RNA Analizi İnsan Prostat Epitelinin Lazer yakalama mikrodiseksiyon

Özet

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Özet

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Giriş

Prostat bezi, öncelikle düz kas ¹ oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre ^2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) 'de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde ³ arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi mikrodiseksiyon bakılmaksızın tüm dokulardan elde edilen gen ekspresyon verileri yanlı varsayımlar yol açabilir. Bu nedenle, bu önyargı kaldırmak için onu önce RNA ekstraksiyon ve hücre tiplerini ayırmak için esastırgen ekspresyon analizi.

Macrodissection ya mikrodiseksiyon fiziksel çevredeki stroma ^{4 -6} den iyi karakterize edilmiş epitelyal alanları ayırmak için kullanılabilir. Macrodissection tipik bir mikroskop altında bir jilet ile yapılan ve büyük PCa stromadan nodüller ayırmak için iyi çalışır, ancak stroma çevreleyen benign epitel kaldırma yeteneğine sahip değildir (Şekil 1'de huylu prostat histoloji örneğe bakın). Bir lazer (LCM) ile Mikrodisseksiyonla macrodissection önemli ölçüde daha fazla emek yoğun, ama çok doğru bir iyi huylu epitel ⁴ incelemek olabilir.

Bizim laboratuardan Son yayınlar RNA başarıyla formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) biyopsi veya dondurulmuş doku ^4,7-9 birinden LCM tarafından elde edilebilir olduğunu göstermiştir. LCM-RNA ekstraksiyonu büyük zorluklar R 1) doğru dokuda istenilen alanlarını incelemek için, ve 2) korumak için vardırLCM ve izolasyon işlemi ^4.10 sırasında NA bütünlüğü. Saf hücre popülasyonlarının izole RNA ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) ^7,8, mikrodizi ¹¹ ve derin -sequencing ^12-14 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle gen ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Bu protokolün amacı, aşağı doğru gen ekspresyon analizleri donmuş dokudan LCM prostatik epitel toplam RNA'nın izole edilmesi için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi.

1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine

1. Bir gün önce veya bir kaç saat numune kesit önce, temiz araçlar (yani, fırça, forseps, coplins, bıçaklar, PEN-çerçeveli slaytlar (değilse zaten RNaz ücretsiz), bir ETOH güvenli işaretleyici ve bir kalem) ve iç Bir sprey şişesi ve laboratuar mendil kullanarak çözüm-dekontaminasyon RNaz RT Kriyostat.
   1. RNaz dekontaminasyon çözüm silerek önce 5 dakika boyunca oturup çözüm ve (depcH ₂ 0 ile hazırlanan)% 70 EtOH ile son durulama RNaz-dekontaminasyon üzerinde sol kaldırmak için depcH ₂ 0 ile durulayın izin verin.
      Not: Bir RNaz ücretsiz çalışma alanı korumak için şarttır. Tüm coplins, araçlar, dondurulmuş montaj orta, bıçaklar ve kullanılan slaytlar RNaz ücretsiz iş için yalnızca kullanılmalıdırve standart bir olmayan RNaz ortamda hiç kullanmadım. Tüm enstrümanlar her deneyden önce bir Rnase dekontaminasyon solüsyonu ile tedavi edilmelidir.
2. -24 ° C'ye soğutun kriyostat.
3. Önce Kesit en az 30 dakika soğumasını kriyostat içinde aşağıdaki temizlenmiş RNaz ücretsiz araçlar yerleştirin: slayt coplin dolu% 100 etanol, araçlar, küçük dondurulmuş doku kaset ve montaj mandren ile.
4. Taşınması için bir kuru buz dolu bir köpük halinde dondurulup ve kova yere donmuş prostat dokusunu al. En az 30 dakika boyunca sıcaklık kriyostat denge sağlaması için kriyostat halinde doku yerleştirin.
   Not: lazer yakalama mikro diseksiyon İnsan prostat dokuları taze dondurulmuş veya da olabilir parafine gömülü (FFPE) formalin ile fikse. Zaman kısıtlamaları ve slayt hazırlama doku kaynakları arasında biraz farklıdır. Burada donmuş kesitler için adımları açıklar.
5. Bir seferde bir doku ile Çalışma ve botto içine donmuş montaj orta fışkırtmaKasetin m ve hızlı bir şekilde soğutulmuş forseps kullanılarak dondurulmuş montaj ortama donmuş prostat dokusunu monte edin.
6. Dondurulmuş montaj orta ayarlamak için 5 dakika süreyle kriyostat içinde soğutucu üzerine doku ile kaseti yerleştirin.
7. Chuck üzerine dondurulmuş montaj orta küçük bir miktar Squirt ve dikkatle dondurulmuş montaj ortamına kadar monte doku alt tarafı basın. 5 dk dondurulmuş montaj orta tamamen katılaşmaya izin vermek için kriyostat ayarlanır edelim.
8. Tutucu içine aynasını yerleştirin ve sıkın.
9. Kilitli pozisyonda kolu kilitleyin ve kriyostat üzerine yeni bir bıçak yerleştirin. Amplifikasyon aşamasını içerir aşağı moleküler uç noktaları için (yani, qPCR) bu bulaşmayı önlemek (veya sonraki numune için bıçak alanı kullanabilirsiniz üzerinde bıçağı taşımak) her hasta için yeni bir bıçak kullanılması tavsiye edilir.
10. Kolu kilidini ve dikkatle eşitlemek için elle veya bir ayak pedalı ile doku ilerlemek ve 50 mikron ile doku maruzistenen doku maruz kadar m bölümleri ulaşılır.
11. 5 um Kriyostat ayarlayın, bir veya iki bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için ücret cam slayt üzerine yerleştirin (Adım 2).
12. Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt yerleştirin.
13. Etanol tahsil cam slayt çıkarın ve H & E boyama (Adım 2) geçmeden önce oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
14. Bir çerçeve destekçisi RT PEN-çerçeve slayt yerleştirin.
15. RT PEN çerçeve slaytlar üzerine 10 mikron ve yer bölümlerine Kriyostat ayarlayın. Bir dört bölümler doku büyüklüğüne bağlı olarak her bir slayt üzerine bir yer olabilir.
16. Hemen 2 dakika süreyle soğuk% 100 etanol içine slayt dalma.
17. Etanol PEN-frame slaytları çıkarın ve LCM için hazır olana kadar -80 ° C derin dondurucuda bir desiccator kutusunda bir slayt kutusuna slayt saklayın. Üç gün Optimal RNA kurtarma için maksimum depolama süresidir.
18. Tahsil cam kaydırdı SADECE Adım 2 ile devam edine. PEN-frame slayt için Adım 3 ile devam edin.

2. Hematoksilen Eozin ve-Y (H & E) histolojik Mark-up için Leke

Not: Bu yüklü cam slayt doku ve DEĞİL LCM PEN-çerçeve slayt için eğer.

1. Aşağıdaki gibi derecelendirilmiştir etanol ile slayt daldırma yüklü cam slayt bölümleri hidrat: 3 dakika için iki% 70 etanol içinde bir kez 3 dakika boyunca, 3 dakika süre ile kayıcı% 95 etanol içinde iki kez% 100 etanol içinde iki kez daldırma 3 dakika boyunca damıtılmış H _{2 O} zamanlar.
   1. 99 ml% 70 etanol + 1 mi% 1 HCI ve% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi: 100 ml içinde 0.1 g sodyum bikarbonat damıtılmış _H2O asidi alkolü çözeltisi hazırlayın
2. 5 dakika boyunca hematoksilin Gill II (% 0.4) slayt batırın.
3. 3 dakika sürekli çalışan musluk _H 2 O aşırı leke yıkayın.
4. Kayıcı asit alkol 10 kez batırın
5. 3 dakika boyunca musluk H _{2 O} çalışan slayt yıkayın.
6. Slayt Dip% 0.1 sodyum bikarbonat çözeltisi içinde 30-60 sn mavi mor renge dönüşür için.
7. 3 dakika boyunca musluk H _{2 O} çalışan slayt yıkayın.
8. 10 dips% 95 etanol içinde slayt durulayın.
9. 15 saniye toplam Eozin-Y 2-3 kez slayt batırın.
10. Aşağıdaki gibi kademeli etanol ile slayt dehydrate: Ksilen slayt% 95 etanol içinde iki kez,% 100 etanol içinde iki kez ve iki kez daldırma (doku kapsamlı dehidratasyon gösterir açıkça göründüğünden emin olun).
11. Sulu olmayan kalıcı sabit montaj orta ve kapak kayma ile slayt monte edin.
12. 30 dakika boyunca slayt kurumasını bekleyin.
13. Herhangi bir tam slayt tarayıcı ile tarama slayt ve 8 "x 11" kağıt üzerine bir büyük, yüksek çözünürlüklü görüntü yazdırmak.
14. Ilgi Anahat alanları işaretleyici ile (genellikle bir kurul onaylı patolog tarafından yapılır). Bu biçimlendirme LCM prosedürü için kılavuzdur.

PEN-frame Slaytlar 3. Toluidine Mavi Boyama

Not: ThLCM olarak AYNI GÜN yapılır edilir. Tüm çözümler için depcH _{2 O} su kullanın. RNaz ücretsiz alan tüm adımları tamamlayın. Tüm coplins RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenmelidir.

1. LCM gün 2 dakika süreyle daha sonra 2 dakika süreyle% 90 EtOH içine yavaşça daldırma slaytlar tarafından% 75 EtOH -80 ° C derin dondurucuda ve hidrat gelen PEN-frame slaytları çıkarın.
   1. Daha sonra oda sıcaklığında 0.2 um'lik bir filtreden ve mağaza sterilize filtre moleküler biyoloji sınıfı su içinde eritilmesi ile% 0.5 toluidin mavisi hazırlayın. Bu çözelti, en fazla 6 ay süreyle yeniden kullanılabilmektedir. Not: Bu son derece öncesinde filtrasyon birkaç saat sürebilir olarak solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir.
2. Yavaşça 5-30 saniye boyunca% 0.5 toluidin mavisi içine slaytlar batırarak prostat dokusunu Leke. Yıkama ile doku 3 dakika için 30 saniye için% 75 EtOH, ardından 15 saniye boyunca depcH _{2 O} 2 kez slaytlar destain. Not: Leke ve destain süreleri iyi boyama sağlamak için ayarlanabilir. Prostat leke üzerinde eğilimindedir.
3. buz üzerinde RNAaz serbest kuru kaba PEN-kare slaytlar aktarın.

4. Lazer yakalama Mikro diseksiyon (LCM)

1. LCM, 15 dakika boyunca 42 ° C 'de sıcak bir slayt kuru slayt hemen önce. Işlenmiş ve onlar için hazır olana kadar buz üzerinde kalan saklamak olacak Kuru, sadece slayt.
2. LCM ve bilgisayar bu sırada, mikroskop gücü, lazer tuşu, lazer anahtarı ve ardından bilgisayarı açın. Lazer Diseksiyon yazılımını başlatın.
3. Slaytlar ve toplama tüpleri yüklemek için mikroskop kontrol etmek için yazılımı kullanın. Daha sonra "Devam" butonuna tıklayınız, "boşaltma numune tutucu" üzerine tıklayın aşağı bakacak şekilde doku ile mikroskop lamı sahibinin üzerine bölümleri ile slayt yüklemek ve mikroskopta uygun yuvaya slayt tutucu takın.
   1. "Boşaltma toplama tüpleri", etiketin üzerine tıklayın ve tüp tutucu üzerine 0.5 ml tüpler yüklemek ve enstrüman uygun yuvaya takın. bir Zamanlarkapaklar toplama kapaklar Lizis tampon 35 ul ekleyin ve kabarcıkları önlemek için deneyin, güvencesindedir. Daha sonra "Tamam" a tıklayın.
      Not: 25 ul lizis tamponu 10 ul depcH2O ile: buharlaşma bir sorun varsa, aşağıdaki gibi tampon sulandırmak.
4. Yazılımda, slayt slayt tutucuya yerleştirildi konumu seçin. LCM numune toplamak için toplama kapağı seçin.
5. Görselleştirmek ve 10X de bilgisayar aracılığıyla slayt odaklanır. Ardından "kalibre" "Laser" seçerek lazer kalibre etmek için yazılımı kullanın. Lazer ışını tamamen ve verimli seçilen alanı kesmek için izin lazerin güç, diyafram ve hız, seçme "lazer", sonra "kontrol" ayarlayın. Tamamen doku içinden lazer kesim kadar ayarlamalar tekrarlayın.
6. Bir kılavuz olarak 8 "x 11" patolog mark-up kullanarak, epithe istenilen alanlarını sınırlamak için "şekil çizmek" aracını kullanıngörünümünde Lium herhangi bir stroma toplama önlemek.
   Birden alanlar tek bir görünümde içinde seçilebilir, ancak "şeklinde kesmek" aracını tıklayarak ilk kesme olmadan başka görünüme hareket etmiyor: Not.
   1. Bir alan tamamen lazerle kesilmiş olsun yoksa manuel üzerine gitmek için "hareket ve kesim" aracını kullanın. Yeni görüşlere hedefi hareketli Devam ve slayt tamamen disseke edilir veya doku istenilen miktarda tahsil edilene kadar lazer kesim tekrarlayın (tipik olarak 100 huylu bezleri RNA 150-500 ng verim). (Şekil 1A örneğe bakın).
7. Dikkatle kapaklar lizis tamponu ve doku dikkatli olmak, tahsilat sahibinin tüpleri kaldırmak ve kapaklarını kapatın. Kısaca tüpünün dibinde sıvı ve doku toplamak 30 sn için santrifüjlenir. RNA izolasyonu için hazır olana kadar -80 ° C'de 30 dakika ve mağaza 42 ° C'de inkübe edin.

Bir Fil ile 5. Toplam RNA izolasyonuter bazlı Takımı ve Kalite Analizleri

1. Buz üzerinde tüpler dışarı çözülme ve 100 ul çözümün ses getirmek.
2. Filtrenin merkezine 30 ul ofLysis Çözüm uygulayarak RNA izolasyon kiti, mikro filtre önceden ıslak ve sonraki iki adımı (en azından 5 dakika) whileperforming bekletin.
3. Lizat (kitte sağlanan) LCM katkı maddesi çözeltisi 3 ul ilave edin ve 5 saniye için vorteks ile karıştırılır. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 30 saniye boyunca santrifüjleyin.
4. Sıvıyı çıkarmak için en yüksek hızda 30 saniye ~ için önceden ıslatılmış filtre santrifüj.
5. Yukarı ve aşağı yavaşça, lizat karışımına girdap ya da pipet% 100 etanol (bu durumda 129 ul) 1.25 hacimleri ekleyin. ** Bu yöntem, büyük ve küçük RNA türleri hem de kurtaracaktır.
6. 1 dk filtreye RNA bağlamak için 10.000 xg'de önceden ıslatılmış mikro filtre üzerine numuneyi ve santrifüj yükleyin. Daha sonra yıkama solüsyonu 1, R ", 180 ul mikro filtre yıkama21; 1 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj.
   Not: Tüm santrifüj bu nokta 13.000 xg veya maksimum hızda yapılmalıdır seçin.
7. Kit protokol tarafından yönlendirildiği gibi yıkayın sırasıyla "Yıkama çözümlerinin 2 ve 3" 180 ul ile iki kez filtre. Santrifüj bakiye akışkan maddeyi ortadan kaldırmak ve kurutun 30 sn için, daha sonra akış atmak ve 1 dakika boyunca filtreyi dönerler.
8. Yeni bir koleksiyon tüpüne filtreyi aktarın.
9. (Takım ile birlikte verilme), -95 ° C'ye kadar sıcak Elüsyon çözeltisi.
10. Filtrenin merkezine önceden ısıtılmış yıkama çözeltisi 10 ul uygulayın, kapağını takın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca muhafaza edin. Daha sonra RNA elüte etmek için 1 dk için santrifüj ve ~ RNA 20 ul elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın.
11. 37 ° C'de 15 dakika boyunca DNaz I tedavi gerçekleştirin.
12. 260 nm'de absorbans ile spektrofotometre ile RNA ölçmek. 260 nm ve 280 nm dalga boylarında optik yoğunluk oranı saflığını değerlendirmek için kullanılırRNA ¹⁵ (Tablo 1).

6. Gen İfadesi Analizi

Not: (mRNA ve lncRNAs gibi) uzun bir RNA türünün gen ekspresyonunu Aşama 6.1 ve kısa RNA türünün (mikroRNA gibi) gösterilir aşama 6.2'de gösterilmiştir. Farklı kitleri RT-qPCR için kullanılabilir ve gerekli RNA miktarı (10 ng kadar az) kiti göre değişir. RNA sekans analizi, 6.3 tarif edilmektedir.

1. Arka uyarlamak (RT) 5 RT ana karışımı ul (RT tampon maddesi, dNTP'ler, rastgele primerler, RT enziminin, RNaz inhibitörü) ile 20 ng 5 ul / RNA örnek ul karışım cDNA'ya RNA'nın. 37 ° C'de, sonra 120 dakika 25 ° C'de 25 dakika boyunca reaksiyon inkübe ve 85 ° C 'de 5 dak.
2. RNaz içermeyen su ile RT reaksiyonu 1:10 seyreltin ve ilgi genleri için primer ya da primer / prob setleri ile 10 ul qPCR reaksiyon başına 2.5 ul kullanın.
   Not: kısmen bozulmuş RNA analizini kolaylaştırmak için bu fo primerler kullanılması tavsiye edilirr kısa amplikonlar (az 100 bp) ^16. (Tablo 2B)
   1. MicroRNA ifade analizi için RT usta karışımı 5 ul 2-10 ng 5 ul / RNA örnek ul karıştırılarak RT reaksiyonu çalıştırın.
      Not: her biri ticari olarak temin edilebilen PCR bazlı mikroRNA algılama teknolojisi, özel ve özel bir RT primerleri kullanılmasını gerektirir.
3. Alternatif olarak veya RT-PCR ilave olarak, RNA farklı türler ölçmek için yeni nesil dizilimi (RNA seq veya küçük RNA seq) kullanın. Genellikle, bu prosedür (Tablo 3) RNA 500 ​​ng kullanımı ve üretimi ve tespit aracı ile gösterildiği gibi yöntemi gerçekleştirmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir önceki çalışmada aynı hastadan ⁴ dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontroller...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111