İçi periton Yumurtalık Kanseri Metastaz kantitasyonu

Özet

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Özet

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Giriş

Epitelyal over kanseri (EOC) 2015 yılında ABD'de tahminen 21.290 yeni tanı ve tahminen 14.180 ölüm ¹ ile jinekolojik malignite gelen ölümlerin en sık nedenidir. Kadınların büyük çoğunluğu (>% 75) geç evre hastalığı tanısı (evre III veya IV) yaygın-içi periton metastazı ve kötü prognoz ile karakterizedir. Birinci basamak kemoterapi sonrası periton boşluğuna Hastalık nüks da yaygındır ve mortalite ^2,3 önemli bir nedenini oluşturmaktadır. EOC doğrudan komşu periton organların birincil tümörden hem de ayrışma ile uzantı veya tek hücre ya da çok hücreli agregatlar halinde primer tümör yüzeyinden hücre dökülmesi her ikisinin de dahil benzersiz bir mekanizma ile metastaz. Onlar dekolmanı kaynaklı apoptoz ⁴ direnmek burada Hücreler, periton boşluğuna dökülür. döken tümör hücreleri periton lenfatik drenajı ve t blok olarak periton asit birikimi, yaygınumors vasküler geçirgenliğini değiştirerek büyüme faktörlerini üretir. Onlar çapa ve birden çok yaygın ikincil lezyonlar ^3,5 üretmek için çoğalırlar bunun üzerine döken tümör hücrelerinin bir kısmı, bağırsak, karaciğer, omentum ve mezenter dahil periton organ ve yapıların yüzeyine tutunur. Hematojen metastaz nadirdir. Böylece, klinik yönetimi yaygın (kadar küçük olursa olsun) tüm görünür tümör rezeksiyonu olarak tanımlanan "Optimal bir sitoredüksiyon sonrası" olmak üzere sitoredüktif cerrahi oluşur. Komple sitoredüksiyon genel sağkalım ^6,7 belirgin bir artış ile ilişkilidir ve tanımlanması ve lezyonların çıkarılması <0.5 cm meydan okuma ile ilişkilidir.

Küçük hayvan modelleri prognostik biyolojik ve yeni kemoterapi veya kombine tedavi yaklaşımları test belirlenmesi yanı hastalığın ilerlemesi anlayışımızı geliştirmeye yumurtalık kanseri araştırmalarında yarar kanıtlanmıştır. birincil olarakyumurtalık kanseri insidansı ve metastaz yeri periton boşluğu, EOC metastaz ortotopik modelleri intraperitoneal hastalığın analizi ve karakterizasyonu dahil olduğunu. Görüntü tümör hücrelerine yeteneği son gelişmeler olmasına rağmen, hatta tek hücre düzeyinde, hala EOC metastatik tümör yükü miktarının önemli zorlukları da bulunmaktadır. Bu sorunlar nedeniyle sayısı, büyüklüğü ve metastatik lezyonların anatomik konuma ortaya çıkar. Ayrıca, normal konakçı hücrelerden ayırmak için etiket kanser hücreleri için bir ihtiyaç söz konusudur. Daha önceki çalışmalar, antikor bazlı etiketleme protokolleri ya da lusiferaz ^8,9 tümör hücrelerinin transfeksiyonu kullanmışlardır. Kanser hücrelerinin direkt floresan etiketleme ilk olarak 1997 yılında ¹⁰ Chishima ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir. Floresan etiketleri kanser metastazı ^11,12 izlemek için eksojen substratın ilave edilmesini gerektirebilir ve zarif tümör hücre özgüllük sağlamak, daha etkin bir araç temin yok .

Bu yazıda fare ID8 yumurtalık kanseri hücreleri ¹³ ve bağışıklık yetkili C57 / BL6 farelerinde kırmızı floresan proteini (RFP) oluşan bir singeneik ortotopik ksenograft modeli kullanılarak metastatik hastalık kantitatif analizi için bir optik görüntüleme yöntemi etiketli açıklanmaktadır. Göreceli tümör yükü ölçümü için yeni bir yöntem, doku otomatik floresans kaldırılması ile in vivo ve ex vivo görüntüleme birleştirerek göstermektedir. Bu yaklaşım yumurtalık kanseri organa özgü metastaz belirli genetik, epigenetik veya mikro-çevre değişiklik ve / veya tedavi yöntemlerinin etkisini değerlendirmek için tasarlanmış çalışmalarda potansiyel yarar vardır.

Protokol

Bütün in vitro çalışmalar, Notre Dame Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan ve dişi C57 / BL6J fareler kullanıldı.

1. Fare Yumurtalık Kanseri Hücre Kültürü

1. şöyle ID8 murin yumurtalık kanseri hücre kültürü kullanım sağlar:% 4 fetal sığır serumu (FBS),% 1 Penisilin / Streptomisin, 5 ug / ml insülin, 5 mg / ml transferrin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1 L ve 5 ng / mL sodyum selenit.
2. RFP ve bir seçim işaretleyici (geni blasticidin) ifade ticari olarak temin lentiviral parçacıklar kullanılarak kırmızı flöresanlı proteinin (RFP) ifade etmek için ID8 fare yumurtalık kanseri hücreleri ¹³ transdüksiyonu. Yeşil floresan proteini, ancak daha zayıf bir flüoresans sinyali sağlanır unutmayın.
   1. Hemen önce transdüksiyon için, kültür hücreleri 50 -% 70 Final 1 ml polybrene (5 mg / ml içeren izdiham ve (penisilin / streptomisin olmadan) taze orta ekleyinkonsantrasyon).
   2. Yavaşça pipet RFP-lentivirüs (20 ul) kabına damla damla ve 72 saat süreyle 37 ^o C'de inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 24 saat boyunca taze ortam ile inkübe edilir. Kültür ortamında (5 ug / ml) blastisidin eklenerek kalıt aktarımlı hücrelerin seçimi başlayın ve floresan mikroskobu (Şekil 1) kullanılarak, kırmızı hücreler için izler.
3. Kültür bir doku kültürü çanak içine yaklaşık 10 ⁶ hücre tohumlama ve hücre tek tabaka konfluent kadar bir ışık mikroskobu kullanarak günlük görselleştirerek ID8 ortamında RFP-etiketli hücreler.
4. Konfluent, tripsin (% 0.25, 3 dk) kullanarak hücrelerin hasat ve hücreler müstakil kadar 37 ^o C inkübatör şişeyi geri döndüğünüzde.
5. serum içeren kültür ortamı ID8 6 ml tripsin nötralize. yukarı pipet ve çanak alt karşı aşağı, sonra 15 ml konik tüp transfer. 2 dakika boyunca 1.200 rpm'de santrifüj, ardından GL kullanılarak ortam aspireeşek pipet.
6. hafifçe sıcak PBS 6 ml yeniden süspanse yukarıda 1.5 gibi santrifüjleme ile fosfat tamponlu tuz (PBS) hücreleri yıkayın. 5 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde yeniden askıya. Enjeksiyona kadar ılık hücreleri (37 ^° C) saklayın.

2. içi periton ID8 Hücrelerinin Enjeksiyon ve in vivo Imaging

1. Intra-peritoneal (ip) enjeksiyon yoluyla 10.000.000 hücre toplam sıcak ID8-PBS çözeltisi 2 mL her fare enjekte edilir. Tümör hücreleri haftada canlı görüntüleme yaklaşık 10 hafta boyunca in vivo olarak büyümeye olanak sağlar.
2. Hemen (0.5 L / dk O ₂ akışında% 2,5 debisi) isofluorane kullanarak her fare uyutmak sonra fareler tartmak ve bundan sonra enjeksiyon ve her hafta takip. Not: farelere olmayan tümör yükünün kantitatif ölçüm değil, çalışma boyunca bir fare, fiziksel ilerlemesi daha genel bir tedbir olarak, tartılmıştır. fareler tartmakts kendi önceki ağırlık değerleri ile karşılaştırıldı.
   1. Bir isofluorane odasında koyarak fareler anestezi. işlem boyunca% 2.5 debisi isofluorane maruz kalma burun-koni fare kafasını konumlandırarak tarama sırasında sabit anestezi koruyun.
3. siyah saçlı floresan sinyal zayıflamasını neden olacağından, her fare gövde ve karın saç kaldırmak için tüy dökücü krem ​​kullanın. Fareler tüy dökücü krem ​​uygulamasından sonra ılık su ile yıkanmış ve RT kağıt havlu ile kurutulur.
4. anestezi ederken, küçük bir hayvan optik görüntüleme sistemi kullanılarak her bir farenin tüm vücudu tarar. Her bir zaman noktasında bir grupta tüm fareleri tarayın. Aşağıdaki iki adımlı protokolü (Şekil 2A) kullanın:
   1. 1. Adımda, floresan etiketli (RFP) tümör hücrelerini gözlemlemek 440 nm, 460 nm, 4 uyarma filtreler kullanılarak 5 görüntülerin toplam toplamak için çok bantlı satın yürütmek80 nm, 520 nm ve 540 nm ve 600 nm'lik bir emisyon filtresi. 15 saniyelik bir standart pozlama, 2 x 2 binning, 160 mm FOV ve 1.1 f _durağı: Aşağıdaki toplama parametrelerini kullanın.
   2. 2. Adımda, bütün hayvan gözlemlemek açık uyarma filtresi (beyaz ışık), bir açık emisyon filtresi, 2 x 2 binning ile 0.2 sn standart pozlama ve 16 cm FOV kullanarak bir yansıma görüntü elde etmek. Not: Gerçek görüntüleme süresi ~ 1 dk.

3. Fare Diseksiyon ve Image Acquisition

1. Canlı görüntüleme (karın şişliği ile kanıtlandığı gibi) asitli geniş intra-peritoneal hastalık ya da hayvan sergi birikimi, kayıp veya vücut ağırlığının% 20'den fazla, uyuşukluk ya da sıkıntı diğer belirtileri kazanç varlığını gösterdiğinde, CO ₂ kullanarak her fare euthanize anestezi servikal dislokasyon.
2. sivri dissectio kullanarak, fare ventral orta hat boyunca öne deri kesmen makas, göğüs kafesinin alt uyluk üst. Sadece deri tabakasının (Şekil 2BI) kesmek için aşırı özen gösterin. Yavaşça periton duvar delmeyin için emin olmak, periton dokusu cilt ayırmak.
3. Derinin iki flep oluşturmak için göğüs kafesinin alt ve uyluk üst kısmında hem yanal kesilmiş sivri diseksiyon makas kullanılarak (Şekil 2B ii, iii).
4. Açık cilt flepleri ile ventral tarafta her fare (periton boşluğu aşağı bakacak) çekti yerleştirin ve küçük hayvan optik görüntüleme sistemi kullanılarak yerinde onun organları ile her fare tarama (Şekil 3A, B).
   1. 2.4.1.-2.4.2 tarif edildiği gibi aynı görüntü tedarik parametreleri kullanarak.
5. karaciğer, omentum / pankreas, mide, diyafram, ince bağırsak, kalın bağırsak, sol ve sağ periton, yumurtalıklar, kidne içeren bireysel periton organları çıkartarak fare diseksiyon devam edinys, mezenter ve yağ yastığı.
   1. , Gözlemlemek numaralandırmak ve her organ üzerinde görünür tümör kaydedin. Her tümörün çapı ölçmek için bir kumpas kullanın.
   2. Ortam olarak 2 ve 5 mm kadar büyük daha büyük 5 mm arasında, küçük bir çap olarak 2 mm'den daha az tümör belirtin.
6. Organ tarama şablonuna her organ için önceden belirlenmiş bir konumunu tanımlar (Şekil 4) üzerine organları yerleştirin. nemli organları tutmak için PBS kullanın.
7. Küçük hayvan optik görüntüleme sistemi (Şekil 3C, D) ile organların her sayfayı tarayın.
   1. Adım 2.4 açıklandığı gibi aynı görüntü elde etme parametrelerini kullanın.
8. Taramadan sonra,% 10 formaldehit yer organları histoloji için sonraki işlem sağlamaktır.

th Tümör Yükü 4. sayısallaştırılmasıe Floresan Görüntüleri

1. Her bir çok bantlı taramada otomatik floresans miktarının azaltılması amacıyla, ilk küçük hayvan görüntüleme sistemi ile uygun yazılımı kullanarak dosyaları unmix.
   1. Vivo spektral dosyasında, Autofluor ardından: İlk RFP yükleyin Karışmamış Görüntüler penceresinde Vivo Kırmızı dosyasında ve Unmix seçin.
2. 16 bit .tiff (ölçeklenmemiş) biçimi olarak .bip dosyaları aktarın.
3. (In situ organları ile ex vivo organ ve ardından tam fare gövdesini) ImageJ yazılımı kullanın.
   1. ImageJ organ tarama şablon dosyalarını 16 bit .tiff dosyalarını açmak için> Dosya Aç kullanın.
   2. Görüntü> Ayarlama altında> Parlaklık / Kontrast, Minimum değeri 0 görüntülenen ve Maksimum +35353 değer gösterilir ve daha sonra altında yer alan tercihGörüntü> Arama Tabloları, Red Hot seçin. Not: Çeşitli hayvan modelleri, farklı parlaklık seviyeleri gerektirir, ancak belirli bir çalışma boyunca tutarlı parlaklık tutmak önemlidir.
   3. Serbest Seçim aracını kullanarak, her organın etrafında faiz seçimi (ROI) serbest biçimli bir bölgesini çizmek ve her organın yüzey alanını hesaplamak için Ölçü aracını (CTRL + M) kullanın; Bir e-tablodaki her bir organın yüzey alanı kaydedin.
   4. Her organın etrafında çizilen ROI ile, sağ ROI içinde tıklayın ve sadece organı dahil etmek için Çoğalt seçeneğini seçin.
   5. Eşik> Ayarla> Görüntü altında, bireysel organa bakarken, onl seçmek için + 1200 Alt Eşik Düzeyi ve + 1700 Üst Eşik Seviyesi görüntünün eşiğini ayarlayın tercihy en parlak fluoresan bölgeler ve Karanlık Arka Plan seçmek için kontrol edin; Tamam seçeneğini seçin. Not: Daha önce parlak alanlar analiz aşaması için seçilen böylece yukarıda gösterildiği gibi görüntüler, ImageJ eşik sürgü elle manipülasyon gerektirebilir. Farklı hastalık modelleri farklı eşik kısıtlamaları gerektirir, ancak belirli bir çalışma boyunca tutarlı eşik seviyesini düşük tutmak için önemlidir.
   6. Analiz altında> değiştirmek Boyutu, Parçacıklar Analiz (piksel ^ 2) 10-Infinity, Show tercih: Anahat, sadece "sonuçlarını görüntüle" seçeneğini ve alanları ve bu aydınlık bölgelerin ham entegre yoğunluğu hem ölçmek için Tamam 'ı kontrol, sayılır tümörler.
   7. Yüzey Alanı değerlerini ve görüntülenen her tümör seçimi Ham Entegre Yoğunluk kaydedin Organ yüzey alanları içeren aynı e-tabloda Sonuçları tablo.
   8. Analiz altında> Araçlar> Kalibrasyon Bar, organların görüntülere bir kalibrasyon ölçek çubuğu ekleyin. Not: Bu örnekte, bu Üst Hakkı, Siyah Dolgu Rengi, Beyaz Etiket Renk, 5'e Etiketler sayısı, 0 Ondalık, 12 Yazı Boyutu ve Zoom Yer değiştirerek yapıldı 4.0 faktör ve Kalın Metin sağlayan.
   9. Dosya altında> Farklı Kaydet ... Bir .TIFF ve .jpeg olarak montaj kaydedin.
   10. .jpeg Organların dosya ve sonra Ekle altında> Metin Kutusunu açmak için> Dosya Aç kullanın , organların üç sıra her aşağıda bir metin kutusu oluşturarak, organ etiketleri ekleyin.
   11. Fare sayısının sırasına ImageJ tam vücut taramalarının 16 bit tiff dosyaların her biri açmak için> Dosya Aç kullanın.
   12. Değeri 0 gösterilir ve Maksimum + 35353 değerini görüntülenen ve ardından Görüntü altında> Arama Tabloları, Red Hot seçin Görüntü altında>> Parlaklık / Kontrast ayarlama Minimum Set seçin.
   13. Dosya altında> Farklı Kaydet ..., a. TIFF ve .jpeg olarak montaj kaydedin.

5. Veri Analizi

1. her bir farenin Her organ için sırasıyla tümörün Seçim alanları ve ham entegre yoğunlukları ekleyin ve her bir fare için toplam organı tümör alanı kaydedilir.
2. Kaydedilen alanı ve ham bütünleşik Normaleİlgili Organ yüzey alanı (Tablo 1) toplam tümör alanı ve toplam ham entegre yoğunluk değerleri bölerek her organın boyutu için ed yoğunluk değerleri.
3. Hesaplamak ve normalize tümör yüzey alanları ve normalize ham entegre yoğunluk değerleri, her iki ortalamasını arsa (Şekil 5a, b).
4. görsel metastatik lezyonlar her organın denetim sırasında çıplak gözle görülebilen tümörlerin sayarak elde edilen bu ortalama değerleri karşılaştırın.

Sonuçlar

yumurtalık kanseri, metastatik bir mekanizma çok küçük (<2 mm) lezyonlar da dahil olmak üzere, farklı büyüklüklerde, çok sayıda lezyon arasında oluşan yüksek yaygın intra-peritoneal metastaz ile karakterize edilir. Bu nedenle, RFP etiketli tümör hücrelerinin kullanımı (Şekil 1) ve optik görüntüleme kılavuzu sayım ve lezyon boyutu ölçümü için alternatif bir yöntem sağlar. Zamanla tümör yükünün gelişmesi haftada asit potansiyel va...

Tartışmalar

bağışıklık yetersizliği olan farelerde yapılmalıdır insan yumurtalık kanser hücrelerinin kullanan çalışmaların tersine, protokol, yukarıda tarif edilen imünokompetan C57 / BL6 fareleri ve genetik olarak özdeş fare yumurtalık kanseri hücreleri kullanır. Bu tümör büyümesi ve metastazı bağışıklık infiltrasyonların potansiyel rolünün değerlendirilmesi sağlarken, karın yüzeyinde siyah saçlı varlığı görüntüleme az duyarlı hale getirir. tüy dökücü kullanımı görüntüleme ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning	10-014-CM
Fetal bovine serum	Gibco	10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system	Bruker Corp.
Bruker Multispectral software	Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein	GenTarget, Inc.	LVP023
trypsin for cell culture	Corning	25-053-CI
PBS	Corning	21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)	purchases from drugstore	n/a
ImageJ software	http://imagej.nih.gov/ij/		free download
dissecting tools (forceps)	Roboz Surgical Instrument	RS 5130
dissecting tools (Scissors)	Roboz Surgical Instrument	RS 5910