JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Özet

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Giriş

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hem ifade vektörleri EYFP-Parkin ve pDsRed2-Mito ile fibroblast 1. elektroporasyonu

  1. 100 mg / ml DMEM (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı),% 10 fetal bovin serumu, 2 mmol / L L-glutamin, 100 U / ml penisilin ortamı kullanılarak 10 sm doku kültürü plakasında ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik fibroblast hücreleri büyür ve 37 ° C'de,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde kültürlendi.
    1. % 80 hücre Akışların birleştiği yerde hücreler, HPO 4, KH 2.4 g, steril emilerek tam bir DMEM ortamıyla atmak ve steril 1 x fosfat tampon çözeltisi (10 ml PBS) (NaCl 80 g, KCl 2.0 g, Na 2, 14.4 g ekleme 7.4): 2 PO 4 ve 1 L H2O PH damıtıldı.
    2. Steril emme PBS atın ve Tripsin-EDTA% 0.25 1 ml ekleyin. (- 3 dk 2) Hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe plakası. _, Tam DMEM orta 4 ml ekleyin hücreleri tekrar süspansiyon ve 10 çıkar6; hemositometre sayımı hücre süspansiyonu l.
      Not: 16 Köşe kareler bir takım hücre sayısı hücrelerin x 10 4 / mi sayısına eşit olacak şekilde hemositometre tasarlanmıştır.
  2. Elektroporasyon işlemine 24 saat önce 10 cm doku kültürü yemekleri üzerine Tohum 1 x 10 6 hücre.
  3. Steril emilerek tam bir DMEM ortamıyla atın ve steril 10 ml PBS ilave edin. Steril emme PBS atın ve Tripsin-EDTA% 0.25 1 ml ekleyin. (- 3 dk 2) Hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe plakası. tam bir DMEM ortamıyla 4 ml ilave edilir ve 15 ml'lik bir tüp içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  4. bir buzdolabında-santrifüj (4 ° C) ile 5 dakika boyunca 250 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. Steril emme Süpernatantı atın ve steril PBS 1 ml pelletini. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün.
  5. Steril emerek supernatant atmak ve 100 ul o ekleyinelektroporasyon f çözüm karışımı hücre pelet (82 Company solüsyon 1 elektroporasyon Çözüm V + 18 ul ul) ve hafifçe pipetleme pelletini (Daha fazla bilgi için kullanım kılavuzuna başvurun). hücre süspansiyonu de EYFP-Parkin (uyarma / emisyon 514/527) ve 1 mcg pDsRed2-Mito (uyarma / emisyon 565/620) 2 ug ekleyin.
  6. tek kullanımlık pastör kullanarak steril küvete solüsyonu (her iki araç kiti ile birlikte sağlanır) aktarın ve önceden ayarlanmış bir program NIH / 3T3 U-030 (Tek nabız, gerilim 200 V, kapasitans 960 mF, darbe süresi 20 milisaniye kullanarak electroporate , darbe sayısı: 1).
  7. 37 ° C'de,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde bunları hemen Elektroporasyon işleminden sonra, taze, önceden ısıtılmış tam bir DMEM ortamıyla 500 ul ve 6 cm doku kültürü plakası, canlı görüntü dereceli hücreyi tohum ve inkübe 24 saat.

2. Time-Lapse video Mikroskopi

  1. Kullanmadan önce 37 ° C'de mikroskop odasının sıcaklığı ayarlayın.
  2. Bu noktada deney protokolü ile devam etmek için, belirli bir canlı görüntüleme ortamı hazırlar. aşağıdaki gibi canlı görüntüleme ortamı hazırlayın; karıştırın DMEM fenol içermeyen,% 10 fetal bovin serumu, 2 mmol / L L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile takviye edilmiştir. Bir su banyosu içinde 37 ° C 'de, canlı görüntü ortamı önceden ısıtın.
  3. Steril emilerek elektroporasyona hücre ortamı atılır ve P1000 pipet kullanarak, önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamının 1 ml ilave edilir ve 37 ° C'de 30 dakika süreyle plaka inkübe edin.
  4. 37 ° C'lik bir sabit sıcaklıkta önce mikroskop odasındaki Plaka, inkübasyon süresi, akış,% 5 CO2 içinde.
  5. büyük hareketler ya da salınımları kaçınarak mikroskobun odasına Electroporated hücreleri ile plaka koyun.
  6. Yazılım arayüzü kullanarak, her iki fluore tespit etmek için mikroskop ayarlamakko-transfekte vektörler tarafından kodlanan füzyon proteinleri scence sinyalleri EYFP-Parkin ve (Uyarım aralığı 495 nm ve emisyon aralığı yeşil 520-550 nm, 510) pDsRed2-Mito (Uyarım maksimum 558 nm ve emisyon maksimum 583 nm, kırmızı).
    1. time-lapse video mikroskopi yazılımını açın. Üst menüde pDsRed2-Mito için EYFP-Parkin ve rodamin için FITC seçin. Üst menüde büyütme (20X) seçin.
  7. yazılım arayüzü kullanarak, hem birlikte transfekte vektörleri ifade tek bir hücre için bakmak ve konumunu kaydeder. 10 hücrelerinin en az her deneysel koşul (Deney grubu) için toplanana kadar bu adımı tekrarlayın.
    1. menu "Uygulamalar" ı seçin ve Çok Boyutlu Edinme tıklayın. Çok Boyutlu Toplama pencerelerinde bu tür satın almalar sayısı, her satın alma ve kaydedilen hücrenin konumu arasındaki zaman aralığı olarak gerekli parametreleri seçin. Edinme "üzerine tıklayın"Satın alma işlemini başlatmak için.
  8. EYFP-Parkin ve 15 dakika olmak üzere toplam aralığı için görüntüleri her 5 dakikada toplama DsRed2-Mito floresan sinyal hem bazal alımı başlatabilirsiniz.
  9. son çalışma konsantrasyonu iki katından daha yüksek bir FCCP bir konsantrasyon ile önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamı hazırlayın (0,1-10 uM, hücre tipine bağlı olarak).
  10. satın alma işlemini kesintiye ve P1000 pipet kullanarak mikroskobun odasının içine plakasına FCCP önceden ısıtılmış canlı görüntüleme ortamı yavaşça 1 ml ekleyin.
  11. daha önce kaydedilmiş konumu kullanarak, 3 saatlik bir toplam süre için, tarif edildiği gibi elde etme işlemi başlatın. bunları analiz ve satın alma bittiğinde mitophagic sürecinin bir video oluşturmak için tüm kazanılmış görüntüleri kaydedin.

3. Analiz

  1. Bir kişisel bilgisayarda ".tiff" biçiminde tüm kazanılmış görüntüleri toplayın
  2. Bir grafik yumuşak görüntüleri açıngereçleri ve zamansal aralık define (Görüntüler her 5 dakika edinilen) mitokondrial membran içine Parkin istihdamı gösteren ilk görüntüye FCCP mitokondriyal kaynaklı-depolarizasyon dan oluştu. Deney grubunda, her bir hücre için, bu analiz tekrarı.
  3. Deney grubu adıyla bir tablo üzerinde sütunun ilk hücresini Etiket. her bir deney grubu için, 10 hücreleri en az Parkin alımı için zamansal aralıkları ölçmek. Parkin işe alım için hesaplanan geçici aralıklarla ortalama yapın ve her bir deney grubu için standart sapmayı tanımlamak (Ortalama ± SD, n = 10).
    1. sütun tek hesaplanan geçici aralıklarla içine düzenleyin. Her sütun n = deney grubunun 10 ölçümlerini içerir.
    2. Formula Builder menüden fonksiyon "ortalama" seçeneğini seçin. sütunundaki verileri seçin. Formula Builder menüden fonksiyon "Standart Sapma" seçeneğini seçin. Selesütundaki veriler, CT.
  4. istatistiksel bir yaklaşım kullanarak, deney grupları arasında mitophagy dinamiği önemli bir fark tanımlamak için uygun istatistik uygulayarak deney grupları karşılaştırmak. (Örneğin, iki grup = Student t-testi, üç veya daha fazla gruplar = ANOVA artı bir post-hoc testi)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu yazıda, time-lapse video mikroskopi tek bir hücrede floresan etiketli proteinlerin moleküler olayları takip etmek için kullanılabilecek güçlü bir tekniktir nasıl gösterir. temsilcisi sonuçları da bu tekniğin yüksek kaliteli görüntüler elde edilmesi için izin verir nasıl gösterir. Moleküler sürecinin görüntüleri elde edilir, biz farklı şekillerde bunları analiz için fırsat var. Burada, biz seçici hasarlı mitokondri kaldırarak hücresel homeostazı koru...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Time-lapse mikroskopi uzun süre boyunca hücresel dinamiklerinin gözlem zamanında tek bir gözlem canlı hücre görüntüleme uzanan tekniği olarak tanımlanabilir. bu gözlemci gerçek zamanlı olarak tek bir floresan etiketli protein tespit ve tek bir canlı hücrenin içinde kendi dinamiğini takip sağlar, çünkü bu yöntem, basit bir konfokal veya canlı hücre mikroskopi ayrılır. Aslında, konfokal mikroskopi kolayca flüoresan antikor kullanılarak imüno-etiketli proteinlerin tanımlar, ancak, hücre ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

Referanslar

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 111Time lapse video MikroskopiMitophagyFCCPParkinFibroblastMitokondri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır