JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Özet

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Giriş

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy1. The majority of patients are diagnosed after the cancer has disseminated throughout the peritoneal cavity. Once the cancer has spread throughout the peritoneal cavity, cytoreductive surgery and chemotherapy are often not sufficient treatment to prevent cancer recurrence and chemoresistance, resulting in a less than 30% 5-year survival rate. Ovarian cancer metastasis is predominantly limited to the peritoneal cavity, and several other cancer types, including gastric, pancreatic, and colon cancers, metastasize to the same anatomic sites in the peritoneal cavity. In general, ovarian cancer cells detach from the in situ carcinoma in the fallopian tube or the primary ovarian tumor, travel in peritoneal fluid as single cells or spheroids, and attach to mesothelium-lined surfaces of the omentum, bowel, and abdominal wall2.

The tumor microenvironment plays an important role in disease progression and chemoresistance in many cancers3-6. The peritoneal cavity is a unique microenvironment, with a mesothelial cell monolayer covering the majority of surfaces (Figure 1A)7. The mesothelial lining acts as a barrier that creates a low-friction surface, which tends to be protective against cancer cell adhesion8. Immediately underneath this mesothelial-lined surface is a layer made predominantly of fibroblasts and extracellular matrix (ECM), which promote cancer cell adhesion and invasion8. Ovarian cancer cells secrete factors that induce changes in the mesothelial cell lining that enhance ovarian cancer cell adhesion, invasion, and metastasis9,10. Ovarian cancer cells adhere to the mesothelial surface via integrin and CD44-mediated mechanisms (Figure 1B)11-16.

Historically, several 3D models have been developed to investigate ovarian cancer interactions with the microenvironment. Some of the first models studied ovarian cancer-ECM interface17-21, ovarian cancer-mesothelial cell communication13,14,21-24, or both25 (reviewed by us 26). Niedbala et al. discovered that ovarian cancer cells display a quicker and firmer adhesion to ECM than to mesothelial cells or to plastic alone25. However, these models did not histologically resemble the peritoneal microenvironment. Therefore, we established a 3D organotypic model to more thoroughly replicate the ovarian cancer microenvironment. In order to better understand the role of the microenvironment and the interaction between cancer and peritoneal cells in the peritoneal dissemination of ovarian cancer, we have developed a 3D organotypic in vitro culture model of the peritoneal cavity lining (schematic in Figure 1C). The proposed model is composed of primary human fibroblasts and ECM, covered with a layer of primary human mesothelial cells-each cell type is isolated from human omentum. Histologically, this model resembles the normal peritoneal or omental lining, and provides a surface on which we can study the tumor microenvironment, the interaction between cancer cells and normal tissue, and the processes of cancer cell adhesion, invasion, and proliferation8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tarif edilen tüm araştırma protokolleri Chicago Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi'nde (KİK) tarafından incelenmiştir. Aydınlatılmış onam ameliyattan önce her hastadan alındı ​​ve çalışma Chicago IRB Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Korunması için insan dokusu taşıma ve hücrelerin kontamine riskini azaltmak için ne zaman bir biyolojik güvenlik kabini tip 2 ve eldiven kullanılmalıdır.

Birincil dönüştürülmemiş Stromal Hücreleri 1. İzolasyon ve Kültür

  1. İnsan doku toplama ve hazırlama.
    1. Abdominal operasyon esnasında alınan insan omentum, 2 cm3, örneklerini elde edilir ve hemen RT fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (Şekil 2A), dokuyu bırakın. X 2 cm omentum 3 cm'lik bir parçası, tipik olarak 1.000.000 birincil insan mezoteliyal hücreleri (HPMC) ve 200,000 primer insan fibroblastları ve normal omental fibroblastlar (NOF) verir.
    2. Doku 3 için 0.5 xg'de dalmış PBS aşağı Spindak kısa sürede sonra toplanması (<2 PBS içinde saat) ve 50 ml konik bir tüp içinde 20 ml taze PBS doku aktarın. 15 cm çapında, steril kültür çanak (Şekil 2B) neşter ile kıyma ile 5mm 3 parçaya doku yukarı kesti.
  2. Birincil insan mezotel hücre izolasyonu 8
    1. HPMC izole etmek için, 50 ml konik tüpler içine kıyılmış doku transferi ve katı parçaları üst (Şekil 2C-D) float için 1 dakika bekleyin. HPMC ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) alt kısmında sıvı içinde mevcut olacaktır. Borunun alt ve yeni bir konik tüp içine sıvının çıkması için bir pipet kullanın. 3 dakika boyunca 0.5 xg sıvıyı aşağı Spin ve HPMC / RBC pelet süpernatant aspire.
      1. , Kıyılmış dokuya 20 ml PBS eklemek doku, aşağı spin, yükselmeye bir pipet ile ve HPMC / RBC tüpüne alttan sıvıyı çıkarmak için izin ve kaldırın: işlemini üç kez tekrarlayınsüpernatant. Tüm spin tamamlanır ve süpernatan aspire edildikten sonra, pelet HPMC ve RBC'yi içerecektir.
    2. Plaka% 10 cenin sığır serumu [FBS],% 1 MEM vitamin [93 mg / L],% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 tam büyüme ortamı, 15 ml DMEM (75 cm 2 şişe içine pelet tüm hücrelerin mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]).
    3. Ek HPMCs izole etmek için ikinci bir PBS yıkama yapın.
      1. Doku üstüne yüzen ikincil PBS yıkama için, 200 rpm'de, 20 ml PBS içinde 10 dakika süreyle 37 ° C 'de geri kalan katı doku sallayın, daha sonra 1 dakika bekleyin. 3 dakika boyunca 0,5 x g'de santrifüj, yeni bir tüp içine tüpün altındaki sıvıyı çıkarın ve süpernatan aspire.
      2. Tam büyüme ortamı 15 ml ayrı 75 cm 2 şişe yıkama, ikincil PBS tüm HPMC / RBC Plate.
    4. Herhangi r izole etmek içinhacimce PBS solüsyonu: 1,% 0.25 tripsin, 25 mM EDTA: HPMC emaining, 1, 20 ml, 10 dakika boyunca, 200 rpm'de 37 ° C derece kıyılmış doku sallayın. Doku yükselmeye tüpün alt kısmında sıvı toplamak, yeni bir 50 ml tüp içine ve 0.5 gx 3 dakika aşağı dönmesine izin verin.
      1. Süpernatant aspire tam büyüme ortamında 15 ml ayrı 75 cm 2 şişe tüm HPMC / RBC plaka.
    5. Kültür nemlendirilmiş bir ortamda 37 ° C'de ve% 5 CO2 plakalandı hücreleri. Harcanan medya çıkarmadan günlerde 3 ve 5 tam büyüme ortamı 15 ml ekleyerek Yem kaplı hücreler. HPMC bölme önce 5-7 gün süre ile kültüre edilebilir.
      1. Orijinal fenotip dediferansiyonunu ve modifikasyonu en aza indirmek için tüm deneylerde (geçit 2 kadar) düşük geçit HPMC'ye kullanın. Faz kontrast capabilitie plastik diferansiyel girişim kontrast yetenekleri veya 4-20x amacı ile 20x objektif ile tercihen geniş alan mikroskobu kullanıns hücrelerinin tüm görüntüleri çekmek için (mikroskop faz kontrast filtreleri) ve 3,3'-diaminobenzidin (DAB) boyama immunohistokimyasal analiz parlak alanında 10x objektif ().
    6. HPMC cuboidal olduğunu onaylayın ve immunohistokimyasal 8 (Şekil 3A, C, E) gerçekleştirerek sitokeratinin 8 ve vimentinin ifade eder.
  3. NOF izolasyonu 8
    1. 1: 100 x Pen-Strep 1 karışımı bir 1: birleştirerek kollajenaz tip III çözeltisi (10 x) 'in bir stokunun 10 ml hazırlayın kollajenaz tip III 1500 ünite aktivite / ml PBS içinde hyaluronidaz 714 ünite aktivite / ml olmuştur.
    2. % 1 MEM vitamin [93 mg / L] ile serumsuz ortam içinde seyreltilmiş 10 kat kollajenaz tip III çözeltisi, 10 ml (DMEM 6 saat süre ile 200 rpm'de HPMC izolasyon sonra kalan kıyılmış omentum doku 37 ° C sallayın, % 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]). Sindirilmiş doku opak bakacağız ve bazı lifli enkaz (Şekil 2E) olabilir.
    3. Çözelti içeren NOF hücreleri Santrifüj oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 0,5 x g 'de süspansiyon halinde, süpernatan aspire tam büyüme ortamında 13 ml bir 75 cm'lik 2 şişeye pelet plaka.
    4. Eski ortamı çıkarın ve 24 saat sonra taze tam büyüme ortamı 15 ml ile değiştirin. NOF bölme önce 1-3 gün süre ile kültive edilebilir. Hücreler konfluense ulaştığınızda NOF notu çoğalması sona erecek.
    5. Birincil insan fibroblastlar, düz, uzun hücreler olduğunu onaylayın ve vimentinin ifade ama immünohistokimyasal 8 gerçekleştirerek 8 sitokeratin değil (Şekil 3B, D, F). Dediferansiyonunu en aza indirmek için (ideal geçit 3 öncesi) deneyler için düşük geçit NOF kullanın ve orijinal fenotip modifikasyonu. Hücrelerin her aşaması fotoğraf çekmek için plastik DIC yetenekleri ile 20x amacı ile geniş alan mikroskobu kullanınve parlak alanında 10x objektif immunohistokimyasal DAB boyama analiz etmek.

2. Organotipik Kültür 8 Kaplama

  1. En fazla 5 dakika boyunca 3 ml% 0.25 tripsin / EDTA 25 mM, ardından 10 ml PBS ile çalkalayın 75 cm kültür şişesi Yayın NOF. Tam büyüme ortamının en az 3 kez hacmi ile nötralize tripsin.
  2. 50 ml konik tüp içine tripsinize hücreleri aktarın ve 0.5 gx 3 dk aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve tam büyüme ortamı 5 ml kadar geri hücreleri getirmek. Kültür şişesi kurtarıldı hücreleri saymak için bir hücre sayacı kullanın.
  3. Bir 96-yuvalı, berrak tabanlı siyah plaka üzerine 100 ul başına 2000-4000 NOF plaka tam büyüme ortamı, uygun hacimde hücreleri ile seyreltilir. Kaplama önce hücre karışıma sıçan kuyruğu kollajen I 0.5 ug / 100 ul ekleyin. Let Hücrelerin en az 4 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de oturup, ya da hücrelerin kadarplaka yüzeyine yapışır için.
  4. Adımlar 2.1 ve 2.2 açıklanan aynı yöntemleri kullanarak kültür şişesi HPMC bırakın. Tam büyüme ortamının uygun miktarda hücrelerin önceden 96 oyuklu plakalar içinde kollajen I kaplama NOF üstünde 50 ul başına 10,000-20,000 HPMC plaka seyreltin. Hücreler deney başlamadan önce en az 18 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de bekletin.
  5. Tam büyüme ortamı HeyA8 yumurtalık kanser hücreleri -expressing Kültür yeşil flüoresan proteini (GFP). HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, floresan kopepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1) eksprese eden bir lentiviral vektör ekspresyonu ile etiketlenir. HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, kullanım gününde (logaritmik büyüme fazı) üzerine% 80-90 ortak akışlı olmalıdır. Kültür hücreleri plakadan bırakın ve birincil hücreler için adımlar 2,1-2,2 açıklanan aynı yöntemleri kullanarak saymak.
  6. Yumurtalık kanseri hücreleri, 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca tam bir büyüme ortamı içinde kurtarmak için izin verinkapaklı konik tüp gevşek kapatılmış.

3. Yapışma Deneyi 8

  1. İyileştikten sonra 0,5 xg'de 3 dakika boyunca iplik ile yumurtalık kanseri hücrelerini pellet haline getirmek ve daha sonra süpernatant kaldırmak ve 50.000 hücre / 100 ul bir konsantrasyona ulaşmak için serum içermeyen ortam, uygun hacimde hücreleri seyreltin.
  2. Harcanan ortam kaldırmak için HPMC / NOF Organotipik kültürler ile 96 oyuklu plakalar ters çevirin, ve her bir serumsuz ortam içinde kanser hücre süspansiyonu 100 ul ilave edin. 4 saat 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
  3. Ortam ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için 96 oyuklu plaka ters çevirin. Dikkatle ve yavaşça her kuyuya PBS 100 ul pipetlemeyin ve tekrar plaka ters düşük güçte bir çok kanallı pipet kullanın. PBS bir kez daha yıkayın tekrarlayın.
  4. PBS çıkarın ve her bir oyuğa 100 ul% 4 paraformaldehid eklemek için ters çevirin. Plaka 20 mil için bekletinn hücreleri gidermek için. 20 dakika sonra, plaka ters çevirin ve 100 ul PBS ilave edin.
  5. Toplam kuyu flüoresan kaydedilmemiştir veya hücre sayısı belirlenebilir unutmayın. Ölçümü için, 1.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda HeyA8 hücreleri kullanılarak, iki kopya halinde birinci plaka standart eğrisi.
    1. Aşağı 1 milyon hücre iplik medya kaldırarak, ve onları 20 dakika boyunca 1 ml% 4 paraformaldehid oturup izin vererek standart eğri olun.
    2. Spin hücreleri tekrar PBS (anlattıklarında hücreleri 1000000 / ml konsantrasyon onaylamak için) ml 1'de getirmek. Levha 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000, ve de her biri çifte biçimde içine 0 hücreleri, ve her çukur 50 ul'lik bir nihai toplam hacim PBS ilave edin.
  6. Alt yüksek kuyu (standart eğri üzerinde 50.000) ölçekleme, bir flüoresan plaka okuyucusu (uyarım = 488 nm, emisyon = 528 nm) ile kültür plakasına okuyun. Organotyp yapıştırılır kaç yumurtalık kanseri hücrelerini hesaplamak için standart eğri kullanınHer bir oyuğa (Şekil 4A-C) 'ic kültürü.

4. Proliferasyon Deneyi 10

  1. Yumurtalık kanseri hücreleri, geri sonra% 1 FBS (DMEM,% 1 FBS ortamı uygun hacimde hücreleri sulandırmak sonra 0.5 x g'de 3 dakika boyunca iplik hücreleri pelet,% 1 MEM (adım 2.5 ve yukarıda belirtilen 2,6 bakınız) vitaminler [93 mg / L],% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-Strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]) 4.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için / 150 ul.
  2. Her bir oyuğa FBS ortamı harcanan ortamını çıkarın ve 1% kanser hücre süspansiyonu 150 ul eklemek için HPMC / NOF Organotipik kültürler ile 96 oyuklu plaka ters çevirin. 72 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
  3. Alt görece proliferasyonunu değerlendirmek için bir kez bir flüoresan plaka okuyucusu günde (uyarım = 488 nm, emisyon = 528 nm) kültür plaka okumahücre. 48 saat (Şekil 5A-C) 'de ortamının değiştirilmesi, 96 saat boyunca deney devam edin. (Plaka tercih edilir tersini) ortam değiştirirken kültürünü rahatsız etmemek için dikkatli olun.

5. Invasion Testi 8

  1. 3D kültür kaplama önce, 24 oyuklu bir kültür plakasına parçası (8 um gözenek boyutu) 200 ul PBS içinde 7.5 ug fare kuyruk kolajeni eklemek. Plaka inkübe O / N, daha sonra dikkatlice hemen kollajen kaplı ekler (yukarıdaki adım 2) üzerine HPMC / NOF organotipik kültürünü kaplama önce bir pipet ile PBS kaldırmak edelim.
  2. Adım 3.1 olarak yumurtalık kanseri hücrelerini hazırlayın. Ekler üzerinde organotipik kültürlerinin üzerine yumurtalık kanseri hücrelerini plaka dikkatle ekler üst fazla olan ortamı çıkarmak için bir pipet kullanın. Her bir oyuğa, serumsuz ortam içinde yumurtalık kanseri hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
  3. Kanser hücresini ikna etmek için iyi bir ekin altındaki içine tam büyüme ortamı 750 ul ekleyinorganotipik kültürlerinin içine vasion. 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
    Not: Organotipik kültür ekleme çapraz ve ekin alt tarafında kalacaktır istila Yumurtalık kanseri hücrelerini.
  4. Boş kuyuya insert taşıyın, 24 saat sonra, maşa ile ekleme kavramak ve kısaca PBS beher durulayın. 1 dakikalık bir toplam pamuklu çubuk her iki yanına, her bir ek üst fýrçalayýn. Hızlı bir şekilde her bir 750 ul% 4 paraformaldehid içeren bir plaka içine ekleme yerleştirin. Her insert 750 ul PBS ile dolu kuyu içine ekler aktarmadan önce 10 dakika boyunca paraformaldehid oturup bekleyin.
  5. 2.5x büyütme mikroskop ile işgal hücreler (ekler dibine yapıştırılır ve sabit) görüntüleyin. Tüm kuyu görüş alanı içinde olduğu zaman, kaçınarak, 10x büyütme ayarlayın ve 5 resim, kuyunun her kadranda merkezine yakın bir ve 1 almakkenarlarına çok yakın görüntüler alarak. Her iyi için aynı desen izleyin.
  6. Onların protokole göre her bir kuyu (Şekil 6A-C) 'de alan başına işgal hücrelerin ortalama sayısını elde etmek için her görüntüdeki hücre sayısını saymak için üreticinin programı kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Organotipik kültürü ilk olarak kollajen tip I primer insan fibroblastları karıştırılması ve sonra mezotelyal hücrelerin 5 kez sayı ile bu kültürü overlaying tarafından toplandı. Yumurtalık kanseri hücreleri, yapışma, istilası veya proliferasyonunu çalışma ilave edilmeden önce, kültür en az 18 saat süreyle inkübe edildi. Her bir deney, çoklu tekrarlanmıştır (n = 5) ve istila deneyler (n = 3) (n = 3-5), farklı hastalara ve çok sayıda kuyu elde edilen 3D kültürleri yapışma her durumd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Periton mikroçevresinin bir Organotipik modeli yumurtalık kanseri yayılmasına mikroçevresinin hücresel ve doğuştan bileşenlerin hem bireysel ve kolektif işlev (ler) değerlendirmek için kurulmuştur. Yumurtalık kanseri hücre yapışması, proliferasyon ve istila araştırmak için 3D Organotipik kültürü kaplama ve uyarlama için özel protokolleri temin edilmektedir. Primer insan omental mezotel hücreleri ve fibroblastlar hastalardan izole edilen ve normal morfoloji ve hasta varyasyonu korumak için erk...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We thank all residents and attending physicians, notably Dr. A.F. Haney (the University of Chicago, Department of Obstetrics and Gynecology) for collecting omental biopsies. Also, we thank Stacey Tobin and Gail Isenberg for carefully editing this manuscript. This work was supported by Bears Care, the charitable beneficiary of the Chicago Bears Football Club, the National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702, and the National Cancer Institute grant R01 CA111882 to E.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation and culture of primary cells
PBSFisher ScientificSH3001304
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640
15 cm culture dishesBD Biosciences353025
Glass flask??
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM with L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM VitaminsCorning25-020-Cl
MEM Nonessential amino acidsCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Shaker Thermo-FisherMaxQ 4450
CentrifugeEppendorf5702
IncubatorThermo-FisherForma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 FlasksBD Biosciences353136
T-175 FlasksBD Biosciences353112
Pipet tipsRaininP2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tipsCorningFiltered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
2. Plating 3D culture
Cell CounterInvitrogenCountess
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Collagen Type I (Rat Tail)BD Biosciences354236
96 well plate, clear bottom, blackBD Biosciences353219
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipetEppendorfXplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
Plate readerMolecular DevicesMinimax
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well)BD Biosciences353097
Cotton swabsQ-tipscotton swabs
MicroscopeZeissAxiovert 200m
Cell Profilerpublic domain
24 well plateBD Biosciences353047
Name of Reagent/ EquipmentCompanyCatalog NumberComments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058

Referanslar

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 106mikro evresininyumurtal k kanseriyap mai galn kleer silahlar n yay lmas3D k lt rmodellememodel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır