JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Özet

Kaynaklı kardiyomiyositlere kardiyak fibroblastlar (CFS) Doğrudan dönüşüm (ICMS) kalp hastalıklarının tedavisi için alternatif stratejiler sunarak rejeneratif tıp için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu dönüşüm Gata4 (G), Mef2c (M) ve Tbx5 (T) gibi tanımlanmıştır faktörler zorla ifade ile elde edilmiştir. Geleneksel olarak, bu ICMS bireysel faktörlerin ifade virüslerin bir kokteyl ile üretilmiştir. Bununla birlikte, verim yeniden programlama nispeten düşük olan ve in vitro G en büyük kısmı, E, fibroblastlar zor yeniden programlama mekanizmaları incelemek için yapım tamamen yeniden programlanması olmazlar T-transdüksiyonlu. Biz son zamanlarda G, M stokiyometrisi, T verimli ICM yeniden programlama için çok önemli olduğunu göstermiştir. Bir M ve polisistronik MGT vektörü (bundan sonra MGT olarak anılacaktır) önemli ölçüde artmıştır yeniden programlama etkinliğini kullanılarak elde G ve T düşük seviyelerde göreli yüksek düzeyde G, M, T optimal stoikiometri ve in vitro olarak geliştirilmiş ICM kalitesi. Burada kalp fibroblastlardan MGT yapısı ile ICMS oluşturmak için kullanılan yöntemlerin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Kalp fibroblastlar, yeniden programlama ve yeniden programlama sürecinin değerlendirilmesi için virüsün nesil izolasyonu da ICMS verimli ve tekrarlanabilir nesil için bir platform sağlamak için dahil edilmiştir.

Giriş

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.

Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31.

Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada özetlenen protokol yenidoğan fareler kullanır. Hayvan bakım ve deneyleri Kuzey Carolina Üniversitesi'nde Bölümü Laboratuvarı Hayvan Tıp (DLAM), Chapel Hill tarafından kurulan kurallarına uygun olarak yapılmaktadır.

Tamponlar ve Medya 1. Hazırlık

  1. Fibroblast (FB) orta hazırlayın: 100 ml cenin sığır serumu (FBS) ve 6 ml penisilin / streptomisin, 500 ml IMDM ortamı Supplement.
  2. 100 ml M199 medya ve 50 ml FBS ile 400 ml DMEM ortamı Supplement: ICM ortamı hazırlayın.
  3. B27 ortamı hazırlayın: 10 ml B27 medya ile 490 ml RPMI1640 ortam Supplement.
  4. Plat-E kültür ortamı hazırlayın: 50 ml FBS, 5 ml penisilin / streptomisin ve 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler ile birlikte 500 ml DMEM ortamı Supplement.
  5. Plat-E transfeksiyon ortamı hazırlayın: 50 ml FBS ve 5 ml, esansiyel olmayan amino asitler ile birlikte 500 ml DMEM ortamı Supplement.
  6. Prepare Jelatin 24 plaka kaplanmış 24 çukurlu bir levhanın bir oyuğuna 0.5 ml% 0.1 jelatin çözeltisi ekleme, kullanımdan önce en az 10 dakika karıştırıldı ve aspirat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  7. FACS markalama tamponu hazırlayın: 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere, 10 ml FBS ve 2 mi EDTA (0.5 M) ile birlikte 500 mi DPBS Supplement. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden geçirin.
  8. Tampon sıralama MACS hazırlayın: 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere 2,5 g BSA ve 2 ml EDTA (0.5 M) ile birlikte 500 mi DPBS Supplement. 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden geçirin.
  9. Transfeksiyon için 2x HBS tamponu hazırlayın: 280 mM NaCI (8,1816 g), 10 mM KCI (0,37275 g), 1.5 mM Na 2 HPO 4 (0,10647 g), 12 mM glukoz ile 500 mL HEPES tamponu (50 mM) ek (1,08096 g ). 7.05-7.12 pH ayarlamak için yaklaşık 650 ul 10 N NaOH ekleyin. 4 ° C'da bir 0.22 mikron gözenek filtre ve mağaza üzerinden filtre.
  10. Transfeksiyon için 2.5 M CaCI2 çözeltisi hazırlayın: 18,376 g Ca ekleCl 2 50 ml GKD 2 O. 4 ° C'da bir 0.22 mikron gözenek filtre ve mağaza üzerinden filtre.
  11. ICC (immünositokimya) sabitleme tamponu hazırlayın:% 4 bir nihai konsantrasyon elde etmek 35 mi DPBS 5 mi paraformaldehid (PFA,% 32) ekleyin.
  12. ICC permeabilizasyon tamponu hazırlayın:% 0.1 bir son konsantrasyona ulaşmak için 100 ml DPBS 0.1 ml Triton ekleyin.
  13. ICC bloke tamponu hazırlayın:% 5 oranında bir nihai konsantrasyon elde etmek 100 mi DPBS 5 g sığır serum albümini (BSA) ilave edin.
  14. ICC boyama tamponu hazırlayın:% 1 bir son konsantrasyona ulaşmak için 100 ml DPBS 1 g BSA ekleyin.

Yenidoğan Fare Kardiyak Fibroblastları 2. Nesil

  1. Eksplant kültürü yöntemi kardiyak fibroblastlar oluşturun
    1. Temiz neonatal αMHC-GFP transgenik fare% 75 etanol ile (P2 P1). Steril makas ile kafasını kesti. Sonra diğer bir koltuk altından yatay bir kesi yapmak. Steril kullanınkünt ve bükülmüş forseps kalbini incelemek ve buz gibi soğuk PBS tampon içeren 24 plaka bir kuyuya yerleştirmek.
      1. Alternatif olarak, yatay kesi sonrası kalp dışarı sıkmak.
    2. Floresan mikroskop ile göbeğinde GFP ifade edin. GFP tanımı, bir kalp-spesifik promotör olmaktadır αMHC promotörü tarafından tahrik edilir yana negatif kalp herhangi bir floresan loş iken transgenik fare kalp yeşil 15 olmalıdır.
    3. 60 mm merkez kuyu kültür çanak içine 3-4 GFP pozitif kalpleri alın ve steril makas ve forseps ile küçük parçalar boyutu 1 mm'den az 3 içine kıyma.
    4. 2 ml FB medya ile bir adet 10 cm'lik çanak içine 3-4 kıyılmış kalpleri yerleştirin. Dokular 3 saat aşağı dinlendiriniz.
    5. Yavaşça kalp dokuları içeren yemekleri 8 ml önceden ısıtılmış FB medya ekleyebilirsiniz. Üç gün boyunca dokuların rahatsız etmeyin.
    6. Her üç günde medyayı değiştirin.
    7. Gün 7, aspir Onkültür ortamı yedik ve DPBS hücreleri yıkayın. Her plaka için 3 ml% 0.05 tripsin ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C 'de özet.
    8. Tripsin gidermek için 5 ml FB Medya ekle. Yavaşça hücre kazıyıcı ile hücreleri ayırmak. Yukarı ve ileri mekanik doku ayırmak aşağı medyayı pipetle.
    9. Hücreleri toplamak ve kalp doku parçalarının kirlenmesini önlemek için 40 mikron hücre süzgeçler süzülmeye ve daha sonra 5 dakika boyunca 200 xg'de iplik pelet hücreleri.
    10. Yıkama hücreleri bir kez MACS tamponu ve hücreler sıralamak için hazırız.
  2. Enzimi sindirimi yöntemi kardiyak fibroblastlar oluşturmak
    1. Hasat GFP 2.1.1 olumlu kalpler. 10 ml buz gibi soğuk DPBS ile 10 cm'lik bir tabak içine bütün kalpleri aktarın.
    2. Kan kaldırmak ve buz gibi soğuk DPBS ile bir kez yıkayın steril forseps ile ventriküller sıkıştırın.
    3. Diğer doku ve yağ özgür olmak kalpleri Trim.
    4. Hala gevşek bağlanmış kabaca 4 parçaya her kalbi kesin.
    5. En az 20 kupa, 8 ml ılık% 0.05 tripsin-EDTA ile 15 ml konik bir tüp içine kalpleri aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      1. 20-30 kalpler varsa, 10 ml ılık% 0.05 tripsin-EDTA ile 50 ml konik tüp içine kalpleri aktarın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    6. Tripsin atın ve HBSS ya da (20-30 kalpleri için) 10 ml ılık tip II kollajenin (0,5 mg / ml) (az 20 kalpleri için) 5 ml ilave edin.
    7. Vortex 4 ila 6 civarında bir hız seviyesinde 1 dakika boyunca vortexer tüp (sıvı kapağına kadar almazsa, o zaman hız gayet).
    8. 3-5 dakika boyunca, 37 ° C su banyosu içinde tüp inkübe edin.
    9. 1 dakika boyunca tüp vorteksleyin.
    10. Doku parçaları sakinleşene kadar yerçekimi ile 1 dakika boyunca sediment, 5 ml soğuk FB ortamı içeren yeni bir tüp içine sıvı toplamak.
    11. Tekrarlayın 2.2.6-2.2.10 3-5 kez yineleyin.
    12. 40 mikron hücre süzgecinden filtreleme tüm koleksiyonları birleştirintek bir hücre süspansiyonu yapmak.
    13. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
    14. Süspanse 10 ml MACS tamponu hücrelerinde ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje tabi tutulur.
    15. İsteğe bağlı: 1 ml RBC liziz tamponu (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3, ve 0.1 mM EDTA) ile kan hücreleri, tekrar süspansiyon hücrelerinin bir yeri vardır, daha sonra 10 ml MACS ile seyreltilir, 1 dakika boyunca buz üzerinde tutulur tampon ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje tabi tutulur. MACS tamponu ile bir kez daha yıkanır.
  3. MACS tarafından Thy1.2 + fibroblast İzolasyonu (manyetik aktive hücre sıralama)
    1. Tripan mavisi ile canlı hücre sayısını belirler.
      1. Adım 2.2.14 10 ml'lik hücre süspansiyonu 10 ul hücreleri dışarı atın. 10 ul% 0.4 tripan mavisi çözeltisi ile karıştırılır.
      2. Bir hemasitometre karışımı ekleyin. 3-5 dakika boyunca ayakta ve daha sonra mikroskop altında hemen incelemeye izin verin. Mavi ve canlı hücrelerde lekeli ölü hücreler boyanmamış bulunmaktadır.
      3. hemasitometre dört 1 mm köşe meydanlarda tüm canlı hücreleri saymak. Canlı hücre sayısını belirlemek: kare x 2 (seyreltme faktörü) başına ortalama sayısı 4 x 10 10 (hücre süspansiyonu toplam hacmi) x.
    2. Az 1 x 10 7 hücreleri için, 90 ul 10 ul Thy1.2 mikro ile tekrar süspansiyon hücreleri MACS tamponu soğutulmuş. 1'den fazla x 10 7 hücre vardır orantılı ise daha çok boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca bir buzdolabı (2-8 ° C) 'de inkübe edilir.
    3. 10 ml MACS tamponu ve sıkma örnekler 5 dakika boyunca 200 xg'de ekleyin; Tekrar 10 ml MACS tamponu ve santrifüj ile bir kez yıkanır.
    4. MACS tamponu içinde 2 ml hacim getirin.
    5. Bir MACS ayırıcı kaputu ayarlayın. Ayırıcı bir LS sütun ekleyin. MACS sütun tampon 3 ml bunu dengelenmeye uygulayın.
    6. Dengelenmiş LS sütunu içinden hücre süspansiyonu geçirin.
    7. Her tampon, 2 ml MACS ile 3 kez yıkanır.
    8. T off LS sütun alınO Ayırıcı ve MACS yeni bir 50 ml tüp içine tampon 2 ml ile 3 kez Zehir.
    9. 5 dakika boyunca 200 xg'de Spin.
    10. 10 ml FB medyada yeniden süspanse hücreleri, hücre sayımı ve uygun yoğunlukta plakalara tohum. Eksplant kültürü yöntemiyle üretilen fibroblastlar için, tohumlama hücreler yoğunluğu 2-3 x 10 4 hücre / kuyu 24 plaka olabilir. Enzimi sindirimi yöntemi elde fibroblastlar için, hücreler yoğunluğu yaklaşık 4-5 x 10 4 hücre / kuyu 24 oyuklu plaka olabilir.

ICM yeniden programlanması için retrovirüsün 3. Nesil

Not: steril koşullar altında BSL2 Biyolojik Güvenlik kabinesinde aşağıdaki adımları uygulayın. Transfekte hücreler, pipet uçları ve tüplerin doğru atılması, çevre ve sağlık tehlikeleri riskini önlemek için tavsiye edilir.

  1. 1 ug / ml puromisin ve 10 ug / ml ile takviye edilmiş b Plat-E medya Plat-E hücreleri korumak% 5 CO2 ile 37 ° C 'de lasticidin.
  2. 2 gün, puromisin ve blastisidin eksik Plat-E kültür ortamı ile orta yerine.
  3. 0. günde, 10 cm'lik kaplar yaklaşık Transfeksiyondan bir önceki gün plaka başına 4-5 x 10 6 hücre içine Plat-E hücreleri bölme. Hücreler ~ transfeksiyon günü% 80-90 ortak akışlı olmalıdır.
  4. 1. gün önce transfeksiyondan 1 saat içinde hücreler üzerinde transfeksiyon medya değişiklik kültür ortamı. Şöyle transfeksiyon prosedürü şöyledir:
    1. Ticari kitler kullanılarak transfeksiyonu
      1. 20 ul transfeksiyon reaktifi (örneğin, Lipofectamine) ve 500 ul karıştırın düşük serum ortamı (örneğin, Opti-MEM). Serum medya azaltılmış bir 500 ul retroviral plazmid 10 mikrogram ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) her karışımın inkübe edin.
      2. Yavaş yavaş transfeksiyon karışımı plazmid karışımı ekleyin. Bu adım 15-30 sn sürebilir. (Çözelti bulanık görünebilir) oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı.
      3. Hücrelere bilge karışım damla ekleyin.
      4. Bir 37 ° C inkübatör içinde gece boyunca inkübe edin.
    2. Kalsiyum Fosfat ile transfeksiyonu.
      1. 40 ul 2.5 M CaCl2 ve 440 uL GKD 2 O, daha sonra retroviral plazmid 20 ug (toplam hacim 500 ul böylece GKD 2 O miktarını ayarlamak) ekleyin karıştırın.
      2. 15 ml konik tüp HBS 2x 500 ul ekleyin.
      3. HBS vorteks ve bu arada HBS Kalsiyum-DNA karışımı damla damla ekleyin. Bu adım, her numune için 30 saniye sürer. Yani maksimum eşzamanlı 3-4 örnekleri yok.
      4. Daha uzun bir zaman bir çökelti alacak daha geniş ve daha az çökelti hücrelere yol açar 3 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübasyon için inkübe edilir.
      5. Karışım hücrelere damla damla ve 20X mikroskop altında gözlemlemek ekleyin. İnce çökeltiler (küçük olanlar bir sürü iyi ama birkaç büyük olanları iyi değildir) görülmelidir.
      6. 37 ° C inkübatör gecede inkübe.
  5. 2 gün, kültür ortamı önceden ısıtılmış 8 ml hücreler üzerinde ortamı değiştirmek. 24 saat süreyle inkübe edin.
  6. Gün 3 ve 4. günde, 0.45 mikron gözenek boyutlu selüloz asetat filtre boyunca, 10 ml steril bir şırınga kullanılarak ve 50 ml'lik bir tüp içine aktarılarak yemekler kültür süpernatan toplamak. Her 8 ml virüs içeren süpernatan için retrovirüs çökeltme çözeltisinin 2 ml ilave edilir. Yavaşça karıştırın ve 4 ° C'de gece boyunca kuluçkaya yatmaktadır.
  7. 5. günde, 30 dakika boyunca 4 ° C'de 1500 x g'de viral karışımı dönerler. Viral parçacıklar tüpün alt kısmında beyaz pelet görünmelidir.
  8. Süpernatantı atın. 5 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile bir artık çözeltinin dönerler. Pelet Çöken retroviral parçacıklar rahatsız etmemek için büyük bir özen, aspirasyon yoluyla sıvının tüm izlerini silmek.
  9. Her 8 ml viral süpernatan için 100 ml DPBS tamponu ile retroviral pelet yeniden süspanse edin. TümbölenBuz üzerinde virüsü. Hemen kullanın veya -80 ° C'de saklayın.

Kardiyak Fibroblastları 4. yeniden programlanması

  1. 10 ml ICM ortama 10 mg / ml polybrene solüsyonu 4 ul ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe karıştırın. Polibren nihai konsantrasyonu 4 ug / ml'dir.
  2. Fibroblastlar ile tohumlanmış 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna 500 ul ICM ortam ihtiva eden polybrene ekleyin.
  3. Eksplant kültürü veya enzimi sindirimi yöntemi 4-5 x 10 4 hücrelerinden içeren her birini 2-3 x 10 4 hücrelere 10 ul retrovirüs ekleyin. Virüs miktarı orantılı olarak, farklı kültür plakaları ya da bulaşıklar için artmış bir hücre sayısı ile yükseltilmelidir. Viral enfeksiyon izin vermek için 24-48 saat için 37 ° C inkübatör plaka koyun. Kalp yeniden programlama için zaman çizgisi Şekil 1'de gösterilmiştir.
  4. Viral iletimi sonrasında 500 ul düzenli ICM medya ile virüs içeren medya değiştirin.
  5. 2-3 günde ortamı değiştirmek. Viral transduse hücreleri, pozitif seleksiyon için, hedef hücrelere 2 ug / ml'de puromisin ile desteklenmiş ICM ortamı eklenir. Üç gün boyunca tutun. Bundan sonra, 1 ug / ml konsantrasyonunda da ICM ortam içinde puromisin korumak.
  6. Üç gün viral enfeksiyondan sonra, inkübatör dışarı plaka almak ve GFP ifade gözlemlemek için bir ters floresan mikroskop (20X) altına yerleştirin.
    Not: On gün viral enfeksiyondan sonra, hücreler, FACS analizi ve yeniden programlama etkinliğini belirlemek için ICC analizi için hasat edilebilir (adım 5 ve 6).
  7. Ondört gün viral enfeksiyondan sonra, B27 medya ile ICM ortamı değiştirin. Her üç günde ortamı değiştirmek. Spontan dayak hücre loci üç (enzim sindirim yöntemi hücrelerin) veya viral transdüksiyon sonra dört (eksplant kültürü yöntemiyle elde edilen hücreler) hafta görünebilir.

Yeniden programlanması Verimliliğinin 5. İmmünositokimyasal Analizi

  1. Durulayın hücrelerüç kez PBS soğuk buz ile; Fazla çözüm kaldırmak.
  2. 24 oyuklu plakalar, her çukuruna 0.5 ml ICC sabitleme tamponu ekleyin. 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreleri saptamak.
  3. PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
  4. 24 oyuklu plakalar, her çukuruna 0.5 ml ICC permeabilizasyon tamponu ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreleri geçirgenliği.
  5. PBS ile üç kez hücreleri durulayın.
  6. 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna bloklama tamponu, 0.5 ml ICC ekleme, 1 saat süre ile oda sıcaklığında inkübe edilir.
  7. ICC lekeleme tampon maddesi ile seyreltilmiş birincil antikorlar. De 200 ul her bir antikor çözeltileri ilave edin ve gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. Antikor seyreltme faktörleri Malzeme listelenmiştir.
  8. Bir sonraki gün, PBS ile üç kez yıkama hücreleri.
  9. Hücrelere 200 ul ikincil antikor çözüm ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
  10. Üç kez PBS ile hücrelerin yıkayın.
  11. Solüsyonu her bir çukura DAPI içeren montaj 150 ul ekle. 1 dakika boyunca çekirdekleri leke izin verin. Daha sonrayuvarlak cam kapak slip ile her iyi kapak ve yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için bir forseps ile taban yüzeyine karşı kayma basın.
  12. Fazla solüsyonun aspire ve örnekler görüntüleme için hazırdır. D14 de ifade yeniden programlanan hücreleri kalp işaretleyici cTnT ve αActinin gösteren temsili resim Şekil 2B'de gösterilmektedir.

Yeniden programlanması Verimliliği 6. FACS Analizi

  1. İyice DPBS ile bir kez yıkama hücreleri. Her oyuğa 0.3 ml tripsin (% 0.05) ilave edin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Yavaşça hücreleri kaldırma kolaylaştırmak için plaka dokunun. Mikroskop altında hücre ayrışması edin. En hücreleri kesilerek zaman, her bir kuyucuğa 1 mi FACS tampon ekleyin. Pipet yukarı ve ileri mekanik hücreleri ayırmak için aşağı.
  3. Kuyuya bir 96 derin oyuklu plakaya 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücrelerin aktarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de Spin hücreleri toplamak için.
  4. Bir kez yıkayın hücreleriFACS tamponu.
  5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca hücreler tekrar süspansiyon 100 ul sabitleme / permeabilizasyon çözümler ekleyin.
  6. 1x yıkama solüsyonu, pelet ile iki kez hücre yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
  7. 1x yıkama tamponu GFP ve cTnT karşı birincil antikor çözüm hazırlayın. İyice 50 ul antikor çözeltisi ile her bir örnek tekrar süspansiyon ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  8. 1x yıkama solüsyonu, pelet kez hücreleri yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
  9. Her bir örnek için Alexa Fluor 488 konjüge edilmiş eşek anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 647 konjüge edilmiş eşek anti-fare IgG içeren 50 ul ikincil antikor solüsyonu ilave. Karanlıkta 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
  10. 1x yıkama solüsyonu, pelet kez hücreleri yıkayın ve süpernatant kaldırmak.
  11. 400 ul sabitleme tampon maddesi (% 1 PFA ile DPBS) içinde süspanse edin hücreleri. Hücre süzgecinden kapaklı FACS tüpü hücreyi aktarın. Numuneler, FACS tespiti için hazırdır. Yeniden programlama efficienc temsili FACS analiziy pMxs-puromycin MGT Şekil 2A gösterilmiştir veya puromisin seçimi olmadan inşa kullanarak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yeniden programlama adımlar. Şekil 1'de şematik özetlenmiştir MGT transdüksiyon sonra, hücreleri yeniden programlama GFP ifade gibi erken transduced hücrelerin 3. Puromycin seçimi 3 gün başlar ve ilk iki haftasında korunur gün olarak tespit olabilir eğer PMX-puro -MGT yapı kullanılır. Gün 14 10. günde, cTnT ve αActinin gibi kardiyak markerlerinin ifadesi başlangıç ​​fibroblastlar, bir kalp hücre doğru yeniden programlamayı geçiren belirten iki ICC (Şekil

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolü kullanarak başarılı ICM nesil için, genel verimliliği üzerinde bir etkiye sahip birkaç önemli faktör vardır. Özellikle başlangıç ​​fibroblast koşulları ve retrovirüs kodlama MGT kalitesini büyük ölçüde yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir.

Mümkün olduğunca taze ve sağlıklı fibroblastlar oluşturmak için önemlidir. Eksplantlar yedi gün sonra tabaklara önce eksplant kültürü yöntemi için, fibroblastlar kullanılabilir. Enzimi si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 for both FACS and ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 for ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 for ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular stainingBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield solution with DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, high glucoseLife Technologies10-013
Penicillin-streptomycinCorning30-002
Non-essential amino acidsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albuminFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitation SolutionALSTEMVC-200
0.4% Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm Tissue culture dishes Thermo Scientific172958
60 mm center well culture dish  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Round glass cover slipElectron Microscopy Sciences72195-15

Referanslar

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 105Kardiyak fibroblastdo rudan yeniden programlamaICMkardiyomiyositlerMef2cGata4 Tbx5MGT polisistronik yap

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır