JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Özet

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Giriş

Kardiyak doku mühendisliği daha yakın hem de fare kardiyomiyositlerinin 1-6 ve yapılan tam fonksiyonel, dayak dokular, insan kök hücresi kaynaklı kalp miyositlere 7-12 sonuçlarını yayınlayarak çoklu gruplar, son on yılda büyük ölçüde ilerlemiştir. Kalp doku mühendisliği alanında iki birincil ve esas bağımsız hedefler tarafından tahrik edilmektedir: 1) işlevini 4-6 iyileştirmek için kalpleri başarısız içine transplante edilebilir eksojen greft geliştirmek; ve 2) fizyoloji ve hastalık eğitimi için in vitro modellerinde geliştirmek, ya da terapötik gelişim 2,7 için tarama araçları olarak.

Üç boyutlu (3-D) hücre kültürü 3-D matrisi geleneksel 2-D tek tabakalı hücre kültürü daha doğal kalp mikro yansıtır, yeni nesil tarama araçları geliştirmek için gerekli olarak kabul edilir; Gerçekten hücre biyolojisi bazı yönlerini 2-D vs 3-D kültürlerinde 13,14 temelde farklıdır . hücre dışı bir matris, bir hücre popülasyonu: Buna ek olarak, işlenmiş kardiyak dokular tam olarak tanımlanmış bileşenlerin inşa edilir. Ekstraselüler matriks kompozisyonu (genellikle fibrin 9 veya kollajen 7,8,10) sıkı kontrol edilirken geleneksel mühendislik insan kalp dokuları için giriş hücre kompozisyon daha az bir yönlendirilmiş kalp farklılaşma hücrelerin tüm karışımı ile tanımlanır ya embriyonik kök hücreler (ESC 7,9) ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC 10,12) dokulara ilave edilir. Spesifik hücre hattı ve ikinci farklılaşma protokolünün verimliliğine bağlı olarak, kardiyomiyositlerin sonuçtaki yüzdesi üzerinden% 90 den az% 25, belirli kardiyomiyosit fenotipi arasında olabilir (yani, ventricular-, atrial-, kalp pili gibi ya da) Ayrıca bile olmayan kardiyomiyosit fraksiyon 15,16 derece heterojen ve farklılaşmış kardiyak m olgunluk değiştirebilir, değişir17 yocytes.

Son kardiyak doku mühendisliği çalışmaları kalp reporter insan embriyonik kök hücre hattı 8 veya hücre yüzey işaretleyicileri 18 farklılaşma kardiyak miyosit bileşenini izole etmek için kullanılan biriyle, hücrelerin giriş nüfusunu kontrol etmek için çalıştı. Sadece kalp miyositler oluşan başlangıçta doku ideal gibi görünüyor olsa da, bu gerçeği değil durumda olduğunu; Kalp miyositler 1 oranında: fibroblastlar yüksek seğirme kuvveti 8 üreten sadece kardiyak miyositler oluşan hECTs bazı gruplar, 3 bulma, fonksiyonel dokulara sıkıştırmak için başarısız. Canlı hücre sıralama için yüzey belirteçleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre seçim yöntemleri kullanılarak, tanımlanmış hücre populasyonlarına sahip hECTs oluşturmak mümkündür. Kardiyak olmayan stromal hücrelerin belirteçleri CD90 19,20 gibi, farazi fibroblast markeri olarak bir süre için uygun olduğu halde, kardiyak miyositler yüzey işaretleyicileri daha zor olmuşturtespit etmek. SIRPα insan kalp miyositlere 18 için belirlenen ilk kalp yüzey belirteçleri arasında yer aldı ve kalp soy için son derece seçici olduğu gösterilmiştir. Hücreler bir fibroblast-benzeri fenotip (Josowitz, yayınlanmamış gözlemler) sergileyen CD90 + nüfusu ile hemen hemen saf kardiyomiyositlerde verir - Son zamanlarda, iki sıralama SIRPα + ve CD90 için bulduk. Kardiyomiyositlerde ve CD90 + fibroblastlar - SIRPα + / CD90 1 kombinasyonu: Bu toplanan bulgulara dayanarak, burada biz bir 3 kullanan hECTs oluşturmak açıklar.

tamamen tanımlanmış insan kalp dokusu mühendisi yeteneği güçlü tarama araçları oluşturmak için değil, aynı zamanda gelişmekte olan hücreye ve gen bazlı kardiyak tedaviler araştırmak için bir model sistemleri geliştirmek için değil, sadece esastır. Mezenkimal kök hücrelerin (MSC) 21 olmak üzere hücre tipleri kullanan kalp yetmezliği için özellikle çok sayıda hücre tedavileri, içinde , kardiyak kök hücreler 22 ve kemik iliği mononükleer hücreleri 23-25, klinik çalışmalarda test edilmiştir. İlk sonuçların pek 21,23,25 umut verici olsa da, ilk fayda genellikle zaman 26-29 üzerinde azalır. Benzer bir eğilim nedeniyle MSC takviyesi önemli bir fonksiyonel fayda gösterir kemirgen mühendislik kardiyak dokularda rapor edilmiştir, ancak fayda uzun vadeli kültürü 1 sırasında sürekli değildir. sub-optimal performans altında yatan hücre tedavileri düzenleyen mekanizmaların bizim sınırlı bilgidir. onların olumlu etkisi yanı sıra, miyosit-nonmyocyte etkileşimlerin potansiyel olumsuz sonuçların uygulamak nasıl tedavi hücreler daha derin bir anlayış, kalp yetmezliği olan hastalarda minimal yan etkileri klinik olarak anlamlı ve sürekli faydalar veren gelişmiş tedavilerin gelişimini, sağlayacaktır.

Burada, interrog tanımlanmış hECTs kullanımını tarifhücre tabanlı tedavinin mekanizmaları yedik. kontrollü doku kompozisyonu kardiyomiyosit performansını etkilemeden belirli faktörleri belirlemek önemlidir. Sıçan AKTS 1'de gösterildiği gibi, doğrudan ilgi terapötik hücre tipi (örneğin, MKH) ile hECTs tamamlayan, kardiyak miyosit performansı üzerindeki etkileri ortaya çıkarabilir.

Aşağıdaki çok adımlı protokol çoklu doku biyoreaktör imalatı izledi ve doku yapımı ve fonksiyonel analiz bir açıklama ile sonuçlandırılması, yönetmenliğini kardiyak kök hücre farklılaşması ile başlar. Bizim deneyler NIH onaylı H7 insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, aşağıdaki protokol ayrıca bir HESC hattı ve benzer sonuçlar ile üç uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) çizgileri kullanılarak test edilmiştir. Biz Hect üretiminde kardiyomiyosit farklılaşma ve başarı verimlilik, özellikle fo, hücre hattı bağımlı olabilir buldukBireysel hastalar türetilen R hiPSC hatları. Bu protokolü takip ederek, iki adet 6-kuyu yemekleri 20 gün boyunca ayırt ve yeterince altı tanımlanan dokuları yapmak için, sıraladıktan sonra yaklaşık 2,5 milyon miyositleri verir 1680000 hESC (oyuk başına 140,000 hücre), toplam kaplanmıştır.

Protokol

Not: Bir HEPA filtreli sınıf II biyolojik güvenlik kabini kullanılarak aseptik koşullarda tüm hücre manipülasyonlar gerçekleştirin ve 0.2 mikron filtre aracılığıyla filtre edilerek tüm çözümler sterilize edin. Aynı aseptik şartlarda ya da bir laminer akış kaputu ya doku yapım ve fonksiyon testlerini gerçekleştirmek.

Kardiyak Farklılaşma için Hazırlık H7 hESC 1. Tohum

  1. (Gün 1) bazal membran Matrix hazırlanması
    1. 4 ° C'de bir gece boyunca buz üzerinde HESC kalifiye bazal membran matrisi 150 ul tablet çözülme.
  2. Kaplama Tabaklar üzerinde hESC (Gün 0-4) Kaplama
    1. buz soğukluğundaki DMEM / F12 12 ml çözülmüş matris seyreltilir ve iyice karıştırın.
    2. Transfer 6-yuvalı doku kültürü çanağı tedavi her oyuğuna DMEM / F12-matris solüsyon içerisinde 1 mi. Matris kapladığı iki adet 6 oyuklu plakaların her bir kısım.
    3. en az 1 saat oda sıcaklığında kaplanır inkübe edin.
      Not: InTecrübe, parafin ile sızdırmaz kaplanmış tabaklar kullanımdan önce 10 güne kadar, 4 ° C de bir matris çözelti içinde saklanabilir.
    4. Yaklaşık% 75 izdiham, non-enzimatik ayrışma reaktif 6 ml kullanılarak 10 cm çanak H7 hESC ayırmak. 5 dakika sonra, yumuşak bir tek hücre kazıyıcı kullanılarak kültür yüzey hücreleri kazıyın ve steril bir 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
    5. kök hücre hattı yayılma için (daha fazla hESC ayırmak ayrılma reaktifi 5.5 mi bırakarak) yeni bir steril 15 ml tüp 15 ml tüp ve transferi hücreleri ile ayrıştırma çözeltisinin 0.5 ml çıkarın.
    6. 20 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre 0.5 ml Pelet. Süpernatantı ve sonra yavaşça yeni, kaplamalı, 10 cm doku kültür tabağına aktarın ve kök hücre hattı sağlamak için 37 ° C ve% 5 CO2 muhafaza penisilin-streptomisin,% 1 ihtiva eden, pluripotent kök hücre ortamı 8 ml tekrar süspansiyon.
      Not: Ortam değişiklikleri sırasında buz üzerinde pluripotent kök hücre ortamını tutun.
    7. Bu sırada, geri kalan ayrışma 5.5 mi çözeltisine 10 mm kaya önleyicisi Y-27632 5.5 ul ve başka 5-10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin devam etmektedir. Yavaşça 5 ml serolojik pipet ile hücreleri karıştırın. tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar, daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de topak hücrelere inkübe devam edin.
    8. pluripotent kök hücre medya 5 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve bir hemositometre kullanılarak bir hücre sayımı gerçekleştirin.
    9. Tohum oyuk başına 140,000 hücrelik bir yoğunlukta 6-çukurlu çanak her bir. Altı tanımlanan dokuların toplam oluşturmak için iki adet 6-kuyucuğu Tohum. kaplama sonrası kalan hücrelerin imha edin.
    10. Pluripotent kök hücre ortamı ile de 1 ml doldurmak ve 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir. Yirmi dört saat sonra, ortamı çıkartın ve her bir kuyu (Şekil 1A taze pluripotent kök hücre medya 2 ml ekleyin ).
    11. Her gün plakalarının izdiham kontrol edin ve hücreler yaklaşık% 75 izdiham ulaştığınızda farklılaşma başlar (Şekil 1B - D).

Kardiyomiyositlerde 30,31 İnsan Embriyonik Kök Hücreleri 2. (Gün 4-24) Farklılaşma

  1. (Gün 4-7, Farklılaşma Gün 0-3) Mesoderm İndüksiyon
    1. 10 mi B27 (insülin) olmadan ek ve penisilin-streptomisin stok solüsyonu (10,000 ug / ml streptomisin 10.000 lU / ml penisilin), 5 ml, 500 ml RPMI 1640 birleştirerek RPMI farklılaşma ortamı I (Tablo 1) hazırlayın. 4 ° C'de 50 ml tüpler içinde buz üzerinde kısım, ve depolamak.
    2. (Gün 4, Farklılaşma Gün 0) I, her kuyudan pluripotent kök hücre ortamını çıkarın RPMI farklılaşma ortamı 12 ml (10 mM stok, 6 uM nihai konsantrasyon) küçük molekül GSK3 inhibitörü CHIR99021 2.4 ul ekleyerek mezoderm endüksiyon ortamı hazırlamak birND mezoderm indüksiyon ortamı 2 ml oyuk başına değiştirin. inkübatör plaka dönün.
      Not: çok hücre ölümü genellikle CHIR99021 (Şekil 1 E) eklenmesi ile meydana gelir. tek tabaka iyileşir fakat uzak DMEM / F12 durulaması ile ölü hücreleri durulanması önemlidir.
    3. Yukarıda açıklandığı gibi (Gün 5, Türev Gün 1) taze mezoderm indüksiyon ortamını hazırlayın. her bir eski Ortamı çıkarın ve DMEM / F12, 1 ml ile bir kez durulama ile sabitleştirilir. her bir kuyunun taze mezoderm indüksiyon medya 2 ml ekleyin.
      Not: Ortalama 0-10 her gün Durulama ölçüde kardiyak miyositlerinin verim ve saflık arttırır.
    4. (Gün 6, Türev Gün 2) kalp indüksiyon ortamı çıkarın ve oyuk başına 1 ml DMEM / F12 ile bir kez yıkayın. (Hiçbir küçük moleküller ama hala insülin) takviyesi olmadan B27 (ilave) 2 ml RPMI farklılaşma medya ile durulama değiştirin ve inkübatör dönmek.
  2. (Gün 7-13, Farklılaşma Day 3-10) Kalp Mesoderm İndüksiyon
    1. (Gün 7, Türev Gün 3) RPMI farklılaşma ortam I'in 12 ml küçük molekül Wnt önleyicisi IWR-1 (nihai 10 mM stok, 5 uM), 6 ul ekleyerek kalp mezoderm endüksiyon ortamı hazırlamak
    2. , Her bir medya çıkarın oyuk başına 1 mi DMEM / F12 ile bir kez yıkayın ve kardiyak mezoderm indüksiyon ortamı 2 ml yerine ile sabitleştirilir.
    3. yukarıda tarif edildiği gibi (Gün 8, Farklılaşma Gün 4) kalp mezoderm indüksiyon ortamı ilave 12 ml hazırlayın. Medya önce gün eklenen kaldır oyuk başına 1 ml DMEM / F12 ile bir kez yıkayın ve kuyu başına taze kardiyak mezoderm farklılaşma medya 2 ml ile değiştirin ve inkübatör dönmek.
    4. (Gün 9-10, Farklılaşma Gün 5-6) İki gün, kalp mezoderm indüksiyon ortamını çıkarın ve DMEM / F12 her kuyu ile 1 ml durulayın.
    5. Taze RPMI farklılaşma medya 2 ml ekleyin (hiçbir küçük moleküller ama hala insülin olmadan B27 () ek ilave)ve her bir kuyu için inkübatöre plaka dönüş.
  3. (Gün 11-24, Farklılaşma Gün 7-20) embriyonik kök türetilmiş kardiyak miyosit Organizasyon / Olgunlaşma
    1. 10 mi B27 (insülin) takviyesi ve penisilin-streptomisin stok çözeltisi, 5 ml, 500 ml RPMI 1640 birleştirerek RPMI farklılaşma ortam II (Tablo 1) hazırlayın. 4 ° C'de 50 ml tüpler içinde buz üzerinde kısım, ve depolamak.
    2. (Gün 11, Türev Günlük 7) her gelen (insülin olmadan) RPMI farklılaşma ortamı çıkarın ve 1 ml DMEM / F12 ile durulayın. her birine (insülin) yeni bir RPMI farklılaşma medya II 2 ml de yerine ve inkübatör geri döner.
      Not: Kendiliğinden atan önce Gün 7 ve 10 arasında dikkat edilmelidir dayak bu süre içinde gözlenmez, bu tipik olarak kötü farklılaşma etkinliğini göstermektedir. protokol dayak gözlemlemek için bir çaba güne 15 yılına kadar devam edilebilir, ancak hiçbir dayak gün 15 ile çıkmış ise st en iyisidirYeni bir farklılaşma sanat.
    3. (Gün 12-24, Farklılaşma Gün 8-20) Her gün, eski farklılaşma ortamı çıkarın ve taze RPMI farklılaşma medya II 2 ml ile değiştirin dayak tek tabaka hücre olgunlaşmasını ve organizasyonunu izin vermek de (Şekil 1F, Video Şekil 1 başına ).
      Not: Kalan hücre ölümü bağlı olarak, farklılaşma 10 gün boyunca DMEM, 1 ml / F12 ile durulanması gerekli olabilir.

3. (Gün 24 Farklılaşma Gün 20) kardiyak miyositler ve Fibroblast benzeri Hücreleri İzolasyon

  1. Monolayer gelen Hücreleri ayırmak
    1. farklılaşma ortamı çıkarın ve 1 ml PBS ile bir kez yıkayın.
    2. her bir enzimatik ayrılma çözeltisi (% 0.04 tripsin /% 0.03 EDTA) 1 ml tek tabakaları ayrıştırmaları.
    3. 10 dakika kuvöz içine plaka taşıyın. Bu arada, tripsin nötralizasyon çözeltisinin 6 ml ROCK inhibitörünün 12 ul ekle.
    4. gentlY tripsin solüsyonu nötralize etmek için plakanın her oyuğuna ROCK inhibitörü içeren tripsin nötralizasyon çözeltisinin 1 ml.
    5. Steril bir aktarım pipeti kullanarak, yavaşça hücre kümeleri bozmaya her iyi karıştırın.
    6. 15 ml bir santrifüj tüpüne 6-çukurlu plaka 12 ml aktarın.
      Not: iki adet 6 oyuklu plakalar Bu protokolde kullanılan olduğundan, iki adet 15 ml'lik tüp gerekli olacaktır.
    7. daha sonra bir plakanın her bir kuyucuğu, ve transfer 3 mL PBS sıralı çanak üzerinde kalan hücreleri toplamak için her bir sonraki oyuk aynı 3 ml aktarın. de hücre içeren aynı 15 ml santrifüj borusu ile son kalan 3 ml aktarın.
    8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet.
  2. FACS Canlı Hücre Sıralama için Hücreleri hazırlayın
    1. KAYA inhibitörünün 50 ul buz üzerinde PBS, 45 ml Fetal Sığır Serumu 5 ml ekleyerek boyama tamponu hazırlayın.
    2. Hücre pel süpernatantı(3.1.8 olarak) izin ve boyama tamponu 1.2 ml süspansiyon haline getirin.
    3. Buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş, 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 200 ul aktarın. Bu negatif boyama kontrolü olacak.
    4. (: 500 dilüsyon 1), 4 ul CD90-FITC (1: 250 seyreltme) 2 ul SIRPα-PE / Cy7 buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş, 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu geriye kalan 1 ml aktarın ve ekleme . Yavaşça bir transfer pipet ile hücre süspansiyonu karıştırmak ve buz dönün.
    5. 1 saat süre ile 4 ° C 'de, buz üzerinde bir kavrama çalkalayıcıda, negatif kontrol ve numune, inkübe edin.
    6. İki 15 ml santrifüj tüplerine (insülin) RPMI medya 3 ml ekleyerek numune toplama tüpleri hazırlayın. Her tüpe ROCK inhibitörü 3 ul ekleyin ve buz üzerinde saklayın.
    7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de boyanan hücrelerin pelet ve durulama başına buz soğukluğunda PBS en az 10 ml ile iki kez yıkayın.
    8. lekeleme tampon maddesi, 5 ml DAPI (1 ug / ml) 1 ul ekle. NazikçeBir transfer pipeti kullanarak, DAPI içeren lekeleme tampon maddesi 1-3 ml numune pelletini.
    9. Negatif kontrol (hiçbir DAPI eklenen) boyama tampon 500 ul ekleyin.
    10. Yavaşça hücre kümeleri kaldırmak ve buz üzerinde FACS tüpler Polistiren aktarmak için 40 mikron hücre süzgecinden negatif kontrol ve numune hem filtre. Hemen hücre sıralayıcı numune getirecek.
    11. Kurulan canlı hücreye benzer sıralama yöntemleri 18, (negatif DAPI) canlı hücreler için seçin kapıları ayarlamak için negatif kontrol kullanın ve FITC + (yani, CD90 + fibroblastlar) ve PE / Cy7 + (yani, SIRPα + kardiyomiyositlerde hem toplamak ) 20 psi (Şekil 2) bağımsız nüfustur.
      Not: Kapıları ayarladıktan sonra, negatif kontrol kardiyak troponin-T boyanarak farklılaşma etkinliğini belirlemek için% 4 PFA sabit olabilir.
      Not: Bazı araştırmacılar, bir kullanmayı tercihizotop kontrol yerine lekesiz kontrolü non-spesifik antikor bağlanması için telafi etmek için kapıları ayarlamak için kullanılır. Bir sözde floresans eksi bir (FMO) kontrol başka bir olasılıktır. Nedeniyle FITC, DAPI ve PE-Cy7 sinyallerinin net bimodal dağılımı, biz konservatif muhtemelen bazı gerçek pozitifler dışlar, ancak herhangi bir yanlış pozitif en aza indirmek için yardımcı olumlu kapısı içine kadar amaçlayan, pozitif nüfustan Geçitli.
  3. Doku Mühendisliği Hazırlama Hücre reaggregation
    1. Hücre tür sonra,% 10 Fetal Sığır Serumu, penisilin-streptomisin,% 1 ve% 0.2 Amfoterisin B ( "NBS media") ihtiva eden DMEM 1 ml toplama tüpleri ve tekrar süspansiyon iki pelet.
    2. 60 cm2 (10 cm tabak) başına 2 milyon hücre yoğunluğunda petri tedavi 1 oranında olmayan bir doku kültüründe Birleştirilen hücreler plaka a 3 SIRPα + ve CD90 + hücreler bir araya toplamaktadır. NBS medya ve 10 10 ml ekleyin1 ve Kaya önleyicisi Y 27632 l.
    3. küçük kümeler halinde hücre reaggregation izin vermek için 48 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde bir hücre süspansiyonu yerleştirin.

4. İnsan kalp doku mühendisliği

  1. Çok doku-biyo reaktörünün fabricate
    Not: Şekil 3A illüstrasyonlar tamamlamak için detaylı biyoreaktör tasarımı şemaları ile CAD dosyaları yazarlardan istek üzerine temin edilir.
    1. Makine politetrafluoroetilen 9 x 33 x 3.25 mm kuboidinin içine 0,5 mm çapında altı eşit aralıklı delik PDMS ana kalıp.
    2. Bir parmak frezemi, makine 25 x 35 x 11 mm 3 ölçüm polisülfon bir çerçeve kullanılması. Çerçevenin amacı tablaya kuyulara aynı hizada (yukarıda yapılan döküm inşa) PDMS mesajları tutmaktır.
    3. 1 mm parmak frezemi kullanarak, makine 6 kuyu (6 x 1 x 1 mm3), siyah bir poli 20 x 40 x 5 mm 3 parça halinde ayrı, 4 mmtetrafloroetilen taban plakasını oluşturmak için.
    4. / Oranı ağırlıkça 1 ve altı kuvvet algılama mesajların iki satır oluşturmak için özel politetrafloroetilen kalıp (adım 4.1.1) ekleyin ve bir gecede ve altında inkübe: 10 elastomerik taban ve polidimetilsiloksan (PDMS) için kür ajanı karıştırın 80 ° C'de vakum altında kurutuldu. Kür sonra, yavaşça ana kalıp PDMS çıkarın ve dikkatlice geliştirilmiş kontrast ve otomatik gerçek zamanlı sonrası saptırma izleme için siyah kalıcı bir kalem ile her yazının başında işaretleyin.
      Not: polytetrafluorethylene oldukça yumuşak ve kolayca zarar görebilir. sistemi ve tutarlı PDMS sonrası geometri uzun ömürlü olması için döküm PDMS için ana kalıp önce temizlerken dikkatli kullanın. A 0.5 mm tel her kullanımdan sonra mesaj için delikler temiz, ama deliklerin içini kazımak değil dikkat çekmek için kullanılabilir.
      Not: Alternatif bir oda sıcaklığında birkaç saat boyunca gazdan arındırın vakum altında PDMS, daha sonra çevre basıncında kanşım tedavi sağlar.Bu sertleştirme işlemi sırasında PDMS oluşturan daha az artık gaz kabarcıklarına neden olabilir.
    5. Buhar Otoklav tüm bileşenleri sterilize edin.
      Not: PDMS ana kalıp (adım 4.1.1) ve polisülfon çerçevesi (adım 4.1.2) hem de tekrar kullanılabilir. döküm (adım 4.1.4) oluşturulan PDMS mesajlar da yeniden kullanılabilir ancak yaklaşık 10 kullanımlar içindir. ana kalıp kullanılarak gerektiği kadar Ancak, daha PDMS mesaj oluşturulabilir.
  2. Reaggregated Kalp Hücreleri toplamak
    1. inkübatör reaggregated hücreleri çıkarın ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne reaggregation ortam 10 ml aktarın.
    2. PBS 3 ml plaka yıkayın ve reaggregation ortamı içeren aynı bir 50 ml santrifüj tüpüne durulama aktarın.
    3. 10 cm tabak% 0.04 tripsin /% 0.03 EDTA 3 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca inkübatör dönmek.
    4. 5 dakika sonra, tam hücre dissocia sağlamak için 10X büyütmede bir ters bileşik mikroskop ile plaka incelenmesiçanak yon. Bazı kalıntı kümeleri hala bağlı ise, yavaşça kümeleri ayırmak için plakayı çalkalayın. kümeler bağlı kalır, başka bir 2-3 dakika boyunca inkübatör dönmek. daha uzun on dakika ya da oluşabilir önemli hücre ölümünü inkübe etmeyin.
    5. Bir kez tüm Hücreler, tripsin nötralizasyon çözeltisinin 3 ml ekleyin, ayrılır. Yavaşça reaggregation ortamı içeren 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne tripsin hücre çözeltisi ve transferi ile nötralizasyon çözeltisi karışımı ve bir kez PBS ile yıkayın.
    6. 5 ml PBS ile tüm çanak durulayın ve hücreleri ihtiva eden aynı bir 50 ml tüp aktarın.
    7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri.
    8. Süpernatantı ve NBS ortam 1 ml pelletini, daha sonra bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
    9. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g pelet ve supernatant çıkarın. Kardiyak hücreler (CD90 + hücreleri ve SIRPα + myocytes) artık doku yapımı için hazırız.
  3. (İsteğe bağlı) İlgi Yan Hücreleri Toplama
    Not: Yalnızca SIRPα + kardiyomiyositlerde ve CD90 + fibroblast benzeri hücreleri ihtiva eden tanımlanmış dokulara ek olarak, doku işlevi üzerindeki etkilerini sorgulamak için ilgi ek hücrelerin ilave edilmesi mümkündür. Örneğin sıçan erişkin sıçan tasarlanmış kardiyak dokular 1 işlevini geliştirmek için gösterilmiştir. Aşağıdaki isteğe bağlı adım tanımlanan sistem için ek hücrelerin toplanmasını açıklar.
    1. Ilgi ek hücre tipi% 0.25 tripsin /% 0.1 EDTA kullanılarak (örneğin, mezenkimal kök hücreleri) toplayın.
    2. daha sonra ilgi hücre tipi için uygun hücre kültür ortamı, 5 ml tekrar süspansiyon, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri. Örneğin erişkin için, DMEM,% 20 fetal sığır serumu, kültür Cı penisilin-streptomisin,% 1 ve% 0.2 amfoterisin B ile desteklenmiş kullanımıarşın.
    3. Bir hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar pelet hücreleri.
    4. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne hücre kültür ortamı ve transfer 1 ml süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın.
    5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de Pelet hücreleri.
    6. süpernatantı. ek hücreler artık doku yapımı için hazır.
      Not: Yan hücreler doku toplam hücre sayısının% 10 arasında bir konsantrasyonda ilave edilir, her doku 500.000 kardiyak hücreler (CD90 + stromal hücreler hem de içerdiği için, daha sonra tarif dokuların bu doku başına 50.000 takviye hücreleri gerektirir ve SIRPα + miyositler).
  4. İnsan Engineered Kalp Dokuları oluşturma
    Not: Oda sıcaklığında buz üzerinde tüm çözümler ve hücreleri saklayın. Aşağıda listelenen tüm hacimler doku başına bulunmaktadır. Tipik haliyle, yaklaşık altı dokuları iki inşa edilebilir 6 oyuklu PLKalp farklılaşmalar ve ates.
    1. 1 M NaOH 1,5 ul 10x PBS 9.6 ul ve steril aşırı saf deiyonize su 24.9 ul mi 3.125 mg / 5 mg / ml kolajen stokunun 60.0 ul seyreltilir.
      Kritik adım: hava kabarcıkları düzgün doku oluşumunu bozacak şekilde hazırlanması sırasında her çözüme hava kabarcıklarının giriş kaçının.
    2. Kollajen mix oluşturmak için hem 10x MEM 12.0 ul ve seyreltilmiş kollajen karışıma 0.2 N HEPES pH değeri 9 ekleyin. kollajen karışıma hava kabarcıklarının girmesinin önünü almak amacıyla 15 ml santrifüj tüpüne tarafında aşağı her iki çözüm ekleyin.
    3. Kollajen karışımına mi 0.9 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar bazal membran matris ekleme ve son doku karışımı oluşturmak için buz üzerinde muhafaza edin. kollajen nihai konsantrasyon ml / 2 mg olmalıdır.
    4. 25 ul bir son hacim başına doku karışımı reaggregated hücrelerin 500,000 ekler (miyosit + fibroblast konsantrasyonu 20.000.000 / ml) ve dolguhücresiz NBS ortam veya ilgi duyulan (ör hMSCs) arasında ek bir hücre tipinin 50,000 hücre ve iyice karıştırın ya doku daha hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere.
      Not: takviye hücrelerin sayısı, farklı uygulamalar için değişecektir. İşte% 10 takviyesi kullanılır.
    5. kuyuya hava baloncuklarının oluşumunu olmayan bakımı, pipet biyoreaktör taban plakası altı kuyu her hücre süspansiyonu 25 ul ile.
    6. mesaj bir çift her bir hücre süspansiyonu ihtiva eden girecek şekilde karşıt mesajların 6 çift oluşturan polisülfon çerçevenin her iki yanında PDMS kuvvet sensörleri iki sıra itin ve ardından taban plakası üstünde çerçeve ters çevirin.
      Not: polisülfon çerçeve PDMS uyum yardımcı olmak için sekmeleri içerir.
    7. Dikkatle sonra 10 cm çanak içine onun kapaksız çanak yerleştirin, bir 60 mm çanak içine, aşağı baseplate, biyoreaktör yerleştirin üstünde 10 cm kapağını yerleştirin ve bütün biyoreaktör düzeneğini taşımakdoku kültürü inkübatör, jel doku için iki saat bekledikten.
    8. 2 saat sonra, inkübatörden biyoreaktör çıkarın ve taban plakasını kaplayacak kadar bütün takımın NBS ortam 14 ml, ekleyin. inkübatör dönmek ve her gün medyanın yarısını değiştirmek.
    9. Kırk sekiz saat sonra, dikkatli, hafifçe bir seferde çerçeve kapalı birkaç milimetre taban plakası her tarafı hareket ettirerek taban plakasını kaldırmak ortamı değiştirmek, sonra dokular medyaya, aşağı bakacak şekilde, biyoreaktör dönün.
    10. Her gün NBS kültür ortamı yarısını değiştirerek devam edin.
      Not: doku Spontan kasılmalar olarak günün erken saatlerinde 5 olarak 7 ölçülebilir seğirme kuvvetleri üreten, en erken 3 gün gibi doku inşaat sonrası görülebilir.

Sonuçlar

Kalp miyositleri elde etmek için, Boheler ve Lian farklılaşma yöntemleri biraz değiştirilmiş bir sürümü 30,31 kullanılır. Farklılaşma, hücre büyümesi log-faz esnasında başlar, ama aynı zamanda başlangıç ​​popülasyonu (yaklaşık% 75 en uygunudur) sıralama sonra bir hücre kullanılabilir sayısını elde etmek için yeterli sıvıyla zorunludur. Tipik haliyle, H7 hESC için, 37 ° C 'de muhafaza esas 8 ortam ve% 5 CO2 inkübatöründe 6 oyuklu çanak oyuk başına 1...

Tartışmalar

tanımlanmış insan mühendisliği kalp dokularında (Hect) İnşaatı insan kalp miyosit fonksiyonunun daha tutarlı ve güvenilir bir model sağlayabilir. Kritik olarak, sistemdeki tüm hücre ve hücre-dışı bileşenler bilinmektedir ve dolayısıyla farklılaşma işleminden kaynaklanan diğer bilinmeyen hücre tipleri karıştırıcı etki çıkarılması istendiği gibi işlenebilir. hızlı hücre büyümesi ve yüksek verim dengelemek için, farklılaşma ideal dört gün sonra kaplama HESC% 75 birleşme nokt...

Açıklamalar

The authors declare that they have no competing financial interests.

Teşekkürler

Bu çalışma TJC, KDC, Amerikan BDG Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) araştırma hibe konseyi NIH / NHLBI PEN sözleşme HHSN268201000045C için NIH (1F30HL118923-01A1) tarafından desteklenmiştir Ek finansman rl NIH DRB 5T32GM008553-18 tarafından ve Sistemleri ve gelişimsel olarak NIDCR-Disiplinlerarası Eğitim bir staj olarak TJC sağlanmıştır kalp Derneği (12PRE12060254) RJ ve HKSAR Araştırma Hibe Konseyi (/ 11 T13-706 TBRS) Biyoloji ve Doğum Kusurları T32HD075735. Yazarlar ayrıca minnetle, teknik yardım için biyoreaktör ve Memduh Eldaly işleme ile yardım için New York City College of Zahn Merkezi'nde Arthur Autz kabul etmek istiyoruz. Biz de cömertçe insan mezenkimal kök hücreleri sağlamak için kalp farklılaşma tavsiye Dr. Kenneth Boheler, Dr. Joshua Hare teşekkür ederim.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell CultureCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with InsulinLife Technologies17505055
B27 without InsulinLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Human Embryonic Stem CellsWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf SerumLife Technologies16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation ReagentStem Cell Technologies7174
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)Stemgent04-0012Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell SortingCompanyCatalog NumberComments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) PromoCellC-41200
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin/0.1% EDTAFisher Scientific25-053-CIOptional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS PacketsSigma-AldrichP3813
Collagen, Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Keep on ice
DMEM/F12Life Technologies11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High GlucoseSigma-AldrichD5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Sodium HEPESSigma-AldrichH3784
Sodium HydroxideSigma-Aldrich221465
MaterialsCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher ScientificNC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom TubeCorning352235With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tubeCorning352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plateCorning353046
Cell Scraper, DisposableBiologix70-2180
PolysulfoneMcMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)McMaster-Carr
EquipmentCompanyCatalog NumberComments
Dissecting MicroscopeOlympusSZ-61Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing SystemAstro-Med, IncGrass S88X Stimulator
High Speed CameraPixelinkPL-B741UOr similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature ControlUsed to maintain media temperature during data acqusition.
Custom MaterialsCompanyCatalog NumberComments
LabView Post-tracking Programavailable upon request from the authors

Referanslar

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 109H cre tedavisidoku m hendisli iinsan pluripotent k k h cre elde edilen kardiyak miyositlermezenkimal k k h crelermezenkimal stromal h crelerbiyom hendislikh cresel mikro evresininkardiyovask lerSirpaCD90

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır