farklılık hücre sayısı başlangıç ​​farklılıklara bağlı olmadığından emin olmak için, aynı deney içinde deri üzerinde aynı sayıda hücre yerleştirilmesi önemlidir. Dermis üzerinde az 0,5 milyon hücre yerleştirilmesi yoksul tabakalaşma ve farklılaşma yol açabilir.
  9. Her geçen gün organotipik kültürleri KGM ortamı değiştirin. Hasat doku dermis üzerinde keratinosit yerleştirildikten sonra 1-14 gün. Epidermis tam tabakalaşma ve farklılaşma genellikle gün 5 sonra ortaya çıkar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Organotipik insan cildi üreten ilk adım epidermis, dermis kaldırmaktır. 37 ° C 4x pen / strep / PBS derinin iki haftalık kuluçka epidermis (Şekil 1A), dermiş ayrılmasını sağlamak gerekir. Epidermis ve dermis ayıran zorsa o zaman bir hafta 4x kalem / strep 37 ° C / PBS de doku yerleştirin ve sonra tekrar soyulması forseps kullanarak deneyin.

Devitalize dermis insan epidermis yenileyici anahtarlarından biri keratinositler dermis doğru tarafına yerleştirili...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Organotipik kültürler birçok avantaj sunan insan derisinde Genetik manipülasyon yaygın 2B kültür hücreleri yanı sıra fare modelleri okudu etmek. 2B kültürleri sağlam organ ve dokularda bulunan üç boyutlu bir hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris etkileşimlerine yoksundur. Son çalışmalar da 16 tümörler birincil insan derisine çok daha fazla gen ifadesi benzerlikleri gösteren 3D kültür hücreleri ile 2D ve 3D kültür cilt kanseri hücreleri arasındaki muazzam farklar bulduk. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

We have nothing to disclose.

Teşekkürler

Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği Araştırma Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) ve CIRM Temel Biyoloji Ödülü (RB4-05779) supportedby oldu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Human skinNew York Firefighters Skin Bankhttp://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREPGIBCO15140-122
amphotropic phoenix cell linesATCCCRL-3213
FUGENE 6 transfection reagentPromegaE2691
Keratinocyte Media (KCSFM)Life Technologies17005042
DMEMGIBCO11995
Ham's F12Cambrex12-615F
FBSGIBCO10437-028
AdenineSigmaA-9795
Cholera ToxinSigma C-8052
HydrocortisoneCalbiochem3896
InsulinSigmaI-1882
EGFInvitrogen13247-051
Transferrin SigmaT-0665
Ciprofloxacin HydrochlorideSerologicals89-001-1
cauteryBovie Medical CorporationAA01
MatrigelCorning354234
Keratin 1 antibodyBiolegendPRB-149P
square pegsArts and crafts stores
human neonatal keratinocytesATCCPCS-200-010
human neonatal keratinocytesCell Applications102K-05n
MSCV retroviral vectorClontech634401
LZRS retroviral vectorAddgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vectorOligoengineVEC-PRT-0002 
hexadimethrine bromide SigmaH9268-5G

Referanslar

  1. Tadeu, A. M., Horsley, V. Epithelial stem cells in adult skin. Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).
  2. Sen, G. L. Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions. FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).
  3. Segre, J. A. Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders. J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).
  4. Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. Transglutaminase function in epidermis. J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).
  5. Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation. Trends Genet. 29, 31-40 (2013).
  6. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).
  7. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).
  8. Khavari, P. A. Modelling cancer in human skin tissue. Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).
  9. Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).
  10. Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. J Invest Dermatol. 133, e14(2013).
  11. Sen, G. L., et al. ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation. Dev Cell. 22, 669-677 (2012).
  12. Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3. Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).
  13. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells. Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).
  14. Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes. Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).
  15. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493, 231-235 (2013).
  16. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).
  17. Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome. Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).
  18. Kretz, M., et al. Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev. 26, 338-343 (2012).
  19. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).
  20. Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes. Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).
  21. Jameson, K. L., et al. IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors. Nat Med. 19, 626-630 (2013).
  22. Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes. Genomics data. 4, 43-46 (2015).
  23. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  24. Doebis, C., et al. Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering. Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).
  25. Melo, S. P., et al. Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant. Mol Ther. 22, 725-733 (2014).
  26. Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector. Stem cell res ther. 4, 127(2013).
  27. Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue. Nature. 463, 563-567 (2010).
  28. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
  29. Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).
  30. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 106organotipikderigenetikRNA giri imretroviral overekspresyonukeratinositlerfibroblastlardermisepidermisiletimicilt yap larok katl epitelepiteldermatolojiSNAI2mezenkimal ge i epitel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır