Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Özet

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Özet

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Giriş

Atomik düzeyde protein yapısını anlamak biyolojik yollar ve hastalıkların moleküler temelini açığa çıkarmak için bir anahtardır. X-ışını protein kristalografisi makromoleküler yapıları belirlemek için en yaygın olarak kullanılan / uygulanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin en önemli sorun uygun bir şekilde katlanmış, saf protein yeterli miktarda elde edilmesidir. Bu durum, özellikle, belirli post-translasyonel modifikasyonlar maruz salgılanan memeli proteinlerinin birlikte çalışan bir sorun haline gelir.

Bakteriyel-ifade proteinler Protein Bilgi Bankası ¹ yatırılır kristalize proteinlerin başlıca kaynağıdır. Bunların pahalı olmayan, hızlı ve tipik olarak proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi için bakteriyel ekspresyon sistemleri büyük ölçüde tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bakteriler içinde ifade edilen memeli proteinlerinin hücre dışı alanları genellikle düzgün fo homojen elde edilmesi için, bu durumda katlama ve kapsamlı saflaştırma adımları gereklidir katlanmış edilmezlded proteini. Ayrıca, birçok memeli proteinleri düzgün katlanmasına ² elde etmek için post-translasyonel glikozilasyon gerektirir. Maya ya da böcek hücrelerinde ekspresyonu ve glikosilasyon katlama sorunun üstesinden de, glikosilasyon içeren post-translasyonel modifikasyonlar, yanlış ya da homojen olmayan modifikasyonlara sahip proteinlerin, sonuçta memeli hücreleri ³ kişilerce önemli ölçüde farklıdır.

Memeli hücreleri, uygun post-translasyonel modifikasyonları ve katlama sağlamak için gereken tüm moleküler yapıların ifade ederler; Bununla birlikte, bu ifade sistemleri tipik olarak, sınırlı miktarlarda ve reaktifler ve sarf maliyetlerinin yüksek, en çok laboratuarlar tarafından tercih edilmemektedir. Polietilenimin (PEI), standart transfeksiyon reaktifi nispeten ucuz ama önemli bir sitotoksisite ve düşük transfeksiyon verimi, hücre ortamı, DNA artan maliyeti ile sonuçlanır ve ekipman kültürlenmesi getirir. PEI Birçok alternatifler pahalıya bulunmaktadır. Biz elegeliştirilmiş hücre kültürü bir araç kombinasyonu tanımlama ve kimyasal olarak tek aşamalı saflaştırma ile salgılanan bir memeli proteinlerinin ifadesi için hızlı ve nispeten pahalı olmayan yöntemi için değiştirilmiş PEI, bu sorunlar. Bu sağlam bir yöntem, fonksiyonel ve biyokimyasal çalışmalar ⁴ için yeterli verim sağlar ve bazı durumlarda, daha fazla arıtılmadan kristalleştirme için uygun bir protein ile sonuçlanır.

Bu protokol ekspresyonunu maksimize etmek ve süspansiyon içinde yetiştirilmiş insan embriyonik böbrek (HEK) 'de salgılanmış proteinleri memeli hücreleri için 293F elde etmek için çeşitli teknikler tarif eder. Transfeksiyon verimliliği (ve maliyet), protein üretimi ve saflaştırılması tüm büyük ölçüde bu protokolü takip ederek geliştirilmiştir. Tek basamaklı halka açma reaksiyonu yoluyla karbamatlar eklenmesiyle tadil PEI (PEI-TMC-25, ref ⁵ ayrıntılı olarak tarif edilen sentez ve özellikleri) büyük ölçüde, transfeksiyon verimi iyileştirir katyonik gelen sitotoksisitesini azaltırbuna göre membran bozulması ve deney maliyetlerini azaltır. Bundan başka, hücre canlılığı ve protein ifadesi büyük ölçüde glukoz ve vitamin temin etmek için kültür takviyelerinin eklenmesiyle geliştirilmektedir. Önemli kifunensine ile glikosile proteinlerin, tedavi üretimi için, Manosidaz I'in bir toksik olmayan kimyasal inhibitörü yerine tek bir N-asetilglukosamin proteinleri üretmek üzere endoglikosidaz EndoHf çıkarılabilir tanımlanan, olgunlaşmamış glikanlar ile proteinler üretir Tam uzunlukta bir glikanın ⁶ N-bağlantılı. Son olarak, serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış ortam içine proteinleri salgılanmaktadır yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için, hızlı ve kolay saflaştırılmasını sağlar. Tek aşamalı nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) reçinesi saflaştırma, bazı durumlarda, kristalizasyon için yeterli saflıkta bir proteini elde edilebilir, üstte kalan sıvı türlerin kirletici ve çoğunu çıkarır.

Protokol

Büyük ölçekli geçici Transfeksiyonu için Plazmid DNA Miligram metrajlarının 1. Üretim

1. Kısıtlama alanı klonlama ya da diğer uygun teknik kullanılarak yüksek bir kopya sayısı memeli ifade vektörüne ilgili proteini klonlama.
   1. En iyi sonuçlar için, sahip pHLsec ⁷ vektörü, kullanmak yerleşik C-terminal 6His-etiketi, güçlü bir promotör Kozak dizisi ve optimize salgılama sinyali.
2. Yetkili hücreleri üzerine plazmid Transform.
   1. Plazmid DNA 1 ug üzerine E. coli hücreleri 20 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
   2. 42 ° C'de ısı şoku hücreler 35 sn için, daha sonra 2 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın.
   3. Mikrobiyal büyüme ortamı (SOC) 300 ul ilave edin ve 220 rpm'de çalkalanarak, 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. Uygun antibiyotik seçimi ile agar plaka üzerinde plaka hücreleri.
      1. Plazmid pHLsec vektörü ise 100 ug / ml karbenisilin kullanın.
3. Luria Broth (LB) Medya 250 ml kültür koloni 220 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de 100 ug / ml bir antibiyotik (karbenisilin) ​​O / N ile takviye edilmiştir.
4. Üreticinin protokolüne uygun olarak yüksek hızlı Plazmid Maxi Seti kullanılarak DNA kültürden saflaştınlır.
   1. Bunun yerine tamponu TE tampon EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 'de DNA Zehir.
   2. -20 ° C de transfeksiyon ve mağaza için gerekli miktarda saflaştırılmış plazmid alikotu.

293F Hücreler 2. Büyük ölçekli kültür ve geçici transfeksiyonu

1. 10 glutamin ml ve 5 ml Pen / Strep (her ikisi de 100x) ile Ek 1 L 293F ortam. 4 ° C'de saklayın. 5 ml Pen / Strep protein verimi artırır, serum içermeyen koşullar ve düşük antibiyotik konsantrasyonu transfeksiyon sırasında hücre canlılığını artırır yeterli bir güçtür.
2. 1 L polikarbonat 300 mi ortam içinde kültür 293F hücreleri delikli kapaklı Erlenmeyer flasks bölmeli% 8 _CO2 ile 37 ° C 'de s, standart bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde çalkalandı.
3. Hücreleri 5 x 10 ⁵ / ml yoğunlukta Transfeksiyondan bir gün önce sulandırmak.
4. 293F ortam içinde hücre artışı ağırlık / hacim% 2,% 10 hacim ekleyerek transfeksiyon, ek Kültür aracı maddesi, günde.
   1. 500 mg / dL glukoz konsantrasyonu elde etmek için gerektiği gibi üreticinin talimatlarına ve kullanım takviyeleri göre glikoz monitörü kullanarak glikoz konsantrasyonu ölçün.
5. Protein glikosilasyonu kontrol etmek için bu aşamada kifunensine (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ilave edilir.
6. DNA hesaplayın hacmi 1 x 10 ⁶ hücre başına 1 ug plazmid için gereklidir. Steril koşullar altında, 5 ml serum barındırmayan ortam içinde DNA seyreltin.
7. Transfeksiyon reaktifi ul 2 için 1 ug plasmid için gereken transfeksiyon reaktifi hacmini hesaplar. Steril koşullar altında, 5 ml serum barındırmayan ortam içinde transfeksiyon reaktifi (PEI-TMC-25) seyreltin.
8. Eklemek1 ml artışlarla, DNA çözeltisi içine transfeksiyon reaktifi karıştırmanın. Oluşturulması için reaktif DNA kompleksleri, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra damla damla bir tarzda hücreler üzerine çözeltisi ilave edilir.
9. Transfekte hücreler 72-96 saat boyunca protein ifade etmek için izin verin. ~ 10% hacim Cell Boost günlük Media, ya da gerekli olan Supplement glikoz 400-600 mg / dl okumaya devam.

3. Arıtma

1. Pelet hücreleri ve süpernatan toplamak için 1300 x g'de 20 dakika süre ile, bir santrifüj şişesi içine santrifüj kültürünün süzün. Gerekirse, ikinci bir kez spin ve / veya yüzer netleştirmek için 0.22 mikron filtre kullanın.
2. % 10 hacim 10x Ni-NTA bağlayıcı tampon ekleme (1,5 M NaCl, 0,5 MK ₂ HPO _4, 0.1 M Tris, pH 8.5, 50 mM imidazol).
3. Bir kolon içinde Ni-NTA bulamacın 2 ml ilave edilmesi ve 1 x bağlanma tamponu 10 kolon hacminde (CV) ile dengeye bir yerçekimi sütunu hazırlayın. Mümkünse, 4 ° C odasındaki tüm sütun adımları. Alternatively, soğuk protein ve sütun safhasından önce buz üzerinde tüm tamponlar ve protein tutmak ve toplanan akış buz üzerinde.
   Not: Ni-NTA bulamaç hacmi ile% 50 reçine ve üreticinin belirttiği bağlama kapasitesi 50 mg / ml'dir. Ni-NTA boncuklar çoklu kullanım için yeniden şarj edilebilir
4. Reçine üzerinde süpernatant akış ve flow-through toplamak. Bu adımı yineleyin.
5. Yıkama tamponu, 10 CV ile yıkayın (300 mM NaCI, 50 mM K ₂ HPO _4, 20 mM imidazol, pH 8).
6. Elüsyon tampon çözeltiden 5 CV protein Zehir (300 mM NaCI, 50 mM K ₂ HPO _4, 250 mM imidazol, pH 8).
7. Eğer deglikosilasyon gereklidir:
   1. 0,5 ml'lik bir son hacim için, bir santrifüjleme konsantratör kullanılarak 0,43 ml elüat konsantre edilir. Çökeltiler için, 16.000 x g ve 4 ° C ısıda santrifüj ile pislikleri pelet.
   2. 500 mM Na-sitrat pH 5.5, 50 ul ekle.
   3. EndoHf (1 x 10 ⁶ U / ml) 20 ul ekle. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
      Değile: Enzim konsantre proteini toplamak için neden olabilir, 37 ° C 'de en iyi şekilde çalışır. SDS-PAGE veya immunoblotting tarafından değerlendirilen deglikosilasyon, eksik ise, RT inkübasyon uzatın. Enzim 4 ° C'de aktivitesi bulunmamaktadır.
   4. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da nihai depolama tamponu içinde yıkayın Amiloz Reçine 3 kez: EndoHf kaldırın. 4 ° C'de 1 saat boyunca reçineyle protein inkübe edin. Boncuk pelet ve süpernatant toplamak için 1000 xg'de 5 dakika Spin.
   5. Uygun molekül ağırlıklı akış kesici santrifüj filtresi kullanılarak protein konsantre edin ve depolama tamponu (150 mM NaCI ve 20 mM HEPES pH 7.5) içine tampon değişimine.

Sonuçlar

Burada miyeloid hücreler 2 (hTREM2, kalıntılar 19-132) ifade insan proteini tetikleme reseptöründen salgılanan 13 kDa immünoglobin (Ig) etki uygulandığında, bu sentezleme sisteminin sonuçlar izler. TREM2 iki disülfid bağları ve iki tane N-bağlantılı glikosilasyon sitesi olan tek bir hücre dışı Ig alanı içeren bir tip I transmembran proteindir. Birçok Ig proteinleri ⁸ farklı olarak, TREM2 bakteriyel inklüzyon cisimcikleri ^9'dan yeniden katlama için uygun değildi. Daha...

Tartışmalar

HEK 293F hücreleri post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren proteinlerin üretimini sağlam sunuyoruz. Bu sistem disülfıdlere, glikosilasyon, aksi takdirde daha rutin ifade araçlarını kullanarak yokluğunda olacağını fosforilasyon içeren özgün katlanmış proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir bir ifade verir. Buna ek olarak, bu sistem, sadece birden fazla plazmidin birlikte transfeksiyonu ile ekspresyonu ve çoklu protein kompleksleri saflaştırılması için de kullanılabilir. TREM2 Bunun yanı s?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919