Su Yoksunluk, Sakarin Fading veya Genişletilmiş Erişim Eğitim olmadan Sıçanlarda Etanol Güçlendirme Özelliklerinin Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Özet

Bu protokol, hızlı bir şekilde su kısıtlaması veya yanıt başlatmak için solmaya sakarin / sukroz gerektirmeyen standart yöntemlere aksine, sıçanlarda etanol yanıt işlerlik başlatmak için yeni ve etkili bir yöntem tarif eder.

Özet

Operant Oral kendi kendine uygulama yöntemleri arasında yaygın olarak, hayvanlarda etanol takviye edici özelliklerini incelemek için kullanılır. Ancak, standart yöntemler sıçanlarda yanıt işlerlik başlatmak için sakarin / sakaroz solmasını, su yoksunluğu ve / veya genişletilmiş eğitim gerektirir. Bu yazıda hızla deneyci için uygundur ve bu nedenle etanol edimsel öz-yönetim çalışmalarında tatlandırıcıların kullanılmasının potansiyel şaşırtmak ortadan kaldırarak, su yoksunluğu ya da sakarin / sakaroz solmasını gerektirmez etanol yanıt işlerlik başlatmak için yeni ve etkili bir yöntem açıklanır. Bu yöntem ile, tipik haliyle Wistar fareleri kazanmak ve eğitim en az iki hafta içinde% 20 etanol solüsyonu kendi kendine verilmesini sağlamak. Bundan başka, kan etanol konsantrasyonu ve ödülleri olumlu bir 30 dakika kendini yönetim oturumu için ilişkilidir. Ayrıca, naltrekson, gösterilmiştir alkol bağımlılığı için bir FDA onaylı ilaçlar etanol kendini idare bastırmakkemirgenlerde, doza bağımlı böylece sıçanlarda alkol takviye özelliklerini incelemek için bu yeni yöntemin kullanılmasını doğrulayarak, sıçanlar kendini yönetme% 20 etanol için alkol tüketmek, alkol alımını ve motivasyon azalır.

Giriş

uyuşturucuların güçlendirici etkilerini incelemek için hayvan modellerinin geliştirilmesi, insan uyuşturucu bağımlılığı incelemek için önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Daha spesifik olarak, edimsel öz-yönetim bir ağızdan tüketilen etanol çözeltisi olumlu takviye etkilerini değerlendirmek için en etkili araçlardan biridir yaygın olarak kullanılan davranış modelidir. Böyle bir modelin geliştirilmesine ile erken sorun büyük kemirgenler için etanol yüksek konsantrasyonlarda birincil caydırıcı tat, aynı zamanda alkol ¹ ile az veya hiç deneyimi olan insanlarda paylaşılan bir fenomen oldu. Bu engeli aşmak için bir standart protokol su yoksunluğu gerektirir ve / veya sakarin veya sakaroz edinimi ve öz-yönetim bakımı için solma. Bununla birlikte, bu iki yaklaşım avantajlı değildir. Onlar sadece etanol için yanıt başlatmak ve satın alma göreli bir başarı oranını elde etmek için eğitim uzun süre gerektirir. tatlandırıcıların kullanımı da potansiyel bir önyargı tanıttıöz-yönetim verilerinin yorumlanması. Bu kısıtlamalar aşağıdaki protokole için geçerli değildir.

Kısaca, Samson ve arkadaşları ^2% 20 sükroz tatlı çözeltisi içinde etanol içinde eritilmesi ve daha sonra eğitim 4 hafta boyunca tatlılık solmaya su içinde% 10 etanol için yanıt başlatmak için gerekli olduğunu göstermiştir. Ayrıca güvenilir etanol alımı, genellikle 6 ila 8 hafta ^1-3 elde edilir. Bu yaklaşım son derece sorunludur. Araştırmacılar etanol öz-yönetim ölçmek için başlamadan önce ilk olarak, eğitimin uzun süreler gerektirir. Gıda sınırlı hayvanlarda gıda sunma kolu üzerinde ilaç öncesi eğitim 1 gün ve ilaç için kararlı bir yanıt genellikle 10 elde edilir - - Buna karşılık, kokain veya eroin intravenöz kendi kendine uygulama 0 gerektirir 12 gün ^4,5. Bu yöntemin diğer bir sınırlama sakarin ve sükroz farelere son derece faydalı olan ve beyin aktivasyon örüntüleri s ortaya gerçektirböylece etanol kendini yönetiminde karıştırıcıların potansiyelini tanıtan kötüye ilaçlara imilar, ^6-9 inceler. Nihayet, başarısız elde edilmesi ve / veya yetersiz yanıt oranı sürekli olarak deneyler dışında sıçan önemli bir oranda elde edilmesi ile yanıt oranı ^1,10, bu yöntem, değişkenlik göstermesi kullanarak bir etanol çözeltisi, kendi kendini idare elde sıçan.

Buna karşılık, bu protokol ile, biz satın alma ve su yoksunluğu, sakaroz / sakarin solma veya genişletilmiş erişim eğitimi gerektirmeyen su çözeltisi içinde% 20 etanol oral öz-yönetim bakımı için basit ama etkili bir yöntem mevcut. Son zamanlarda soruşturma sözlü etanol bu öz-yönetim, böylece bizim experim% 20 etanol solüsyonu seçmek için bir gerekçe sağlayan bir% 20 etanol konsantrasyonda öz-yönetim sırasında en yüksek etanol alımı ile bir ters U şeklinde bir doz-yanıt eğrisini görüntüler bulunduental tasarım ^11.

Protokol

Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım NIH Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmektedir.

1. Hayvan Bakım ve Konut

1. bir ters 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü ile bir sıcaklıkta (21 ° C) ve nem kontrollü ortamda çiftler halinde varış 225 gr - kolonide girişte ev erkek Wistar rat 200 ağırlığında.
   Not: Deney mantığı bağlı olarak, fareler, tek yerleştirilebilir.
2. sıçanlar bir deney başlamadan önce en az bir hafta süreyle vivari ve ışık döngüsü ACCLIMATE ve günlük bunları işlemek için izin verin. haftada hayvanlar tartılır.
3. Sıçanlar chow ve deney süresi boyunca musluk suyu ücretsiz erişim verin (su yoksunluğu ¹² yanıt başlatmak için gerekli değildir). Karanlık bir test odasında ışık-karanlık döngüsü karanlık aşamasında tüm davranışsal testi yapmak.
   Not: rutin genç erişkin erkek Wistar sıçanlar (doğum sonrası gün 62-65) kullanmasına rağmen, bu protocol teorik diğer farelerin suşları, hem de hareket ve / veya yaş farkları araştırmak için uygun olabilir.

2. Edimsel Eğitim

1. 30.5 × 29.2 × 24.1 cm boyutlarında ve yatak takımları ile kaplı ızgara zemin ve atık tava içeren özdeş edimsel odaları tüm davranışsal eğitim ve testlerini havalandırma fan ile donatılmış ses azaltıcı kabinleri yer, (koku ipuçlarını azaltmak için hayvanlar arasında değişti) .
   Not: Sıçanlar eğitim gün 1 edimsel-klima tarafından eğitilmiş + 1 saat ve karanlık döngüsünün + 8 saat arasında (bir kolu üzerinde bir yanıt güçlendirici elde etmek için gerekli olan). Alkol eğitim öncesi alkol, ne de yiyecek veya sıvı şekillendirme hiçbir temas öncesi vardır.
2. uyarıcı ışıklar, şırınga pompaları ve sıvı fincan yuvasına yanal konumlandırılmış iki geri çekilebilir kolları her edimsel odasına donatmak. Uygun yazılım kullanarak bir bilgisayar tarafından Arayüz odaları ve kontrol.
   Not:Çoğu satıcıları odalarına kontrol etmek için gerekli öz-yönetim tüm gerekli bileşenleri içeren paketleri yanı sıra yazılım ve arayüzleri sağlayacaktır.
3. üreticinin talimatlarına göre% 20 etanol takviye sabit oranı (FR) programı (bir tepki sadece yanıtların belirli bir sayıdan sonra takviye edildiği bir edimsel zamanlama) başlatır bir operant şartlandırma programı yazın. Örneğin, sabit oran 1, fareler, bir güçlendirici (a FR1 programının bir örnek için ek kod dosyaları bölümüne bakınız) elde etmek için bir yanıt elde etmek gerekir. Aşağıdaki komutları yürütün.
   1. oturumun başlamasını kutlamak ve alkol durumunu bildirmek için iki kolu uzatın.
      etanol (aktif) ile ilişkili kolu üzerinde bir kolu basın iyi içme komşu su içinde% 20 etanol 100 uL hacmi teslim tarafından ödüllendirilir ve sesiyle eşlik eden 5-s zaman aşımı süresini başlatır: Not aydınlatmakolu üzerinde işaret ışığı. cue-ışık eğitimin 1 gün tanıtıldı.
   2. hiçbir planlanmış sonuçları olmasına rağmen zaman aşımı süresince, rekor yanıt. Diğer kolu (inaktif) Tutanak yanıtları davranışsal sonuçlara yol asla rağmen. Not: aktif kolu spesifik olmayan davranışını değerlendirmek için bir kontrol olarak işlev görür.
   3. aktif kolu (yanıt oranları) ve kazanılan% 20 etanol ödülleri sayısına yanıtların numarasını kaydedin.
   4. 30 dakika geçtikten sonra, oturumun sonuna sinyal ve alkol durumu sonuna sinyal iki kolu geri çekin.
   5. Kaydet ve tüm verileri arşivlemek.
4. eğitim oturumu başlamadan önce, her edimsel odasında tüm cihazların düzgün işleyişini (geri çekilebilir kolları, sıvı dağıtıcı) kontrol edin.
5. 190 derece (% 95), musluk suyu içinde seyreltilmiştir, etanol% 20 h / h etanol çözeltisi hazırlayın.
   Not: Etanol çözeltisi, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. bağlıüreticiye, stok etanol çözeltileri kadar 99.98% olabilir. Ayrıca en çok yayınlanan yazılarda, etanol konsantrasyonları genellikle hacim / hacim olarak sunulmaktadır ederken, bazı ağırlık / hacim olarak sunabilir, unutmayın.
6. % 20 etanol çözeltisi ile şırınga doldurun ve infüzyon hatlarında hiçbir sızıntı veya hava kabarcıkları vardır emin olun. El ile etanol doğru ilk güçlendirilmiş yanıtı prize teslim edilecektir emin olmak için infüzyon hatlarıyla etanol küçük bir hacim itin. Bir kağıt havlu ile kurulayın kabını ve oturumu başlamadan önce boş olduğundan emin olun.
7. % 20 etanol takviye FR programı kontrol eden yazılım yükleyin
8. Bir FR1 programı altında tren operant- ve ilaç-naif fareler 30 dakika oturumları sırasında su yoksunluğu olmadan% 20 etanol kendini yönetmek.
   1. Bir taşıma kafesi kullanarak test odasına vivari sıçanları taşıyın.
   2. bir odaya her sıçan atayın.taşıma kafesinden her sıçan alın ve atanan öz-yönetim odasına koyun.
   3. Her gün tutarlı deney şartlarını tutmaya çalışın. Bu nedenle, her zaman, her gün aynı öz-yönetim odasında kabaca aynı zaman fareleri test edin.
   4. % 20 etanol takviye FR1 programı başlatır yazılımını başlatın.
   5. Oturumun sonunda, öz-yönetim odalarından fareler kaldırmak ve vivari onları geri.
   6. sırayla el alkol solüsyonu hayvanlar tarafından tüketilen onaylamak için, bir kağıt havlu kullanın ve kap kurutulmuş olup olmadığını kontrol edin. Seçenek olarak ise, 1 ya da 2 mL bir şırınga kullanın ve tüketilmediği hacmini tahmin etmek için deponun kalan sıvı toplamak.
      daha kesin bir ölçüm için (ama aynı zamanda daha pahalı), yalamak kesin sayısını veriyor sıvı fincan yuvasına bağlı bir lickometer sistemi ile her odasına donatmak mümkündür: Notöz-yönetim oturumu sırasında fareler tarafından üretilen s.
   7. yüzey dezenfektan ile her odanın duvarları ve ızgara zemin temizleyin.
   8. Kullanımdan sonra,% 70'lik bir etanol çözeltisi ile temizleyerek infüzyon hatları muhafaza. Kullanılmadığı zaman, kalıp ve toz önlemek için kapağı yerleştirin.
9. Her seanstan sonra, toplamak ve oluşturulan verileri analiz. Daha özel olarak aktif kolu presler ortalama sayısını elde alkol ödülleri ortalama sayısının yanı sıra inaktif kolu presler ortalama sayısını hesaplamak.
   Not: En kağıtları, alkol tüketimi de g / kg (vücut ağırlığı) etanol alımının olarak sunulmuştur. Etanol alımı aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanabilir:
   
   Tüketilen hacmi ile (ml) - 0.789 g / mL - oda sıcaklığında üniter hacim / ödül ve etanol yoğunluğu ± kazanılan ödüllerin sayısı.
   Örneğin, bir fare, 400 g ağırlığındaki takdirde 20 REWA kazanılan% 20 h / h etanol çözeltisi RDS:
   
10. (15 seans minimum ve hiçbir değişiklik son 3 oturumları sırasında kazanılan ödüller toplam sayısı fazla% 15 olarak tanımlanır) performans stabilizasyonu kadar haftada oturumları 5/6 gün yürütün.
    Not: Sıçanlar FR1 stabil bir taban çizgisi ulaştığında, operant şartlandırma programı bir alkol ödül almak için gerekli yanıt sayısını arttırmak için, üreticinin talimatlarına uygun olarak modifiye edilebilir. Sabit oran, örneğin kaza takviye en aza indirmek için FR2 ve FR3 için arttırılabilir.
11. Kan etanol konsantrasyonları ölçün:
    1. bir kendi kendine yönetim oturumu elde ödülleri sıçanlar tarafından tüketilen doğrulamak için, kendi kendine uygulama sonrasında kan etanol konsantrasyonlarını ölçmek. sıçanlar istikrarlı bir temel ulaştığınızda, hemen ardından yan kuyruk damarından kan toplamakoturum. kan damarı içine bir 23 G iğne takın ve bir kılcal tüp kullanarak 50 uL kan örnekleri toplamak.
    2. 10 ml headspace şişelerine 50 uL kan örnekleri aktarın ve 1 50 uL ekleyin: internal standart olarak 1000 izopropil alkol. etanol standartlardan 300 mg / dL standart bir eğri 10 hazırlayın. Üretici ayarlarına göre bir kromatografi kolonu ¹³ ile tepe boşluğu örnekleyici ile süreç örnekleri.
12. Progresif oran
    1. Bir ödül ¹⁴ tüketmeye hayvanların motivasyonu değerlendirmek için ilerici oranı (PR) programları kullanın. PR güçlendiricidir elde etmek için yanıtların sayısı giderek artmış olduğu bir edimsel tarifesi (diğer anlamda, fareler birbirini izleyen ödül için daha çok çalışmak zorunda).
       Not: aksine bir PR oturumu zaman aşımına değil, oturumları FR ve sadece 30 dakika tamamlanmış oran olmadan geçtikten sonra iptal edilecektir.
       1. görevlendirildikleri edimsel kutularına sıçan yerleştirin ve izinOnları takviye bir PR programı altında% 20 etanol için yanıt: içinde oturum yanıt gereksinimi veya maliyet (kol presleri, yani sayısını artırmak dışında FR programında kullanılan özdeş tüm deneysel koşullar tutun, (adım 2.3) ... 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32: Not: bir örneği, aşağıdaki formüle göre) tek bir etanol ödül almak için aktif kolu gerekli PR programı Yan Kodu Dosyalar bölümünde verilmektedir.
       2. 30 dakika bir ödül olmadan geçtikten sonra PR oturumu sonlandırın.
          Not: kesme PR oturumu sırasında son tamamlanan yanıt gereği olarak tanımlanır.

3. Testi Alkol Öz-yönetim bir Edimsel Modelinin Tahmini Geçerliliği

Not: sıçanlar istikrarlı bir öz-yönetim taban çizgisini edinilen sonra (bkz: adım 2), onun tarafından modelin tahmini geçerliliğini değerlendirmek mümkündürnaltrekson etkinliğini,% 20 etanol kendini idare azaltılmasında alkol bağımlılığı için bir anda FDA onaylı bir ilaç test etme. yanıtları güvenilir yüksek olduğunda Biz, eğitim (FR2) sırasında elde edilen en yüksek FR Bu test yapıyor öneririz. kestirim geçerliği kurulduktan sonra, model, yeni ilaç adayları değerlendirmek için de kullanılabilir.

1. Test gününden önce, subkütan tuzlu su enjeksiyonları sıçanlar önce iki ardışık kendi kendine uygulanması seans az sırasında enjeksiyon bunları ortama alışmalarına kendi kendine uygulama oturumlarına veya etanol yanıt değişiklik olarak tanımlanır salin enjeksiyonları (etkilenmez kadar 30 dakika verir son 2 seans sırasında kazanılan ödüller) toplam sayısı fazla% 15.
2. tuzlu su içinde naltrekson eritin ve hayvanlara enjeksiyon kolaylaştırmak için tarafsızlığını ulaşmak için pH ayarlamak. 1.0 mL / 'bir hacimde ilaç enjekte uygulama derialtı güzergahını kullanarak, bir oturumda 30 dakika önce kg. Not: litreyani 0.1, 0.3 ve 1 mg / kg bu protokol kullanılır, 1 mg / kg - çalıçtırdıgınızda 0.1 aralıkları arasında bir doz seçimi için iyi bir kanıt sağlar.
   Not: kendi gücü subkütan enjeksiyon olmak farklı olsa Araştırma, naltrekson için idarenin hem deri altı ve periton yollarının kullanımını gösterir daha güçlü 30 kat intraperitoneal enjeksiyonlar ¹⁵ olduğunu. Naltrekson, bu enjeksiyon yol kullanımı onaylanmış ve 0.1 ve 1 mg arasındaki konsantrasyon aralığında çeşitli laboratuarlar tarafından çoğaltılmış Bu nedenle, deri altından yol ile kullanılması tavsiye / ^12,15,16 kg.
3. Test gününde, 30 dakika kendi kendine uygulama oturumu önce dört naltrekson dozaj çevrimleri (0, 0.1, 0.3 ve 1 mg / kg) bir boyunca arası konularda tasarım, dengeli / rasgele sırada fareler enjekte edilir.
4. Her dozlama döngüsü arasındaki, sıçanlar iki ardışık öz-yönetim oturumları minimum veya için yanıt kadar ilaç boşaltılmasında izinetanol geri başlangıca etmektir. Not: Sonuç olarak, test sonunda, bütün sıçanlar dört doz, her enjekte edilmiştir.
5. Bu aşamadan sonra, en verimli doz (1 mg / kg) seçin ve ilerici bir oran programı kullanılarak alkol tüketmeye hayvanların motivasyonu naltrekson etkisini test (adım 2.12 bakınız).

Sonuçlar

Şekil 1 Bir FR1 programa eğitilmiş operant- ve ilaçsız Wistar sıçanların temsilcisi öz-yönetim davranışı (sekiz farklı kohortlar 239 sıçan toplam tutarında) görülmektedir su kısıtlaması ya da sakarin / sakaroz solma olmadan% 20 etanol kendi kendini yönetmek 30 dakikalık seanslar sırasında. Bu protokol ile, sıçanlar kolu zaten çok hızlı bir etanol ödül elde etmek basarak ilk seans (Şekil 1A) sırasında 10'dan fazla ?...

Tartışmalar

Bu protokol ile, kazanmak ve su kısıtlaması, genişletilmiş erişim eğitimi kullanılmasını gerektirmez etanol öz-yönetim klasik modellerin aksine, sıçanlarda% 20 etanol stabil ağızdan öz yönetimini korumak için yeni bir yöntem sunuyoruz, veya sakarin / sakaroz ¹² solma. Ayrıca, naltrekson, alkol bağımlılığı için bir anda FDA onaylı ilaç, başarıyla alkol öz-yönetim ve bu protokol ile eğitilmiş Wistar sıçanların alkol tüketmek için motivasyon azalır. Bu naltrekson bağım...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra Tall MDF Sound Attenuating Cubicle, Interior: 22"W x 22"H x 16"D	Med Associates Inc.	ENV-018MD
Extra Tall Modular Test Chamber with modified Top, Waste Pan and Photobeam	Med Associates Inc.	ENV-007CT-PH
Stainless Steel Grid Floor for Rat or Small Primate	Med Associates Inc.	ENV-005
Retractable Lever	Med Associates Inc.	ENV-112CM	2 by SA chambers
Stimulus Light, 1" White Lens, Mounted on Modular Panel	Med Associates Inc.	ENV-221M	2 by SA chambers
Dual Cup Liquid Receptacle with 18 ga Stainless Steel Pipes	Med Associates Inc.	ENV-200R3AM
Single Speed Syringe Pump, 3.33 rpm	Med Associates Inc.	PHM-100
Liquid Delivery Kit	Med Associates Inc.	PHM-122-18
SmartCtrl 8 Input / 16 Output Package	Med Associates Inc.	DIG-716P2
MED-PC software	Med Associates Inc.	SOF-735
http://www.mednr.com/	Med Associates Inc.		A website that is open-source and has been created to offer researchers a place to exchange MEDState Notation code
Kendall Monoject 20 cc Syringes, Regular Luer Tip	VWR International	MJ8881-520657
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs	2801
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	Hospira	0409-4888-50
Naltrexone hydrochloride	Sigma Aldrich	N3136-1G
23 G BD PrecisionGlide Needles	BD	305145
Minivette POCT 50 µL, K3EDTA	Sarstedt	17.2113.150	For capillary blood collection