JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Özet

Etkin bağışıklık tepkisi enfeksiyon veya hasar bölgesinde kan lökositlerinin hızla harekete bağlıdır. In vivo lökosit göçü incelenmesi damar endotel ile lökosit endotel göç ve etkileşim moleküler temelini anlamak için çok önemlidir. Bir etkili bir yaklaşım ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir.

Burada bir ters konfokal mikroskop ile turuncu boya etiketli nötrofil enjekte CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare iv görüntüleme monosit ve nötrofillerin için bir protokol mevcut. Time-lapse film hem kararlı hal ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde lökosit davranışının analizine imkan görüntüleme birkaç saat 30 dk toplandı. Yerel TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 kan damarı inflamasyonunu indüklemek ve subseque izlemek Ayrıca adımları açıklarnötrofil ve monositlerin nt işe.

Sunulan teknik aynı zamanda lökositlerin diğer popülasyonları izlemek ve diğer uyaranlara veya transgenik fareler kullanılarak lökosit alımı veya insan ticareti karışmış molekülleri araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Nötrofiller ve monositler sürekli dolaşıma doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri bulunmaktadır. Yaralanma ya da enfeksiyon üzerine, enflamatuar sinyaller burada hücresel bir bağışıklık tepkisi başlatılması 1-3, hasar görmüş enfekte dokulara lökosit ROS neden olur. Lökosit seferberlik hızlılığı bağışıklık tepkilerinin olumlu sonucunu belirler. Bu karmaşık süreçler lökosit karışmış moleküller üzerinde anlayışlar elde .To dolaşan lökositler ve endotelyum 1-3 arasındaki yapışma temasların kurulması için yardım iltihaplı endotel üzerinde bulunan belirli moleküllerin (örneğin, selektinler, endotel bağlı kemokinler) güveniyor işe alım çağlayan, hücre işe kinetiği görselleştirmek için ve her bir hücre / nüfus davranışlarını izlemek için önemlidir. Etkili bir yöntem ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir.

Bugüne kadar içeriği ">, intravital mikroskopi kullanılarak çeşitli yaklaşımlar görüntüye geliştirilen damar 4,5. Mesela, kulak dermis damar sistemi ya da intravital konfokal mikroskobu ile mezenterik damarların görüntüleme kemirgen Ly6C düşük monosit ve insan devriye davranışını tanımlamak için kullanılan CD14 kararlı hal şartları altında 6-8 kan damarlarının lümen tarafında CD16 + monositleri dim. Fare cremaster damar modeli, genellikle transgenik farelerin enflamatuvar veya iskemik koşullar altında nötrofil veya enflamatuar Ly6C yüksek monosit davranışını izlemek için kullanılır. Bu ise durumda, Cremaster IL1β, CCL2, TNFβ ya fMLP intraskrotal enjeksiyon ile uyarılır. 2-4 saat sonra, dokular daha sonra cerrahi dışarı çıkarılmıştır ve intravital konfokal mikroskopi 9-11 ile analiz edilmiştir.

Aşağıdaki protokol bir ile aynı anda monositleri ve nötrofilleri izlemek için bir yöntemi tarif etmektedirters floresan konfokal mikroskop. Ayrıca, yöntem lökosit işe kinetiği takip nasıl daha önce görüntü aynı geminin (kararlı hal durumu) ve inflamasyon sonra nasıl ayrıntıları. Bu amaç için, olan monositler eGFP ifade iv portakal renkli bir boya etiketli kemirgen nötrofillerinin, enjekte CX 3 CR1 gfp / ağ fare kullanılır. Ters konfokal mikroskop kullanılarak, (1) izler ve kararlı koşullar ve (2) lokal enflamasyon sonrasında aynı kap içinde iki monosit ve nötrofillerin ilerlemesini takip etmek altında devriye Ly6C düşük monositleri analiz etmek mümkündür. Burada TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 kullanarak inflamatuar koşullar yaratır. Ayrıca, bu tür görüntüleme belirli nakavt fareler üzerinde ya da engelleme antikorların 6,9,13 varlığında gerçekleştirilir ise lökosit işe çağlayan çeşitli adımlar ilgi belirli moleküllerin rolünü belirlemek için yardımcı olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Hayvan prosedürleri İsviçre'nin Cenevre şehrinde Hayvan Bakım kurumsal Etik Komitesi ve Kanton Veteriner Dairesi ile uygun olarak yapıldı. Yetkilendirme numarası GE / 63/14.

Kemik iliğinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 1.

  1. Servikal dislokasyon ile Kurban fare (eski 8-12 hafta). % 70 etanol ile arka ayakları sterilize. Arka ayakları cildi çıkarın.
  2. Fare uyluk ve kaval kemiklerinden inceleyin ve bir neşter ile bacaklarından doku kaldırmak. PBS ile dolu bir kültür çanak içine% 90 etanol ve yer ile bacakları durulayın.
  3. Diz ekleminde bir neşter ve ayrı olan uyluk ve kaval kemiklerinden kültürü kaputu, temiz dokusu altında. Kemiklerin her bir ucunu kesti.
  4. 50 ml'lik bir 23G iğne ve hazırlama ortamı (fenol kırmızısız DMEM / F12,% 1 sıçan serum) ile dolu bir 1 ml şırınga kullanarak her bir kemikten kemik iliği yıkayın tüp vidalı. Ince 23G NE içinden Pasajlanması hücre agrega DisruptEdle ve 1 ml'lik şırınga. Hazırlık ortamı ile, 25 ml toplam hacim getirin.
  5. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. Atın süpernatant. 1 ml içinde süspanse pelet Eritrosit Lizis RBLC tamponu 15 ml tüp vidası (8.3 g NH4CI, distile su ile 1 L'ye tamamlandı 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), 0,22 um filtre). Buz üzerinde 30 saniye inkübe edin.
  6. Hazırlık orta ve santrifüj 250 x g'de 10 ml, 5 dakika, 4 ° C ekleyin. 2 ml hazırlanmış sıvı supernatant ve tekrar süspansiyon atın.

Negatif Seçim ile 2. Nötrofil Zenginleştirme

  1. Fare nötrofil zenginleştirme kokteyli (hücre izolasyonu platformu kiti gibi EasySep gibi) 150 ul ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  2. Fenol kırmızısı içermeyen DMEM 10 ml ekleyin. Bir kez ters çevirin ve santrifüj 250 xg, 3 dakika, 4 ° C.
  3. Atın süpernatant. Alt tüpler yuvarlak 5 ml polistiren 1.75 ml hazırlık ortamda süspanse pelet. 250 ul ekle BiotSeçim Kokteyl. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  4. Tanecikleri yeniden sübyeleştirmek için 30 saniye için (hücre izolasyon platformu kit) manyetik parçacıkları vorteksleyin. Hücre süspansiyonunun 500 ul manyetik parçacıkların ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  5. Cazibe merkezi haline tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin.
  6. İstenen Etiketsiz hücreleri toplamak için alt tüpler yuvarlak yeni bir 5 ml'lik polistiren üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın. İstenmeyen hücre mıknatıs içine bir tüp içinde kalır. Bir biohazard atık içine bu tüp atın.
  7. Mıknatıs yeni tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin.
  8. Yeni 15 ml istenen etiketsiz hücreleri toplamak için tüp vidalı üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın.
  9. Fenol kırmızısı serbest DMEM ile 5 ml Komple hacmi.

Nötrofiller 3. Etiketleme

  1. Böyle Hücre Tracker Orange olarak turuncu bir boya 0.5 ul ekleyin (çalışma konsantrasyonu1 uM, CMRA - klorometil-RODOL-asetat, hazır DMSO içinde 10 mM). 37 ° C 'de 2 dakika kuluçkalayın.
  2. Hazırlama ortamına 2.5 ml ilave edilir. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C.
  3. Atın süpernatant. 1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hazırlanmış sıvı içinde süspanse pelet.
  4. Hematositometre ile saymak için bir kısım atın.
  5. 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C.
  6. Atın süpernatant. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse pelet. Santrifüj 250 xg, 5 dk, yıkamak için 4 ° C.
  7. Atın süpernatant. 100 ul PBS başına 10x10 6 hücre olarak süspanse pelet. Iv enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun. NOT: Hücreler iv mümkün olduğunca çabuk enjekte olması gerekir. 6-12x10 6 nötrofil / fare genellikle elde edilir.

İntra vital mikroskopik 4. Fare Hazırlama

NOT:.. Adım 4.1) ve 4.2) ic üzerinde etiketli nötrofil uzun bekleme süresini önlemek için denemenin başında yapılmalıdıre.

  1. CX 3 CR1 GFP fare (eski 8-12 hafta) tartılır.
  2. (PBS içinde 1.75 mg / kg ketamin acepromazone 60 mg / kg, ksilazin 4,5 mg / kg), anestezik 800 ul hazırlayın.
  3. Fare anestezisi. Fare için 200 ul / 20 g Enjeksiyon ip. Kısma ayak tarafından ve solunum hızını kontrol ederek Kontrol anestezi.
  4. Nötrofiller (100 ul PBS içinde 10x10 6 hücre), venöz deneyci kolaylık, yanal kuyruk venleri veya retro-orbital sinüs enjekte edilir.
  5. Isıtma yastığı fare koyun ve göz jeli ile gözleri korumak.
  6. Bir cam lamel (35 mm çapında), bir 30 mm çapında bir delik olan bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde konur. Kullanım yağı lamel ile temas halinde doku kültürü çanak tutmaktır.
  7. Periton maruz makas ile karın cildi İnsizyon. Bağırsak maruz makas ile periton İnsizyon.
  8. 200 ul PBS p haline (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ilaveeritoneal boşluğu. Elinizdeki fareyi alın ve bağırsak nazik bir basınç ile periton boşluğuna dışarı çıkar böylece, yüzü aşağı çevirin. Doku kültürü çanak fare yerleştirin.
  9. Yavaşça mezenterik damarları açığa amacıyla lamel üzerine steril pamuk tomurcukları ile bağırsak tekrar turlama.
  10. Bantlarında kağıt mendil kesin ve 37 ° C ısıtılmış PBS ile ıslatın. Peristaltizm kaynaklanan hareketleri azaltmak için kağıt dokuların adet bağırsak hareketsiz.
  11. Ters mikroskop ısmarlama tepsi sahneye 37 ° C termostatlı hazne içerisindeki doku kültürü çanak ve fare koyun. Arka bacak içine anestezik sc içeren bir şırınga tanıtın. NOT: Ayrıca, fare bir maske ile oksijen (0.5 L / dk) alabilirsiniz.
  12. Ayak kısma ve solunum hızı her 30 dakikada bir kontrol ederek anestezi Kontrol fare. Gerekirse, düzgün anesteziyi idame ettirmek için anestezik bir destek (20 ul) teslim. DEĞİLE: damar kurutulması kaçınılmalıdır. Bu nedenle, nem oranının düzenli 37 ° C ısıtılmış PBS ile bağırsak immobilize etmek için kullanılan kağıt mendil ıslatıcı tarafından yapılmaktadır.

Intravital Mikroskobu kullanılarak In Vivo iltihaplı Gemiler 5. Ölçme Nötrofil ve Monosit Davranışı

  1. Set lazerler ve lazer 488- kaynaklı fototoksisite önlemek için gerekli olan en düşük güçte 561- etmek. Deneylerde, 0,5% 'den düşüktür. Nötrofillerinde monositlerinde GFP ve portakal boya Yoğunluğu genellikle% 0.3 yeterli olduğunu çok parlak olduğunu. NOT: Bu bizim sistemimizle 0.15 mW 0.25 bir lazer gücü temsil eder.
  2. Ters mikroskop 20X kuru objektif kullanarak açık bir iğne deliği ile 2.2 saniyede 512 x 512 piksel (yani 635 mikron) görüntülerini elde edin. Düşük lazer güçler yeterli sinyal sağlayan 20 um 10 arasında bir z-derinlik kullanın.
    NOT: Biz genellikle 12 ila 16 arasında bir z-derinliği ile deneyler gerçekleştirmek56 m. Sunulan rakamlar ve film durumunda, z-derinlik 20 mm. Faz kontrast endotel duvar belirlenmesini sağlar ve görüntüleme mesenterik damarlar üzerinde gerçekleştirilir. Devriye gezen hücreler ilgi alanı kayıt, 5-10 mikron / dk 6 hızında oldukça yavaş hareket beri her 20 sn tatmin edicidir. Açıklanan ayarlar ile, motorlu sahne aynı anda ilgi kadar 7 alanların kayıt sağlar.
  3. Onları ilk film edinimi önce 30 dakika boyunca hazırlık kurtarmak için izin vardır fare ve mikroskop termostat odasında mezenterik damarlar yerleştirin. Bu süre zarfında, ilgi alanlarını çeşitli seçin. Amacına en yakın geminin lümen yüzeyi üzerinde odaklanın. Gerekirse, odağı ayarlamak için endotel hafif otomatik floresan yararlanın.
    NOT: Fare hazırlanması sırasında Cerrahisi hafifçe endotelyumu vurguluyor. Sonuç olarak, nötrofillerin haddeleme ve/ veya monositler, ilk 15 dakika takiben fare hazırlanmasında gözlenebilir.
  4. Kararlı hal şartları altında, 30 dakika, tek bir görüntü her 20 saniye için bir birinci film kaydedin.
    NOT: Yazılım 2.2 sn ilgi her alan kazanır ve motorlu sahne otomatik olarak diğer bir alandan geçer. Bu kayıt film 30 dakika boyunca geri 20 saniye içinde ilk pozisyona gider.
  5. Kan damarı iltihabı başlatmak için, TLR2 100 ug içeren PBS 20 ul bir damla ekleme / TLR1 agonisti Pam3CSK4 12, doğrudan görüntü verilen gemilerin üzerine.
  6. Ilgi her alan için odağı kontrol edin.
    NOT: edinim sırasında, her zaman vardır z ekseni üzerindeki odak küçük değişiklikler. 10-20 mikron z-derinliğine rağmen, bu floresans yoğunluğunu bir azalmaya neden olabilir. Gerekirse nedenle, el, her filmin sonunda ilgi her alan yönlendirmesi. 30 dakika-sürelerle ve 3 saat kadar Tutanak filmlerital inflamasyon başladıktan sonra.
  7. Deneyin sonunda, servikal dislokasyon ile anestezi uygulanmış fare kurban.

Film Dosyaları ve lökosit ve Takip 6. Nesil

NOT: Nikon kazanım yazılım dosyalarını .nd2 üretir ancak aşağıdaki prosedür diğer yazılım ve markalar ile benzer olacaktır.

  1. Tiff serisi olarak ihracat dosyaları.
  2. ImageJ yazılım (Git http://rsb.info.nih.gov/ij/). Tiff serisi içe aktarın. Farklı bir dosya olarak Her kanal.
  3. Arka plan gürültüsünü azaltmak için yeşil ve kırmızı kanallar (Süreç> Filtreler> Medyan ...) için 2.0 piksel yarıçaplı bir medyan filtre uygulayın.
  4. (İkili olun> Proses> Binary) ikili dosyaları dönüştürün. Her görüntü için eşiği hesaplamak için yazılım etkinleştirin.
  5. Bir resim serisi (Görüntü> Renk> ... Kanallar Merge) içine kanalları Birleştirme. Lenmesi, monositler seçinn kanal, kırmızı kanal ve gri kanalda iletilen ışık nötrofiller bulunmaktadır.
  6. RGB renk içine yığılmış görüntüleri dönüştürün (Görüntü> Renk> RGB Stack).
  7. Avi olarak dosyayı kaydedin
  8. Veriler ithal ve Imaris yazılımı (Bitplane) derlenmiştir. Monosit ve nötrofillerin hareketleri sonra Nokta İzleme Sihirbazı kullanılarak izlenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Eser gerçek zamanlı olarak kolayca anestezi farelerin mesenterik damarlar içindeki monosit ve nötrofillerin davranışını izlemek için optimize edilmiş bir protokol açıklamaktadır. 37 ° C-termostatlı odacığın kullanımı fare sıcaklığı korumak için zorunludur ve aynı zamanda nedeniyle lökositlerin sıcaklığa bağlı hareket etmektir. Fare hazırlanması Şekil görüntülenir 1. Şekil 2 mikroskop altında görülen tüm bölgeyi gösterir. İletilen ışık mez...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda anlatılan metodolojiler verimli kararlı durum ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde monosit ve nötrofil davranışlarını incelemek için tutarlı bir yaklaşım sağlamak.

Hazırlık önemli adım PBS ıslak mendil ile bağırsak immobilizasyonu olduğunu. Düzgün gerçekleştirilen Eğer mezenterik damarlar güzel görüntü elde etmek için lamel maruz kalmaktadır. Bu mezenterik venlerde lökosit davranışını izlemek için ilgi çeşitli alanlarda seçimini sa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5 ml polystyrene round bottom tubes Beckton Dickinson352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm Nikon
Cell Tracker Orange CMRA DyeLife TechnologiesC34551
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kitStem Cell Technologies19762
EDTASigma AldrichE6758
FCSPAAA15-042
Immersion Oil Type ANikonany viscous oil 
Life Box Temperature Control SystemLife Imaging
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NH4ClSigma AldrichA9434
Nikon A1R confocal microscopeNikonA1Rinverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBSLife TechnologiesD8537
phenol red free DMEM/F12Life Technologies21041-025any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsreconstitute in PBS
Rat serumStem Cell Technologiesincluded in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100TPP93100

Referanslar

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 105endotelinflamasyonintravital mikroskopi canl g r nt lememezenterik venmonositn trofiltoll like resept r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır