Akış Sütun Perde: Verimliliği ve Duyarlılık Optimizasyonu

Özet

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Özet

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Giriş

Son yıllarda Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) için kolon teknolojisi çok gelişmiş olan; zirve kapasiteleri büyük ölçüde küçük parçacık boyutlarının kullanılması ve daha verimli çekirdek kabuk parçacıklarına ölçüde sayesinde artmıştır. Ayrılmalar genellikle daha verimli olduğundan zirveleri artık daha keskin ve ^1-8 dolayısıyla uzun boylu, çünkü bir akış üzerindeki etkisi duyarlılığında bir artış olmuştur.

Bununla birlikte, radyal yatak heterojenlik tüm sütunlara performansında bir sınırlayıcı faktör hala, ama bu chromatographers yıllardır bu bilinen beri yeni bir hikaye değil. Sütun yatak radyal yönde ^9-12 hem heterojen olup, ^10,12-15 eksen sütun boyunca. Duvar etkisi özellikle ayırım performansı ^7,16-18 kaybı önemli bir katkıda bulunuyor. Shalliker ve Ritchie ⁷ geçenlerde sütun yatak heterojenite yönlerini gözden geçirilmiş ve dolayısıyla bu Tartışılan olması gerekmezd burada daha. Kâfi demek olsa da, sütun yatak ambalaj yoğunluğu değişim ve duvar etkileri bantları kısmen çorba dolu andı- fişleri sütun aracılığıyla Zehir şekilde çözünen fişin bir bozulma, neden bu oldukça olan ince düz katı diskler ⁷ den çanaklar genellikle temel öğretim metinlerinde tasvir. Deneyler yatağı boyunca çözünen göç görüntülenmiştir ki böyle yapılmıştır zaman sütun içinde fiş profilleri kısmen boş ve bandın atık bölümü büyük ölçüde örnek fiş duvar bileşenidir. Sonuçta bu diskler, katı ve ^12,14,17 düz olsaydı gerekli olandan bu 'kısmen boş' fişleri ayırmak için çok daha fazla tabak almasıdır. Duvar etkileri ve radyal ambalaj yoğunluğu varyasyon ile ilişkili sorunların genişleten grup üstesinden gelmek için, Aktif Akış Teknolojisi (AFT) olarak bilinen kolon teknolojisinin yeni bir form ^7,19 tasarlanmıştır. Bu tasarımın amacı neydisütunun ¹⁹ radyal merkezi bölgesinde akıtılarak mobil fazın böyle olduğunu, duvar bölge boyunca çözücü salgılayan fiziksel ayırma yoluyla duvar etkilerini ortadan kaldırmak için. AFT sütunların iki ana türü vardır; Paralel Segment Akış (PSF) sütunlar ve Perde Akışı (CF) kolonlar ^7. Bu protokol CF kolonların kullanımı ve optimizasyon amaçlı olduğundan, PSF sütunları daha ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır.

Perde Akış (CF)

Perde Akış (CF) sütun biçimleri giriş ve sütunun çıkışında hem de AFT son parçaları kullanmaktadır. AFT sonu ekleri bir çok portlu montaj içinde bulunan bir dairesel frit oluşur. Frit üç kısımdan oluşur: bağlantı ucunun orta noktasına, uç teçhizat çevresel bağlantı (lar) ile aynı hizada olan bir gözenekli dış kısmı ve su geçirmez bir halka ile hizalı olan bir gözenekli, radyal merkezi kısım olduğu herhangi bir çapraz engelleyen iki gözenekli kısımları ayıran. frit ¹⁹ radyal merkezi ve dış bölgeleri arasındaki akışı ile 1 AFT frit tasarımını göstermektedir ve Şekil 2 CF sütun biçiminde göstermektedir. ek mobil faz, radyal merkezi bölgesi ile eriyiklerin göçü 'perde' girişine çevresel bağlantı noktası üzerinden sokulur iken bu operasyon modu (CF), numune, Ek giriş radyal merkezi bağlantı noktasına enjekte edilir sütun. Bu nedenle örnek, yalnızca geçtiği mobil faza sahip kolonun dış bölge sütunun radyal orta bölgesinde bir yatak girer. (: Periferik bağlantı noktası merkez) 4.6 mm iç çapı (id) kolonu uç parçası girişi için uygun ^6,7,16 olan çalışmalar yaklaşık 40:60 bir hacimsel akış hızı oranı göstermiştir. CF sütun kıç çıkışı göreceli kısmına merkezi ve çevresel akışın ayarına izin verir ve hemen hemen arzu edilen herhangi bir Rati için değişik olabilirbasınç yönetimi o. Bir CF sütunun optimizasyonu önemli ölçüde bu tür ayırma verimliliği veya algılama hassasiyeti gibi kolon teknolojisinin çeşitli fonksiyonel yönlerini artırabilir. Bu şekilde, bir "duvara az", "sonsuz çapı" ya da "sanal" sütunu ^6,10,18,20 kurulur. CF sütun amacı aktif duvar bölgesine ulaşma numunenin önlemek için kolon boyunca numunenin taşıma yönetmektir. Böylece, dedektöre çıkış üzerine çözünen konsantrasyonu Ultraviyole (UV) algılama ¹⁶ kullanırken ve hatta kitle spektral algılama ⁶ kullanarak daha zaman geleneksel kolon biçiminden daha yaklaşık 2,5 kat daha fazladır duyarlılığını artırarak, maksimize edilir.

algılama hassasiyeti artar beri CF sütunlar ideal düşük konsantrasyon numuneler için uygundur. Bu kütle spektrometresi (MS), ⁶ olarak hızlı sınırlı dedektörler, akış eşlendiğinde Dahası, idealdir. bir AÖrneğin bir 4.6 mm kimliği biçiminde FT kolon,% 21 orta akışını çıkan ayarlayarak, aynı doğrusal hızlarda çalıştırıldığında, standart 2.1 mm id biçimi sütunu olarak bir dedektörün çözücünün aynı hacimde teslim ayarlanmış olabilir. Aynı şekilde AFT sütun da% 43'e merkezi akışını çıkan ayarlayarak, bir 3.0 mm id sütunu olarak bir dedektörün aynı hacim yükü teslim ayarlı olabilir. Aslında, herhangi "sanal" sütun biçimi analitik gereksinimi ^6,18,22 göre üretilebilir. Girişte bu özel olarak tasarlanmış son parçaları kullanarak ve çıkış gerçek bir duvar daha az sütun kurulmuş olmasını sağlar.

Girişin santral ve periferik limanlarına solvent dağıtım sistemi kurmak için iki yol vardır:. Split akış sistemi ⁶ ve iki pompa sistemi ^6,7 3 bu CF sistemi set up her göstermektedir Şekil.

Split-akış sistemi

benna bölünmüş akış sistemi (Şekil 3A) enjektör giden pompa akışı mobil faz bir akış akışı daha sonra bağlanır enjektörüne bağlı bir sıfır ölü hacim T-parçası ile bölünmüş ön enjektörün sütunun giriş sonu montaj merkezi bağlantı noktası. Mobil fazın ikinci akış akışı enjektör by-pass ve sütun girişine çevresel bağlantı noktasına bağlıdır. Merkezi ve periferik için pompa enjektörden, çizgiler kolonuna bağlanmadan önce, yani: akış bölme sırasında, akım akışı oranı 40:60 (çevresel merkezi) ayarlanır.

İki pompa sistemi

CF sütun sütun giriş sonu uydurma iki akış akışı gerektirir. Ayarlamak HPLC aleti, bölünmüş akış otomatik örnekleyici / enjektör türüne bağlı olarak mümkün olmayabilir ve bu nedenle KF sonra 2 pompa (Şekil 3B ²¹⁾ ile elde edilebilir. Her pompa ayrılan ve merkezi ya da periferal bağlantı ve akış hızı, merkezi bağlantı noktası için akış% 40 ve periferik bağlantı noktası için% 60 temsil etmek üzere ayarlanır, ya bağlanır. Toplam akış oranı 1.0 ml ^dk-1 ise, örneğin, merkezi bir pompa akış hızı, 0.4 ml min ayarlanır ^-1 ve periferik pompası 0.6 ml dk ^-1 ayarlanır.

çalışma modu seçimi HPLC enstrümantasyon ve operasyon kromatografik modunda büyük ölçüde bağlıdır. Örnek yük konumu ve numune arasındaki basınç değişikliği pozisyon bölünmüş akış oranını bozan oluşabilir ve böylece bu durumda kurmak çift pompa optimum CF performans için önerilen olacağını enjekte bazı otomatik numune alma cihazı Örneğin. Ne olursa olsun CF sütunun girişi için seçilen kurmak solvent dağıtım sistemi, CF çıkış optimizasyonu aynı kalır. CF sütunun çıkış merkezi liman Smal ile Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) dedektör bağlı olduğuHortumun olası hacmi diye post-kolon ölü hacim etkilerini en aza indirmek için. CF sütunlar dar delik sütunlar taklit beri, kolon çıkışına ve dedektör arasındaki ölü hacim CF sütunun ayırma performansı için zararlıdır. Merkez liman ve böyle verimlilik ve hassasiyet band genişletilmesi, kayıp olarak ölü hacim etkilerini en aza indirmek için UV-Vis dedektör arasındaki boru hacminin küçük miktarda sağlamak için kritik öneme sahiptir. Dolayısıyla, dar delik boru (0.1 mm id) kullanımı kolay uygunsuz ölü hacim eklemeden basınç ayarlamaları izin tavsiye edilir. Boru, aynı zamanda periferal noktasına bağlanır ve atık yöneliktir. CF sütunun çıkışma üzerine bölütleme oranı analisti amaca uygun herhangi bir orana ayarlanabilir. 4.6 mm id CF kullanıldığında, örneğin, ya 43:57 ya 21:79 (merkezi: periferik) olarak oranını ayarlamak için sık sık uygun bir 'sanal' 3,0 mm id sütunu veya 2.1 mm id sütunu taklit,saygıyla. Bu şekilde ayırma performansı kolayca tezgah işaretlenmiş olduğunu. segmentasyon oranı merkez bağlantı noktasına bağlı ve bir dönem zamanla çevresel port çıkan akış olduğunu dedektör çıkan akış miktarını tartılması ile ölçülür. Her bir bağlantı noktası üzerinden yüzde akışı daha sonra tespit edilebilir ve oranlar tüpüne eklenmiş uzunluğunu değiştirerek ya da başka bir iç çapa (id) sahip olan boru sistemi kullanılarak ayarlanabilir.

Bu video protokolü gelişmiş kromatografik performans için CF kolonun çalışma ve optimizasyon prosedürleri ayrıntıları.

Protokol

Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrollerinin uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı parmak ayakkabı) kullanımını sağlamak.

Not: Bu protokol UV-Vis detektörü ile birleştiğinde bir HPLC sistemi üzerinde bir CF sütunu nasıl kullanılacağına ilişkin talimatlar yer almaktadır. protokol okuyucu varsayarak kromatografi temel bilgi ve deneyime sahiptir yazılmıştır.

HPLC Enstrüman 1. Kur

Not: çözücülerin seçimi, dedektör dalga boyu, Bu bölümde yani analistlerin ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir ve akış hızı oİlgili örnek uygundur.

1. Mobil faz olarak B hattı hat A için% 100 saf su ile HPLC aleti (örneğin, Milli-Q su) ve% 100 metanol hazırlamak ve üretici şartının pompaları temizleyin.
2. 254 nm UV-Vis detektörü ayarlayın.
3. set-up öncesi bir enjeksiyon akış bölme modunu, ya da bir çift pompa akış set-up birini seçin. Bölünmüş akış modu için Adım 3'e geçin çift pompası modu için, 2. Adıma geçin.

2. Split-akış Sistem Kurulumu

1. Otomatik numune enjektör vanasından pompa hattını ayırın.
2. Pompa hattına T-parça takın.
3. T parçasının her porta 0.13 mm ID tüp 15 cm parça eklemek.
4. Otomatik numune vana enjektör T-parça bir tüp bağlayın.
5. 1.0 ml dk pompayı ^-1.
6. % 40 KF sütunun girişine, ayarlamak için akış segmentasyon oranını pompa hatları bağlamadan önce: 6 % 0 (merkez hattı: periferik çizgi) olarak adım 2.7 izler.
7. Bölünmüş akış sistemi üzerinde CF giriş oranının Tuning
   1. bir analitik terazi kullanılarak iki boş toplama gemilerin kitle ölçün ve bir toplama merkezi damar ve (periferik bağlantı noktasına T-parça hattı için bağlantı noktası ve bir merkezi otomatik numune hat için bir tane) periferik diğerini etiket .
   2. 1.0 dakika boyunca, olan kütle 2.7.1 ölçülmüştür toplama kabı içine (kolon bağlanacak noktasında) enjektör gelen hat çıkan mobil faz toplanır.
   3. Analitik ölçekte toplama kabı yeniden tartın ve toplanan mobil faz kütlesini belirler.
   4. Tekrarlayın periferik bağlantı noktasına bağlı olan T-parçasından hattı çıkan eluent için 2.7.3 için 2.7.2 adımları.
   5. Akış oranını belirlemek (mi ^dak-1), aşağıdaki denklemlere göre akış her bir çizginin:
      1 "src =" / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/>
   6. % 40 akış oranını ayarlayın:% 60 (±% 2) (merkez noktasına enjektörden hattı: periferal noktasına T-parça çizgi). Merkezi bağlantı noktası akış oranına enjektörden hattı% 40 üzerinde ise, boru iç çapı azaltarak veya bunun uzunluğunu arttırarak basınç düşüşünü artırır. Merkezi bağlantı noktası akış oranına enjektörden hattı 40% altında ise, boru iç çapı artırmak veya borunun uzunluğunu azaltır.
   7. Akış oranları ayarlanmış sonra pompa kapalı akış açın.
   8. Kolon girişinin merkez liman ve kolon girişinin periferal portuna T-parça hattına enjektörden hattı bağlayın.
   9. Yavaş yavaş 1.0 ml dak akış hızı ^-1% 100 hat B'de rampa
   10. izin vererek kolon (4.6 mm id x 100 mm uzunluk) dengelenmesi100% metanol (hat B) Hareketli faz, 1.0 ml dk sütun aracılığıyla akan akış ^-1 10 dakika karıştırıldı. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre tartılır.
   11. CF çıkış ayarı için 4. 'CF çıkış akımının Tuning' Adım gidin.

3. İkili Pompa Sistem Kurulumu

1. enjektöre HPLC sistemi pompası bağlayın ve sonra sütunun merkezi giriş portuna enjektörden hattı bağlayın.
2. Sütunun giriş periferik bağlantı noktasına doğrudan ek pompası bağlayın. bu ikinci pompa enjektör by-pass edip unutmayın.
3. 0.4 ml dk ^-1% 100 Metanol (hat B) (1.0 ml dk ^-1 toplam debi% 40 temsilcisi) merkezi bağlantı noktasına bağlı sistem pompanın debisini rampa.
4. Aşama 3.3 ile aynı zamanda, toplam akış bölgesinin% 60 0.6 ml ^dak-1 (temsilcisine periferal pompa akış hızını rampa1.0 ml dk ^-1) 100% Metanol (hat B).
5. 1.0 ml dk sütun aracılığıyla akan akış ^-1, 10 dakika boyunca% 100 metanol (hat B) Hareketli faz vererek kolonu (4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk) dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre tartılır.
6. CF çıkış ayarı için 4. 'CF çıkış akımının Tuning' Adım gidin.

CF Outlet Akış 4. Tuning

1. 0.13 mm ID tüp 15 cm parça kullanılarak UV-Vis detektörü merkezi çıkış portunu bağlayın.
2. CF sütunun periferal çıkış ağzına 0.13 mm ID tüp 15 cm parça bağlayın.
3. analitik terazi iki boş toplama gemilerin kitle tartılır ve bir gemi santral ve diğer çevresel etiket.
4. 1.0 dakika boyunca, kütle 4.2 olarak ölçüldü merkezi toplama kabı etiket, içine UV-Vis detektörü (merkezi akış) çıkan mobil faz toplamak.
5. Analitik ölçekte Toplanan geçen madde ihtiva eden toplama kabı yeniden tartın ve toplanan mobil faz kütlesini belirler.
6. Tekrarlayın 4.4 çevresel çıkış noktasından hattı çıkan eluent 4.5 için yineleyin.
7. Aşağıdaki denklemlere göre akışının her hattından akışı yüzdesini belirlemek:
   
8. UV-Vis merkez akış yüzdesi% 21 üzerinde ise, basınç düşüşünü artırır.:% 79 (±% 2) (hattından periferik çıkış akımını UV-Vis merkez çıkış akışı:)% 21 akış oranını ayarlayın UV-Vis detektörü çıkış bağlanmış boru iç çapı azaltarak veya bunun uzunluğunu arttırır. UV-Vis gelen orta akış oranı% 21 altında ise, UV-Vis detektörü çıkış bağlanmış boru iç çapı artan, veya borunun uzunluğunu azaltır. boru uzunluğu değişmiştir her zaman, tekrar4.7 4.3 adımları tekrarlayın.
   Not: "sanal" 2.1 mm İD modunda CF kolon analiz için hazır hale gelir.

Sonuçlar

AFT sütunlar sütun yatak heterojenitesini üstesinden gelmek ve ayırma performansını artırmak için birden çok sütun son parçaları uzmanlaşmış bir frit tasarımı (Şekil 1) kullanılarak geliştirilmiştir. CF kromatografi sütunları (Şekil 2) ayrılması performansına arası laboratuar çalışması bu protokol ²³ 3. bölümünde açıklandığı gibi (Şekil 3B) kurmak çift pompa sistemi ile gerçekleştiri...

Tartışmalar

Bu çalışma verimliliği ve duyarlılık açısından analitik performansını test etmek için CF kromatografi kolonlarının laboratuvarlar arası analizini içeriyordu. 3 'kısmında tarif edildiği gibi CF kolonu ikili pompa sistemi ile oluşturulmuştur. (: Periferik merkezi) CF sütunun girişine çift pompa sistemi 40:60 akış oranını elde etmek için 'kurdu. 40:60 (merkez: Periferik) akış oranı, sırasıyla,% 40 ve toplam akış hızının% 60 temsil değeri her bir pompanın akış oranının ay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand