Doku Mühendisliği Aljinat mikropartiküllerin ile Thermogelling Poli (N-izopropil) -graft-kondroitin Sülfat Kompozitlerin Sentezi

Özet

poli (N-izopropil akrilamid) -graft-kondroitin sülfat oluşan enjekte edilebilir doku mühendisliği iskelesi (PNIPAAm-g-CS) içeren aljinat mikro hazırlandı. Özellikleri ve in vitro biyouyumluluk şişme yapışma mukavemeti, bu çalışmada incelenmiştir. Burada geliştirilen karakterizasyon teknikleri diğer thermogelling sistemleri için geçerli olabilir.

Özet

Enjekte edilebilir Biyo materyaller, bir sıvı olarak vücut içine ve yerinde katılaşmaya edilebilir implante edilebilir maddeler olarak tanımlanır. Bu gibi malzemeler, minimal invaziv ve kolay bir şekilde düzensiz şekilli kusurlar boşluk doldurucu katı oluşturan implante edilen klinik avantaj sağlar. Enjekte biyomalzemeler yaygın doku mühendisliği için iskeleler olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, vücudun bazı yük taşıyan alanların onarımı için, örneğin vertebral disk gibi iskeleleri yapışkan özelliklere sahip olmalıdır. Bu kuvvetler, yeterli aktarımı sağlayan hareketi esnasında çıkış riskini en aza indirmek ve çevreleyen doku ile yakın temas sağlayacaktır. Burada, termal olarak hassas bir poli (N-izopropil akrilamid) oluşan bir iskele hazırlanmasını ve tanımlanmasını -graft-kondroitin sülfat (PNIPAAM-g-CS) ve aljinat mikro açıklar. PNIPAAm-g-CS kopolimeri aljinat içine oda sıcaklığında su içinde viskoz bir çözelti oluşturure parçacıkları yapışma geliştirmek için askıya alınır. 30 ° C civarında daha düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin), üzerinde, kopolimer mikro etrafında katı bir jel oluşturur. Biz dikkate PNIPAAm-g-CS geri dönüşümlü faz geçişi almaya standart biyomateryaller karakterizasyon prosedürleri adapte var. Sonuçlar% 5 olarak 50 ya da 75 mg / ml aljinat parçacıklarının ilave edilmesi, (a / h) PNIPAAm-g-CS çözeltiler, tek başına PNIPAAm-GCS çekme dayanımı (p <0.05) dört katına göstermektedir. alginat mikro parçacıkların dahil edilmesi de önemli ölçüde doku defektlerinin içinde boşluk doldurucu jel korumak için yardımcı PNIPAAm-g-CS şişme kapasitesi (p <0.05) arttırır. Son olarak, 2,3-bis-in vitro Toksikoloji deney kiti sonuçları (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil) -2H-tetrazolyum-5-karboksanilid (XTT) ve canlı / ölü canlılığı deneyi göstermektedir yapışkan hayatta kalma ve kapsüllü İnsan Embriyonik Böbrek çoğalmasını destekleme yeteneğine sahip (HEK) 293 c5 gün boyunca arşın.

Giriş

Enjekte edilebilir Biyo materyaller uygun bir sıvı olarak vücuda verilen ve yerinde katılaşmaya edilebilir olanlardır. Bu tür malzemeler onlar hücreler ⁵ için üç boyutlu geçici ekstraselüler matriks olarak etkilenen sitede ^1-4 ve hareket için kapsüllü hücreleri sunmak için kullanılan rejeneratif tıp, yaygın uygulanmıştır. implantasyon için cerrahi işlemler, minimal invaziv ve katı faz düzensiz özel boyutlu implantlar için ihtiyacı ortadan kaldırarak, doku defektleri şeklinde dolgu çünkü hasta için, enjektabl biyomateryaller avantajlıdır.

Enjekte edilebilirlik çeşitli mekanizmalar aracılığıyla sağlanabilir. Dış faktörler, pH gibi hücreler ve biyolojik olarak aktif moleküllerin ^6-8 kapsülleyen jeller oluşturmak için bir tetikleyici olarak incelenmiştir. Ancak, pH tüm fizyolojik ortamlarda kullanmak için en uygun tetikleyici olmayabilir. Başka geleneksel alternaenjekte edilebilirliği ulaşmak için tive yerinde kimyasal polimerizasyonu veya çapraz bağlantı kullanmaktadır. Bir grup, amonyum persülfat ve N, N, N ', N' tetrametiletilendiamin oluşan suda çözünür bir redoks sistemi geliştirilmiştir ve polietilen glikol ve poli ^{(propilen), 9,10} glikol oluşan makromerleri reaksiyona sokmak için kullanılır. Zan ve ark., ^11, gelişmiş enjekte çitosan polivinilalkol ağları glutaraldehit ile çapraz bağlanmış. Bu gibi sistemlerde, reaktif bileşenlerin sitotoksisitesi, özellikle hücre kapsülleme ile ilgili uygulamalar için, göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca, ekzotermik polimerizasyon polimerik kemik ^12,13 çimentolar için rapor edilmiştir çevreleyen doku, uzlaşmaya yeterince yüksek sıcaklıklara üretmek olabilir.

Yine başka enjekte edilebilir polimer sistemleri tetikleyici sıcaklık ile sıvıdan katı hale gelen bir değişiklik sergilediği geliştirilmiştir. thermogelling sistemleri olarak bilinen bu aqueo vardırUS in situ oluşumu ¹⁴ elde etmek için kimyasal uyarıcı monomerler, veya çapraz bağlayıcı maddeler gerektirmeyen polimer solüsyonları. Bunun yerine, genellikle fizyolojik sıcaklığa yakın oluşan bir faz geçişi, bir fiziksel çapraz bağları olan üç boyutlu bir ağın oluşumuna neden olur. Pluronic F127 olarak poloksamerler ilaç dağıtım ^15-17 ve hücre kapsülleme ^18,19 thermogelling için en çok çalışılan polimerler arasında yer almaktadır. Bununla birlikte, iyi Bu jeller, fizyolojik koşullar altında kararlılık eksikliği olduğu kabul edilmektedir. Çalışmalar zincir uzatıcı ²⁰ veya kimyasal çapraz bağlayıcı ^21,22 kullanarak artan istikrar göstermiştir. Bununla birlikte, bu reaktiflerin kullanımı, hücre kapsüllenmesi için malzeme potansiyelini sınırlamaktadır.

Poli (N-izopropil akrilamid) doku mühendisliği ve ilaç teslimat ¹⁴ önemli ilgi görmüştür sentetik thermogelling polimerdir. poli sulu çözeltiler (N-izopropilylacrylamide) (PNIPAAm), bir düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin) gösteren, tipik olarak yaklaşık 32 meydana gelen - 34 ° C ^23,24. LCST'nin altında, su PNIPAAm zincirleri nemlendirir. Geçiş sıcaklığının üstünde, polimer zehirli monomer veya çapraz bağlayıcı kullanılmadan dramatik faz ayrılması ^25-27 ve bir katı jel oluşumu ile sonuçlanarak, hidrofobik hale gelir. Ancak, PNIPAAm homopolimerler zayıf elastik özellikler sergiler nedeniyle hidrofobiklik ²⁸ fizyolojik sıcaklıkta az su tutun. Bu çalışmada, enzimatik degradasyon ²⁹ anti-enflamatuar aktivite ^30,31, ve artan su ve besin emilimi ³² potansiyel sunmaktadır PNIPAAm ağı içine kovalent kondroitin sülfat dahil seçin. CS PNIPAAm kopolimerleri aşılanmış kopolimere (PNIPAAm-g-CS) oluşturulması için metakrilat-işlevselleştirilmiş CS mevcudiyetinde monomer NIPAAm polimerleştirilmesiyle laboratuvarımızda hazırlandı. beckopolimerin, düşük çapraz bağlanma yoğunluğu ause, PNIPAAm-g-CS bağlı LCST'nin ^29, oda sıcaklığında su içinde yapışkan bir çözelti ve fizyolojik sıcaklıkta elastik bir jel oluşturur. polimer çözeltileri nedeniyle geçiş geri dönüşümlü tekrar LCST'nin altında soğutma ile akışkan hale gelir.

Bu PNIPAAm-g-CS, mekanik uygun olabilir özellikleri, parçalanabilirliği, insan embriyonik böbrek (HEK) hücre proliferasyonu ile 293 hücreleri ^29, bir doku mühendisliği iskelesi olarak işlev potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Ancak, bu tür intervertebral disk gibi belirli yük taşıyan alanlarda, doku mühendisliği iskeleleri çıkığı ³³ riskini ortadan kaldırmak için çevredeki disk dokusu ile önemli bir arayüz oluşturmak için yeteneğine sahip olmalıdır. Bu arayüz, implant ve doku ³³ arasındaki ara yüzey boyunca kuvvet yeterli aktarımı için de gereklidir. Çalışmalarımızın, biz askıya almış birlginate PNIPAAm-g-CS sulu çözeltiler içinde mikropartikülleri ve jelasyon doku ³⁴ çevreleyen yapışma sağlamak mikropartiküller, lokalize olduğu bulunmuştur. Bu yazıda thermogelling, yapışkan polimer hazırlanması için adımları özetlemektedir. canlılığı için standart biyomateryaller karakterizasyonu, hücre görüntüleme teknikleri ve tahliller dikkate polimerin sıcaklık duyarlılığı ve faz geçiş reversibilite almaya adapte edilmiştir. Bu yazıda anlatılan enjektabl polimer Bu yazıda tarif edilenler dışında ilaç dağıtım ve doku mühendisliği uygulamaları için geniş bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, burada açıklanan karakterizasyon yöntemleri diğer thermogelling sistemlere uygulanabilir.

Protokol

1. Poli (N-izopropil) -g-kondroitin Sülfat Sentezi

1. biyo-yapışkan hidrojel sentezi önce, N-izopropil (NIPAAm) monomeri ve metakrilat kondroitin sülfat (CS) temizler.
   1. NIPAAm en az 10 g tartılır ve 60 ° C de, n-heksan, 400 ml monomer çözülür. Tam çözünme gerçekleşene kadar periyodik olarak kap karıştırılır. 24 saat için -20 ° C derin dondurucuda çözümü yeniden kristalize.
   2. kap ve vakum filtreden bir Buchner hunisi kullanılarak n-heksan kristalize monomer çıkarın. Kalan n-heksan kaldırmak için 24 saat boyunca oda sıcaklığında bir vakumlu fırın içinde monomer yerleştirin. daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de derin dondurucuda monomer saklayın (adım 1.2).
   3. tartılır ve iyonu giderilmiş su, 8.0 ml kondroitin sülfat 2.0 g çözülür. Yavaşça 60 ° C'ye kadar çözelti ısıtılır.
   4. (A / a)% 50, yaklaşık 10 ila 40 ul ile 10 çözeltinin pH'ının ayarlanması NaOH.
   5. metakrilik anhidrit (MA) 0.298 ml ekleyin. 24 saat boyunca geri akış, 60 ° C de karıştırılarak.
   6. Bir -20 ° C dondurucu içinde bir kavanoz ve soğuk O / N olarak aseton çözeltisi 400 ml dökün.
   7. 24 saat geçtikten sonra, bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırılırken, yavaş yavaş soğuk aseton, 400 ml içine tüm Metakrilatlanmış CS (MCS) dökün.
   8. asetondan mcs çıkarın ve bir vakumlu fırın içinde bir çökelti yerleştirin. mcs için sağlam ve tutarlı durumunu korumak için hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin. Kalıntı aseton en az 24 saat süre ile, vakum altında buharlaşmasına izin verin.
2. saflaştınldı NIPAAm 10 g deiyonize su, 232 ml MCs 2.209 g eş çözülür.
3. inert gaz ile, oksijen çözeltisi temizleyin. 15 dakika boyunca köpüren gelen çözüm önlemek için güçlü bir, henüz düşük gaz akış hızını korumak.
4. Azot gazı ile çözüm tasfiye devam edin ve tetramethylet 0.976 ml ekleyinhylenediamine (TEMED).
5. Sonraki, amonyum persülfat (APS) ve 97.6 mg karıştırılarak polimerizasyon reaksiyonunu başlatmak.
6. yaklaşık 20 sn için çözüm karıştırın ve hızlı bir şekilde kaba giren herhangi bir hava girişini önlemek için bir çözüm mühür. Çözelti 24 saat süre ile floresan ışığı altında polimerize olmaya bırakın.
7. 24 saat sonra, 37 ° C'lik bir fırına reaksiyon bölmesi yerleştirin. hidrojel jel benzeri bir durum, bir sıvı geçiş izin verin. hidrojel üzerinden, reaksiyona girmemiş monomer dağılımı için izin vermek için 7 günlük bir toplam 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde polimerleştirilmiş hidrojel daldırın.
8. makas kullanılarak, çapı 5 cm den daha büyük çok küçük parçalar halinde hidrojel kesti. bir sıvı, bir jel benzeri durum geçiş gelen hidrojel önlemek için, 37 ° C PBS çözeltisi içinde bir polimer zar. 50 ml konik tüp içine bölümlerini aktarın.
9. tepelerini sararak liyofilizasyon örnekleri hazırlamakKimwipes ve kauçuk bantlar ile tüpleri. 1 ila 2 saat boyunca -70 ° C'de tüpler dondurun.
10. hidrojelden su kaldırmak için dondurarak kurutma ile ilgili konik tüpler yerleştirin. kullanmadan önce, dondurularak kurutma, sırasıyla, yaklaşık olarak bir sıcaklık ve basınçta -40 ° C ile 0.04 mbar ° ulaşması gerekir. 7 gün en az tam bir kurutma için gereklidir.
11. Daha sonra (adım 3.1) için 4 ° C buzdolabı içinde bir ince toz ve mağaza polimeri dondurularak kurutulmuş öğütün.

2. Kalsiyum-alginat Çapraz Mikropartikül sentezi

1. Bir% 2 hazırlama (a / h), iyonu giderilmiş su, 20 ml, 400 mg çözülmesiyle aljinat çözeltisi. Erimeyi kolaylaştırmak için, yaklaşık 60 ° C'ye kadar çözelti ısıtılır.
2. iyonu giderilmiş su ile 20 ml olacak şekilde, 400 mg ekleyerek (ağırlık / hacim), kalsiyum klorür çözeltisi, 2% hazırlayın.
3. kanola yağı, 100 ml, Tween 20 1.0 ml, ve 20 ml birleştirerek su karışımı içinde bir yağ oluşturmak% 2 (ağırlık / hacim) alginat. 15,000 rpm'de bir homojenizör ile 10 dakika süre ile bir karışım emülsifiye. Buna ek olarak, sırasıyla büyük ya da küçük mikro oluşturmak için 200 rpm'de ve 2,000 rpm'de bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın.
4. % 2 aspire 18 G iğne ucu ile bir şırınga kullanılarak, kalsiyum klorür çözeltisi (ağ / hac). Yavaşça damla damla emülsiyon haline kalsiyum klorür ekleyin.
5. kalsiyum klorür 20 mi tükendikten sonra, emülsiyon içindeki mikro 10 dakika boyunca çapraz sağlar.
6. Eşit kanola yağı ilk tabakayı kaldırmak için 2 dakika süreyle 1.400 xg bir kuvvet şapkalı 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine mikropartiküllerin toplu dağıtmak.
7. Ardışık yıkama, girdap ve santrifüj izopropanol ile mikro parçacıkları 2 dakika süreyle 1.400 g üç kez olmak üzere toplam herhangi bir kalıntı kanola yağı çıkarmak için. her bir santrifüj aşamasında sonra izopropanol Süpernatant atılır ve taze izopropanol ile yıkanır.
8. oi kezl kaldırıldı kalıntı izopropanol uzaklaştırmak için deiyonize su ile yıkama prosedürü üç defa daha tekrarlanır. her bir santrifüj aşamasında sonra deiyonize su Süpernatant atın ve yeni, iyonu giderilmiş su ile yıkayın. Bir şişe içinde, ıslak mikro ve mağaza yaklaşık 100 mg çıkarın. Islak mikropartiküller, ışık mikroskobu ile toplu ortalama çapını ölçmek için kullanılır.
   1. ışık mikroskopisi kullanılarak, bir mikroskop lamı üzerinde de-iyonize su içinde, ıslak mikro küçük numuneyi dağıtmak. mikro parçacıkların boyutuna bağlı olarak, bir 10X ya da 20x objektif kullanarak, ve partiküller odak noktası haline gelene kadar sayısal açıklık ayarlayın. Mikroskop doğru amaç için kalibre olduğundan emin olun ve gerektiğinde ışık kaynağının parlaklığını ayarlayın. 50 rastgele aljinat mikro parçacıklar uzun çapını ölçün ve parti için ortalama bir boyutu elde etmek için bir satırı aracını kullanın.
9. Liyofilizasyon b mikro hazırlanmasıy Kimwipes ile sarılarak ve lastik bantlar ile güvence. 1 saat boyunca -70 ° C'de mikro dondurun.
10. liyofilizatör üzerinde mikro parçacıkları yerleştirin ve örnek en az 24 saat süreyle kurumaya bırakın. daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C buzdolabında dondurularak bir havan ve havan tokmağı ve mağaza kullanılarak ince bir toz halinde kuru mikro taşlama (adım 3.3).

Yapıştırıcılar 3. hazırlanması

1. Dondurularak kurutulmuş bir polimer tozu kullanılarak, 1 x 1 ml PBS içinde hidrojel tozu 50 mg çözülmesiyle PNIPAAm-g-cs çözeltisi (ağırlık / hacim)% 5 oluşturur.
2. 24 saat süre ile 4 ° C'de bir buzdolabı içinde bir girdap ve soğuk kullanılarak çözelti karıştırın.
3. Yapışkan çözelti oluştuktan sonra, hidrojel çözeltisi ve vorteks dondurularak kurutuldu alginat mikro 25 ya da 50 mg eklenerek homojen bir bileşik oluşturmak. daha sonra kullanmak için (adım 4.3 ve 4.8), 4 ° C'de bir buzdolabı içinde bileşik saklayın.

4. Biyo-yapışkan Makineanical Çekme Testleri

1. Önceki çekme testlerini gerçekleştirmek için, bir domuz kulak kıkırdak alt tabakayı çıkarmak.
   1. Sıcak% 0.9 bir domuz kulak Defrost NaCI çözeltisi (ağ / hac); Bu doku gevşetmek için yardımcı olacaktır.
   2. Bir neşter kullanılarak, epidermal tabaka, deri altı dokusu, kıkırdak ve olsa dikey keserek düz bir dikdörtgen alan kapalı izole ve bölüm. domuz kulak kavisli sırtlar kesme kaçının.
   3. deri altı dokusu ile paralel keserek kıkırdaktan cildin epidermal tabakasını ayırın. kıkırdak domuz derinin altında bulunan sert, beyaz bir dokudur.
   4. Dikkatle neşter tarafı ile kıkırdak bağlı olduğu deri altı doku kazıyın. neşter bıçağı ile kıkırdak doku içine kesme kaçının.
   5. kıkırdak sadece bir tarafı açık ve çekme testi sırasında düz olduğundan emin olun emin. Gerekirse, alt düzensiz cilt keserek kıkırdak düzleştirmek.
   6. 1 cm x 1 cm boyutlarında birçok parçalar halinde kıkırdak doku kesilir. C derin ° -20% 0.9 (ağırlık / hacim) NaCl solüsyonu ile doldurulmuş, konik tüplere kıkırdak doku saklayın.
2. % 0.9 (ağırlık / hacim) NaCl solüsyonu 2.0 L hazırlayın. 37 ° C'ye kadar tuzlu su çözeltisi önceden ısıtın. Bu çözeltinin sıcaklığı test boyunca muhafaza edilmesi gerekir.
3. Donmuş kıkırdağı çözülmesini sağlayın. domuz kıkırdak ve buz paketleri ile bir strafor kapta hidrojel örnekleri hem tutun.
4. Test standının koluna kuvvet ölçer takın. kuvvet standın üstünde bir ocak gözünü yerleştirin ve 50 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlanır.
5. siyanoakrilat yapıştırıcı ile, paslanmaz çelik blok ve bir çift cımbız kıkırdak bir 1 cm x 1 cm parça yapıştırın. Kemik silindir kıkırdak ek bir parça Tutkal ve kuvveti ölçer silindiri takın. Her iki kıkırdak yüzeylerin birbirine bakan ve hidrojel temas çok önemlidir.
6. yerSıcak plaka üstüne pleksiglas su banyosu ve banyosu içinde kıkırdak yüzey ile paslanmaz çelik blok yerleştirin.
7. Test standı kolunu indirin ve birbirleriyle hem kıkırdak yüzeyler hizalayın. kol kaldırın ve hidrojel uygulamak için yeterli yer bırakın.
8. Bir pozitif yer değiştirme pipeti ile, kıkırdak alt parçasına biyo-yapışkan hidrojelin 200 ul dağıtmak.
9. 1 mm kuvvet standının kol düşürün / dak hidrojel temas kıkırdak üst parçası ve kadar 0.001 N bir önyükleme kuvvet uygular
10. ses belirlenen su seviyesine ulaşıncaya kadar banyoya 37 ° C tuzlu su çözeltisi dökün. bir termokupl ile çözeltinin sıcaklığını kontrol edin.
11. hidrojel 5 dakika olmak üzere toplam ayarlamak için izin ver. Jel katılaşmış sonra 2 mm / dakikalık bir hızda kolunu yükseltmek. bioadhesive kıkırdak alt tabakadan ayırır kez ya da yürürlükte olan önemli bir düşüş meydana geldiğinde testi tamamlandığında,başarısızlık sinyalizasyon.
12. Kaydedilen veri toplamak ve test standı kolunu kaldırın. Kuvvet göstergesinden Kemik silindirini çıkarın. önceki kaba tuzlu su çözeltisi dökün ve 37 ° C'ye ısıtın.
13. aynı oranda ortaya kıkırdak ya da yapıştırıcı ile bir "boş" Kemik eklenme kaldırma kuvveti polimerin tarafından uygulanan kuvvet çıkarılarak ve bağ alanına bölünmesi ile gerilmeleri hesaplayın.

Aljinat Mikropartiküller ile PNIPAAm-g-CS 5. şişmesi Çalışması

1. temiz bir cam şişeleri hazırlayın ve bir zaman noktasında, örnek tipi ve örnek numarası ile uygun bir şekilde etiketleyin. Daha önce tarif edildiği gibi yapıştırıcılar da oluşturulabilir. zaman noktası başına, her numune tipi için beş numune (n = 5) 'in bir toplam hazırlayın.
2. tüm cam şişeleri ön tartmak ve oda sıcaklığında onların ilk kitle kaydedilir.
3. Bir şırınga kullanılarak, beş şişelere her birine hazırlanan yapıştırıcı numune yaklaşık 0.4 ml dağıtın.test edilen tüm zaman noktalarında genelinde her bir numune türü için bu adımı yineleyin.
4. Tartılır ve oda sıcaklığında yapışkan örnek türü ile her flakon kütlesini kaydedin.
5. orbital kuluçka 37 ° C'de 1x PBS çözeltisi 1 L önceden ısıtın.
6. Bir rafa şişeleri tüm Organize ve kuvöz içine raf yerleştirin. yapıştırıcılar, yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca, bir jel bir sıvıdan geçiş izin verin.
7. her şişeye 1x PBS içinde 5.0 ml ilave edilir. dikkatle parçaladıktan gelen hidrojel diski önlemek için şişenin kenarı boyunca PBS çözümü eklemek için emin olun.
8. PBS çözeltisi buharlaşmasını önlemek ve 37 ° C de kuluçka iç sıcaklığı, her bir flakon kapağı. hidrojel diskleri Her set bir zaman tayin uzunluğu için PBS içinde batık kalması gerekir.
9. 7 günlük bir zaman noktası ulaşıldığında, küçük şişeler kümesini kapağını açmak ve her bir şişeden PBS çözeltisi çıkarın. RT'de tekrar yapıştırma örneği ile, her şişe tartılır.

6. Canlı / Ölü Test kullanma Nitel Hücre Canlılık

1. PNIPAAm-g-CS ile canlı / ölü tahlil yapmadan önce, insan embriyonik böbrek% 80 izdiham 293 hücreleri (HEK-293) büyür.
   1. Daha sonra 15 ml konik bir tüp içinde 5 dakika 4 ° C'de 400 x g'de santrifüj hücreleri, 37 ° C su banyosu içinde cryovial yerleştirerek Dondurulmuş HEK-293 hücre süspansiyonu hızlı-eritin.
   2. ilk geçiş hücre büyüme ortamı yapmak için, (4.5 g / L), Dulbecco Modifiye% 20 bir son konsantrasyona ve 100x penisilin-streptomisin solüsyonu ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile Eagle Ortamı (DMEM) (yüksek glikoz kombine pen-strep, 100 IU / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin bir nihai konsantrasyona kadar). Diğer tüm yollar için% 10 FBS ve 1 x Pen-strep ile DMEM geçin.
   3. büyüme ortamına, 10 ml hücre pelletini, bir 100 mm çaplı petri süspansiyon aktarın. eşit darkaya doğru hafifçe çanak ön eğerek hücreleri istribute ve birkaç kez her yönü soldan sağa.
   4. Kültür,% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş bir inkübatör hücreleri. Gerekirse, her iki günde bir orta değiştirmek.
   5. Hücreler% 80 confluency ulaştığında, birden yemeklerin kültürü çoğaltmak. plakadan orta çıkarın.
   6. plaka% 0.5 tripsin 1 ml ilave edilir. Plakalar, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe izin verin. Hücreler nazikçe plaka dönen yüzeyden ayırmak olmadığını kontrol edin.
   7. kültür 01:10, bölme için tripsinize hücreleri normal bir büyüme ortamı (DMEM% 10 FBS) 9 ml ekleyin ve hafifçe çanak eğerek karıştırın.
   8. Her yeni bir çanak seyreltilmiş hücre süspansiyonu 1 ml koyun ve büyüme ortamı 9 ilave edin. Yavaşça çanak eğerek karıştırın.
   9. Kültür,% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de nemlendirilmiş bir inkübatör hücreleri. Gerekirse, şimdiye kadar orta değiştirmeky hücreleri kadar iki gün% 80 izdiham ulaşmak.
2. % 80 izdiham büyüdü iki kültür kaplarına bulunan ortamı çıkarın.
3. Her plaka için% 0.5 tripsin 1 ml ilave edilir. Plakalar, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe izin verin. Hücreler nazikçe plaka dönen yüzeyden ayırmak olmadığını kontrol edin.
4. iki kez büyüme ortamının 3 ml plaka HEK-293 hücreleri yıkanır ve aynı 15 ml konik tüp, her iki süspansiyon ekleyin.
5. 4 ° C'de 400 x g'de 10 dakika boyunca 15 ml konik tüp santrifüjleyin.
6. Süpernatantı ve yukarı ve aşağı pipetleme orta 3 ml hücre pelletini.
7. Pipet hemasitometre hücre süspansiyonu, 10 ul ve hücre yoğunluğu belirlemek için bir hücre sayımı gerçekleştirin. konsantrasyonu çok düşükse, bir hedef concent korumak için, ses seviyesini azaltmak tersine ilk hücre konsantrasyonu çok yüksek ise orta süspansiyon hacmini artırmak ve1 x 10 ⁶ hücre / ml oranı. Santrifüj HEK-293 400 xg'de hücreleri ve buna bağlı olarak medya düzeltilmiş hacim hücre pelletini.
8. Yavaşça hücre süspansiyonu vorteks ve eşit, aşağıdaki test koşulları için dört ayrı 15 ml konik tüp içine, hücre karışımı dağıtmak: PNIPAAm-g-CS pozitif kontrol tek tabaka, negatif öldürüldü kontrolü (h / h) metanol% 70 kullanılarak, HEK-293 alginat mikro sahip PNIPAAm-g-CS kapsüllenmiş PNIPAAm-g-CS kapsüllenmiş hücreler ve HEK-293 hücreleri.
9. 4-6 kopya numuneler üretmek için 24 plaka içine hücre karışımı birden çok 300 ul hacimli pipetleme pozitif kontrol tek tabakaları oluşturmak.
10. aljinat mikropartiküller ile öldürülen kontrol PNIPAAm-g-CS ve PNIPAAm-g-CS ile ilgili konik tüpler bulunan ortamı çıkarın.
    1. 400 x g'de 5 dakika boyunca konik tüpler santrifüj ve supernatant çıkarın.
    2. c resuspending aynı hücre konsantrasyonunu korumakçıkarıldı ortam olarak PNIPAAm-g-CS aynı hacimde arşın. yukarı ve homojen olana kadar bir serolojik pipet kullanarak aşağı polimer hücre karışımı pipetle.
       1. alginat mikro tohumlama için, 35 mm'lik kültür kabına (6.10.2 için tarif edildiği gibi elde edilir) PNIPAAm-g-CS-hücre süspansiyonu transferi ve karışıma bir parçacığın. yukarı ve homojen olana kadar bir serolojik pipet kullanarak aşağı hücre karışımı pipetle.
    3. 6, kopya numuneler - serolojik pipet kullanarak, öldürülmüş kontrol deliklerin her birine polimer hücre karışımı çok 300 ul dağıtmak, PNIPAAm-g-CS ve aljinat mikro sahip PNIPAAm-g-CS 4 üretir.
11. (Polimer, opak, beyaz bir disk meydana) 10 ila 15 dakika için 37 ° C'de inkübe plakası ve PNIPAAm-g-CS jelleşir bir sıvı geçiş sağlar.
12. kaputu sıcak bir slayt yerleştirin ve 37 ° C sıcaklığını ayarlamak. plaka korumak için sıcak slayt kullanınSıcaklık ve pipet her kuyuya önceden ısıtılmış medya 600 ul. bundan başka, bir sıvı hale polimerin geçiş yapma önlemek için, yukarıda havayı ısıtmak için çanak üzerinde floresan ampul ile bir lamba yerleştirin.
13. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 5 gün boyunca hücrelerle inkübe edin.
14. beş gün geçtikten sonra, etidyum homodimer (EthD-1) ve kalsein AM kullanarak Live / Dead boya karışımı hazırlamak. Her iki madde ışığa duyarlı ve kullanım günü hazırlanır.
    1. Oda sıcaklığında kiti kalsein AM ve EthD-1 Defrost.
    2. Bir konik tüp steril 1x PBS 5 ml ekleyin ve alüminyum folyoya sarın.
    3. konik tüp 2 mM EthD-1 6.67 ul ekleyin. İyice çözelti karışımı karıştırın.
    4. Sonraki, konik tüp 4 mM Calcein AM 2.5 ul ekleyin. Karışımı iyice karıştırın.
15. tek tabakalı (pozitif kontrol), PNIPAAm-g-CS ve PNIPAAm-g-CS wit kuyu ortamı çıkarınH alginat mikrotanecikler. PBS ile iyice, ama nazikçe kuyu tüm yıkayın ve PBS kaldırmak.
16. aljinat mikro parçacıkları içeren hidrojel diskleri oda sıcaklığında sıvılaştırılması ve kuyuların her 50 mM sodyum sitrat 2 ml eklemesine izin ver.
17. öldürülmüş hücre kuyulardan medya (negatif kontrol) sökün. Hidrojel diskler oda sıcaklığında sıvılaştırılması ve her bir oyuğa 70% (h / h) metanol 300 ul ilave izin verin.
18. 37 ° C'de 45 dakika boyunca inkübasyona bırakılır.
19. Wells sodyum sitrat ve metanol solüsyonları çıkarın ve tek tek mikrosantrifüj tüpleri içine hidrojel süspansiyonlar, her pipetle. hidrojel süspansiyondan hücreleri ayırmak için 10 dakika boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin tüpler.
20. Dikkatle konik tüp çözüm pipetleme ve hücre pelet geride bırakarak süspansiyon kaldırın. PBS 300 ul pelletini ve orijinal plaka aktarın.
21. t 300 ul ekleyino / kuyuların her Dead boya karışımı canlı. Alüminyum folyo ile plaka sarın ve oda sıcaklığında bir rocker 45 dakika inkübe edilir.
22. Resim 10X objektif bir ters flüoresan mikroskop altında örneklerin hepsi. Yaşayan hücreler ve öldürülen hücrelerin sırasıyla yeşil ve kırmızı floresan gösterecektir.

Bir XTT Test kullanma 7. Kantitatif Hücre Canlılık

1. % 80 izdiham HEK-293 hücreleri büyütün. İki kültür yemekleri büyüme ortamı çıkarın.
2. Her plaka için% 0.5 tripsin 1 ml ilave edilir. Plakalar, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe izin verin. Hücreler nazikçe plaka dönen yüzeyden ayırmak olmadığını kontrol edin.
3. iki kez ortam 3 ml plaka HEK-293 hücreleri yıkanır ve aynı 15 ml konik tüp, her iki süspansiyon ekleyin.
4. 4 ° C'de 400 x g'de 10 dakika boyunca 15 ml konik tüp santrifüjleyin.
5. Süpernatantı ve ortam 3 ml hücre pelletiniYukarı ve aşağı pipetleme.
6. Pipet hemasitometre hücre süspansiyonu, 10 ul ve hücre yoğunluğu belirlemek için bir hücre sayımı gerçekleştirin. Daha önce tarif edildiği gibi, 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyon, korur. Santrifüj HEK-293 400 xg'de hücreleri ve buna bağlı olarak medya düzeltilmiş hacim hücre pelletini.
7. Yavaşça hücre süspansiyonu vorteks ve eşit, aşağıdaki test koşulları için dört ayrı 15 ml konik tüp içine, hücre karışımı dağıtmak: PNIPAAm-g-CS pozitif kontrol tek tabaka, negatif öldürüldü kontrolü (h / h) metanol% 70 kullanılarak, HEK-293 alginat mikro sahip PNIPAAm-g-CS kapsüllenmiş PNIPAAm-g-CS kapsüllenmiş hücreler ve HEK-293 hücreleri.
8. 6 tekrarlı örnekleri - 4 üretmek için bir 24 plaka içine hücre karışımı 300 ul pipetleme pozitif kontrol tek tabakaları oluşturun.
9. öldürülen kontrol ilişkin konik tüpler ortamı çıkarın, PNIPAAm-g-CS ve PNIPAAm-g-aljinat mikropartiküller CS.
   1. 400 x g'de 5 dakika boyunca konik tüpler santrifüj ve süpernatant kaldırmak.
   2. çıkarıldı ortam olarak PNIPAAm-g-CS, aynı hacimde içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla aynı hücre konsantrasyonunu korumak. yukarı ve homojen olana kadar bir serolojik pipet kullanarak aşağı hücre karışımı pipetle.
      1. aljinat mikropartiküller ile tohumlama ise, 35 mm kültür kabına PNIPAAm-g-CS-hücre süspansiyonu aktarın ve karışımı içine parçacıkları tanıtmak. yukarı ve homojen olana kadar bir serolojik pipet kullanarak aşağı hücre karışımı pipetle.
   3. 6, kopya numuneler - serolojik pipet kullanarak, öldürülmüş kontrol deliklerin her birine polimer hücre karışımı 300 ul dağıtmak, PNIPAAm-g-CS ve aljinat mikro sahip PNIPAAm-g-CS 4 üretir.
10. Bir kez hücre içeren numunelerin 24 oyuklu plakaya ilave edilmiştir, PNIPAAm-g-CS ve PNIPA birden çok 300 ul hacimde dağıtım6 tekrarlı örnekleri - Am-g-CS komşu kuyularda hücreleri olmadan aljinat mikropartiküller 4 üretmek için.
11. (Polimer, opak, beyaz bir disk meydana) 10 ila 15 dakika için 37 ° C'de 24-çukurlu plaka inkübe ve PNIPAAm-g-CS jelleşir bir sıvı geçiş sağlar.
12. kaputu sıcak bir slayt yerleştirin ve 37 ° C sıcaklığını ayarlamak. her kuyuya önceden ısıtılmış açık DMEM iyi plaka hava sıcaklık ve pipetin 600 ul korumak için slayt sıcak kullanın. bundan başka, bir sıvı hale polimerin geçiş yapma önlemek için, yukarıda havayı ısıtmak için çanak üzerinde floresan ampul ile bir lamba yerleştirin.
13. % 5 _CO2 37 ° C'de 5 gün boyunca hücrelerle inkübe edin.
14. Beş gün geçtikten sonra, üreticiden 2,3-bis- (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil) -2H-tetrazolyum-5-karboksanilid (XTT) reaktifi hazırlamak. XTT reaktif kullanımı gününde ışığa duyarlı ve hazır.
    1. kehribar şişe bulundurmak kaldırbuzdolabından XTT toz ing. steril bir şırınga ve iğne kullanılarak, kehribar şişeye lastik septum ile net DMEM (fenol kırmızısı) 5 ml enjekte edilir.
    2. 10 dakika süre ile ya da çözünene kadar bir su banyosu içinde 56 ° C'ye kadar reaktif ısıtın.
    3. Bundan başka, alüminyum folyo ile sarılmış bir 15 ml konik bir tüp içinde% 20 (h / h) ile XTT reaktif seyreltin. mikrosantrifüj tüpler aşırı XTT reaktifi alikotu ve uzun süreli depolama için -20 ° C derin dondurucuda koyun.
15. öldürülmüş hücre kuyu ortamı (negatif kontrol) çıkarın ve her bir oyuğa 70% (h / h) metanol 300 ul ekle. 37 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe edin ve oyuklarda metanolü uzaklaştırmak.
16. tek tabakalı (pozitif kontrol), PNIPAAm-g-CS ve PNIPAAm-g-CS alginat mikro olan geri kalan oyuklara ortamı çıkarın. PBS ile iyice, ama nazikçe kuyu tüm yıkayın ve sonra PBS kaldırmak.
17. 2 300 ul ekleyinyuvaların her birine% 0 XTT reajanı. alüminyum folyo ile 24 oyuklu plaka sarın ve oda sıcaklığında bir rocker 24 saat boyunca inkübe edilir.
18. 24 saat sonra, bütün gözlere, 50 mM sodyum sitrat, 200 ul ekleyin ve bir ilave saat daha rocker üzerinde inkübe edin.
19. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2000 x g'de mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj polimer süspansiyonları her aktarın.
20. 96 çukurlu bir levhanın her bir mikrosantrifüj tüpten 200 ul aktarın. bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak, 690 nm 'de 450 nm ve spesifik olmayan emme okuma spesifik absorbans okumaları elde edin.

Sonuçlar

Bir termal duyarlı aşılanmış ko-polimer başarıyla sentezlenmiş ve biyoadheziv dayanıklılık için karakterize özellikleri şişme ve in vitro hücre proliferasyonu içinde oldu. Biz nedeniyle köklü mukozaya yapışan özellikleri aljinat araştırmak için seçti. ± 14.9 um 59,7 arasında bir ortalama çapa sahip aljinat mikropartiküller,% 5 ile harmanlandı (a / h), 25, 50 ve 75 mg / ml'lik konsantrasyonlarda PNIPAAm-g-CS. Bu konsantrasyonlar, eşit ...

Tartışmalar

hidrojel mikropartikül kompozit sentezleme ve yapıştırıcı gücü değerlendirmek, yetenek ve hücresel biyouyumluluk şişme birkaç kritik adımlar vardır. PNIPAAm-g-CS serbest radikal polimerizasyonu kondroitin sülfat başarılı methacrylation monomer bileşenlerinin tam çözülmesini, ve oksijensiz reaksiyon koşulları gerektirir. Yerli intervertebral disk dokusunun ²⁹ benzer mekanik özelliklere sahip kopolimerler üretmek için, önceki çalışmada, gösterilmiştir, çünkü reaksiyon karı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-isopropylacrylamide, 99%, pure, stabilized	Acros Organics	2210-25-5	Refrigerate and remove stabilier with hexane
Chondroitin sulfate A sodium salt (from bovine trachea)	Sigma-Aldrich	39455-18-0	Refrigerate
Hexanes	Fisher Scientific	H302-4	Store in a flammable cabinet
50% (w/w) sodium hydroxide	Fisher Scientific	SS254-1	Caustic in nature
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276685	Strong fumes; use in a fume hood
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	Chill in a refrigerator prior to use
Nitrogen Gas	Praxair	7727-37-9	Part Number: NI 4.8, cylinder style T, 99.998% pure nitrogen (Argon may be used as an alternative inert gas)
Tetramethylethylenediamine, 99% extra pure	Acros Organics	110-18-9
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678	Hygroscopic and degrades in the presence of water
Phosphate buffered saline tablets	Fisher Scientific	BP2944	Keep dry
Alginic acid, sodium salt	Acros Organics	177775000	Use heat to aid in dissolving
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79
Canola oil	Local store		Obtain from a local store
Tween 20	Sigma-Aldrich	93773
70% (v/v) Isopropoanol	Fisher Scientific	A416-4
Porcine ears	Haine's Pork Shop		Obtain from a local butcher
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Human embryonic kidney 293 cells	ATCC	ATCC CRL-1573	Store in liquid nitrogen for long-term use
DMEM: 1x, high glucose, no pyruvate	Life Technologies	11965126	Refrigerate
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082-147	Refrigerate
Penn Strep: 10,000 U/ml	Life Technologies	15140-122	Refrigerate
Trypsin-EDTA: 0.5%, 10x	Life Technologies	15400-054	Refrigerate
Methanol	VWR	AAA44571-K7
Live/Dead Cell viability kit	Life Technologies	L3224	Light sensitive, keep frozen
XTT cell viability kit	Sigma Aldrich	TOX2-1KT	Light sensitive, keep frozen
Clear DMEM: 1x, high glucose, no phenol	Life Technologies	21063-029	Refrigerate
Dulbecco's PBS: 1x	Life Technologies	14190136	Refrigerate
Sodium citrate	EMD	SX0445-1
Positive displacement pipette	BrandTech Scientific, INC	2702904	Dispenses 100 - 500 µl and comes with attachable tips
No 3. Stainless Steel scalpel handle	Sigma Aldrich	S2896
Miltex sterile surgical blades	Fisher Scientific	12-460-440	Size 10
Power gem homogenizer	Fisher Scientific	08-451-660	Model # 125
Porcelain mortar and pestle	Sigma Aldrich	Z247464	Holds 50 ml
FreeZone 1 L benchtop freeze dry system	Labconco	7740020	Freeze samples prior to use
Oil sealed rotary vane pump	Edwards	A65301906	Model # RV5
Incubating orbital shaker	VWR	12620-946	Model # 980153
Benchtop refrigerated centrifuge	Forma Scientific, INC		Model # 5682
Heated ovens	VWR		Model # 1235PC
2 N force gauge	Shimpo	FGV-0.5XY	Model # FGV-0.5XY
E-force test stand	Shimpo	FGS-200PV	Model # FGS-200PV
Tissue culture swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter	366830	Model #6S-6KR
Tissue culture microcentrifuge	Eppendorf		Model #5415C
Hemacytometer set	Hausser Scientific	3720	Requires replacement cover glass slips
Slide warmer	Lab Scientific	XH-2022	Model # XH-2002
Portable heating lamp	Underwriters Laboratories		Helps to maintain polymer temperature at 37 °C
Inverted fluorescent microscope	Zeiss		Model Axiovert 25 CFL
Heated water bath	VWR		Model # 1235PC
Rocking platform	VWR		Series 100
Multiskan FC microtiter plate reader	Thermo Scientific		Type 357
Cell culture incubator	VWR		Model # 2350T
Purifier class II biosafety cabinet	Labconco		Delta Series