Sıçan oligodendrosit Progenitör Kültürler hazırlanması ve Oligodendrogenesis Niceleme Çift kızılötesi Floresan Tarama kullanma

Özet

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Özet

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Giriş

Memeli merkezi sinir sisteminde (MSS) etkili sinir iletim oligodendrositlerin akson myelinizasyonunu gerektirir. Gelişimi sırasında, oligodendrosit gelişmekte olan ön beyin ve nöral tüp ¹ ventriküler bölgelerinden göç düşünülen oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPC) havuzundan kaynaklanmaktadır. Göç OPC olgun, myelinating oligodendrositlere içine ayırt sonra etkili uyarı iletimini kolaylaştırmak değil, aynı zamanda trofik desteği ² ile aksonlar sağlamaz sadece. Yetişkin MSS tüm hücrelerin ³ yaklaşık 5-8% oluşan gri ve beyaz cevher boyunca dağılmış OPC bol bir nüfusa tutar. demiyelinizan bir hakaret sonrasında, OPC, yaralanma siteye göç çoğalırlar ve maruz aksonlar kayıp ya da hasarlı miyelin kılıflar yerine ayırt. Ancak, bazı hastalık / yaralanma ayarlarında bu süreç verimsiz olduğu bulunursa veya tamamen ⁴ başarısız olabilir. SüreKronik demiyelinizasyon belirtileri ⁵ hafifletmek olabilir hastalığı, verimli oligodendrogenesis ve remiyelinizasyon yükü eklemek için düşünülmektedir. Bu nedenle oligodendrogenesis deneysel faktörlerin etkisini belirlemek için in vitro OPC çalışma ilgi olmuştur.

oligodendrosit farklılaşma farklı evreye Insight sahne spesifik hücre belirteçleri tanımlanması ile mümkün olmuştur. Kendini sürekli yenileyen, erken progenitör hücreler trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa onların ifadesi (PDGFRα) tarafından tanımlanan, sinirsel / glia antijen 2 (NG2) ve A2B5 ^6-8. OPC kendi farklılaşma programlarının başlatmak ve hücre döngüsünün çekilme olarak, bu markerlerin ifadesinin aşağı ve siklik nükleotid 3'-fosfodiesteraz (CNPase) ve O4 içeren oligodendrositlerin premyelinating göstergesidir proteinleri ifade etmek için başlar. Son olarak, daha fazla erişkin oligodendrositlerin, farklılaşmasıytes myelin-ilintili glikoproteinin (MAG), proteolipid protein (PLP) ve miyelin bazik protein (MBP) gibi miyelin ilişkili proteinlerin ekspresyonu ile karakterize edilir. MBP hücre içi bir çevresel zar proteini ve miyelin kılıfının bir ana bileşenidir. MBP eksik Fare MSS miyelinasyon anlamlı titremeler, kasılmalar ve erken ölüm ^9,10 giden azalmış olduğu ciddi bir fenotip geliştirmek. Miyelinasyon MBP bu önemli bir rol, in vitro ve in vivo ¹¹ hem de oligodendrosit farklılaşması için bir markör olarak kullanımına yol açmıştır.

MBP miktarının çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. RT-PCR ve Batı boya analizi Farklı tedavi rejimleri altında MBP seviyelerinin ölçümü için izin verir. Immünsitokimya kamera bazlı mikroskopi yaklaşımlar kullanıldığında da nicel olabilir ortak bir nitel bir yaklaşımdır. Bu sistemler güvenilir ve temel rağmenOligodendrosit farklılaşma çalışması, her bir ilaç taramasında, kullanımlarını sınırlayan kendi dezavantajları vardır. İlk olarak, RT-PCR ve Batı boya analizi için gerekli olan primer OPC miktarı eş zamanlı olarak kontrol edilebilir değişken sayısını azaltır. immünsitokimya hücre gereksinimi çok daha düşük olsa da kantitatif hedefi ise, önemli ölçüde zaman her bir deney için ayrılmış olmalıdır. Sayısız görüntüler yakalanır ve daha sonra deneysel analizi kolaylaştırmak için ölçülebilir olmalıdır. Bu uyarılar yüksek verimlilik değerlendirmesi gerektiren çalışmalar için dikkate almak önemli engeller haline gelir. önemli ölçüde gerekli hücrelerin sayısını ve kantitatif analiz tamamlamak için zaman hem azaltırken Burada, immünsitokimya ve miyelin ölçümü için Western Blot metodolojileri hem temel yönlerini kullanan bir yöntem açıklanmaktadır.

Protokol

Hayvan denekleri Prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Johns Hopkins Tıp Okulu tarafından onaylanmıştır.

Tahlil Tabaklar, Stok Çözümleri ve OPC Taban Medya 1. Hazırlık

Not: Burada anlatılan sıçan OPC taban (Sato) Medya daha önce yayınlanmış çalışmaları ^12,13 türetilmiştir. Alternatif medya formülasyonları da bu prosedüre uyumlu olmayabilir.

1. Steril deiyonize su içinde 10 ug / ml'lik bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse poli-L-lisin (PLL). Pipet siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 24 oyuklu doku kültürü dereceli çanak her oyuğuna seyreltildi PLL 400 ul.
2. 37 ° C, doku kültürü kuluçka makinesi içinde ya da gece boyunca 4 ° C buzdolabında 2 saat Coat doku kültür tabakları.
3. kaplama en az 20 dakika önce kaplanmış yemekleri aspire PLL. bir doku kültüründe kapak kısmen aralık 24 yuvalı plakalar yerleştirilerek kalan PLL kuyudan kurumaya bırakındavlumbaz. kuyular izole OPC kaplama önce tamamen kuru olduğundan emin olun. Hücreler sıvı PLL hediyesi vardır plastik bağlı olmayacaktır.
4. N-Asetil-L-sistein (NAC) stok çözeltisi (1,000x) hazırlayın: Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde, 20 ml, 100 mg N-asetil-L-sistein (NAC) çözündürülür. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
5. Hidrokortizon stok solüsyonu (1,000x) hazırlayın: 1 mg hidrokortizon ve çözünmesi için girdap etanol 1 ml ilave edilir. DMEM 19 ml ilave edilir, -20 ° C'de çözelti kısım ve mağaza karıştırın. Taban ortamına hidrokortizon eklenmesi glial hücreler ¹⁴ hayatta kalmasını geliştirmek için gösterilmiştir.
6. D-Biyotin stok solüsyonu (5,000X) hazırlayın: PBS, 50 ml D-biyotin 2.5 mg eritin. çözülmesine yardımcı olmak için 0.1 N NaOH 1-2 x 5 ul damla ekleyin. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
7. İnsülin stok solüsyonu (100 X) hazırlanması: Doku kültürü dereceli 50 ml su içinde 25 mg insülin eritin. 250 ul o eklef, 1 N HCl ve çözelti berrak olana kadar karıştırın. 6 haftaya kadar 4 ° C 'de, 0.22 um'lik bir filtreden ve mağaza ile sterilize edin.
8. Sato stok solüsyonu (100x) hazırlayın:
   1. progesteron stok solüsyonu (25 mg / ml) hazırlayın: etanol 100 ul 2.5 mg progesteron eritin.
   2. sodyum selenit stok solüsyonu (400 ng / | il) hazırlayın: 0.1 N NaOH, 100 ul 4 mg sodyum selenit eritin. DMEM 10 ml ilave et ve karıştır.
   3. DMEM, 100 ml, insan apo-transferin, 1 g, büyükbaş hayvan serum albümini, 1 g ve putreskin 160 mg edin ve tamamen eritmek için karıştırın. progesteron stok çözeltisi 25 ul, sodyum selenit stok çözeltisi 1.000 ul, ilave et ve karıştır. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
9. OPC baz ortamla hazırlayın: DMEM, 100 ml (4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin ve 110 mg / L sodyum piruvat ile), 100 ul NAC, 100 ul hidrokortizon, 20 ul D-Biotin, 1 ml ilave insülin, 1 ml Sato stok, 100 ul eser elementler B,2 ml B-27 Yedek (50x) ve penisilin / streptomisin (100x) 1 mi. 4 ° C 'de, 0.22 um'lik bir filtreden ve mağaza ile sterilize edin.
10. PDGF-AA stok solüsyonu (1,000x) hazırlanması:% 0.1 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) içeren PBS içinde 12.5 ml, 250 ug, 20 ug / ml çözelti yapmak için eritin. -80 ° C'de kısım ve mağaza.
11. OPC çoğalma, ortam maddesi hazırlayın: OPC baz ortamı 20 ng / ml PDGF-AA ile takviye edilmiştir.
12. OPC farklılaşma medya hazırlayın: 45 nM triiyodotironin ile desteklenmiş OPC baz ortamı.
13. Kolon tampon çözeltisi hazırlayın: PBS, 500 mL, 2.5 BSA g ve 2 ml 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve pH'ı 7.2'ye ayarlayın. 4 ° C 'de, 0.22 um'lik bir filtreden ve mağaza ile sterilize edin.

2. Rat Beyin Diseksiyon

Not: P5-P7 sıçan yavrular bu protokol kullanılır. Her sıçan yavru korteks yaklaşık 1.5-2.0 ^x 10 6 A2B5 pozitif hücreler verir.

1. Bir 250 kullanan tüm diseksiyon ekipmanı sterilize6 C ısıtılmış boncuk sterilizatör.
2. 50 ml konik tüpler PBS (Ca ²⁺ ve Mg ²⁺ olmadan) 15-20 ml ekleyin. Bir 50 ml konik tüp 3-4 sıçan yavru korteks için yeterlidir. buz üzerinde 50 ml konik tüpler yerleştirin. Diseksiyon sırasında doğranmış korteks dokusu tutmak için 50 ml konik tüpler kullanın.
3. 10 cm Petri için, soğuk PBS ilave edin. Bu yemeğin ışık mikroskobu altında diseksiyon için kullanılacaktır.
4. Büyük cerrahi makas ile kafaları kesilmek suretiyle sıçan yavrular Kurban. % 70 etanol ile baş püskürtün.
5. Tüm Beyin Özü
   1. Kullanarak küçük makas orta hatta aşağı ve geri kulakları ve kabuğu cilt flepleri arkasında cilt kesti. orta hat beyin sapından başlayarak ve göz biten kafatası azaltın. Altta yatan korteks yapısını korumak için çok derinden kesmek için dikkatli olun.
   2. foramen magnum içine küçük cerrahi makas sokarak beyincik iki yanal kesim aşağı olun. gözlerinin arasında ek bir kesim olun, karıncakoku ampuller erior.
   3. Dikkatle geri kafatası her yarısını soyun. soğuk PBS ile dolu 10 cm Petri kabındaki tüm beyin ve yer çıkarın.
6. Diseksiyon ışık mikroskobu altında, ince cerrahi forseps ile koku ampuller ve beyincik çıkarın.
7. ventral yüzeyi ışık mikroskobu altında görünür böylece beyin çevirin.
8. Kullanarak ince düz forseps beynin 2/3 hakkında bir derinliğe kadar korteks ve hipotalamus arasındaki kapalı forseps ipuçları koyarak bir künt diseksiyon. forseps yerinde olduğunda biter açmak için izin verir. diğer yarımkürede için tekrarlayın.
9. hipotalamus ve beynin bölgelerden korteksi Tease.
10. posterior yüzeyinde Ortabeyin tutarak ve beynin ön ucuna doğru sıyırarak hipotalamus, talamus, ve beynin çıkarın. ön bağlantılarını Sever.
11. dışarı doğru pealing ve daha sonra onun bağlantısını kesilmesinin hipokampus kaldırince bükülmüş diseksiyon forseps kullanarak korteks.
12. ince bükülmüş diseksiyon forseps kullanarak dışa doğru çapraz hareket yatan korteks onu hurdaya kalan striatum çıkarın.
13. korteks ventral yüzeyinde herhangi bir kan damarları ve meninks temizleyin.
14. dorsal yüzeyi görünür şekilde beyin çevirin. Zar ve kan damarlarının açık olmalıdır. ince diseksiyon forseps kullanılarak altta yatan korteks Peel meninksler. koku alma ampul eki yerden soyulması başlayın.
15. Komple 3-4 sıçan yavruların toplam 2.4-2.14 adımları.
16. kuru petri içine 3-4 disseke sıçan yavru korteks koyun ve 1 mm x 1 mm parçalar elde edilene kadar steril bir jiletle doğrayın. bir 50 ml konik tüp (adım 2), sonra geri buz üzerinde yeri itibaren PBS ile çanak durulayarak doku toplayın.

3. enzimatik ve mekanik Doku Ayrılma

Not: Bu adım için, bir papain tabanlı sinir ayrışma kiti tavsiye edilir. NE kullanarakural Ayrılma Kit (P), OPC izolasyonu için en uygun olan özel adımlar anlatılmıştır.

1. uygun bir tampon ile enzimin P seyreltilmesiyle birinci ayrıştırma enzim hazırlayın. her biri 50 ml konik (1 numune) içeriği enzim karışımı 1.950 ul toplam yeniden süspansiyon haline olacaktır. 10 dakika boyunca 37 ° C banyo enzim karışımı içine koyun.
   1 Örnek: papain enzimi Tampon 1900 ul + 50 ul
2. 3 dakika boyunca 300 xg'de tüm 50 ml 3-4 doğranmış sıçan yavru korteks içeren konik tüpler Spin.
3. Süpernatantı aspire ve her numune tüpüne enzim çözeltisi 1.950 ul ekleyin ve tersini tüp ve yavaşça sallayarak pelet parçalayın.
4. Sürekli tüp döndürme ile 15 dakika boyunca 37 ° C, doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
5. inkübasyon son 5 dakika boyunca, ikinci enzim karışımı A. kendine uygun tampon içinde enzimi seyreltin hazırlamak. 30 ul'lik toplam eklenecektirher biri 50 ml konik örnek tüp.
   1 Örnek: enzimin Tampon 20 ul + 10 ul
6. İnkübasyon tamamlandıktan sonra her tüp ikinci enzim karışımı 30 ul ekleyin ve karıştırın ters.
7. Bir pipet kontrolöre bağlı bir cam Pasteur pipet kullanılarak, mekanik 10-15 kez pipetleme ya da doku parçaları boyutu azaltılır ve çözelti bulanık hale gelene kadar doku ayırmak. sürekli dönmesi ile 15 dakika için 37 ° C, doku kültürü kuluçka makinesine örnek dönün.
8. 1 ml pipet kullanılarak her bir doku Homojenat örnek 10-15 kez pipetle.
9. 200 ul pipet kullanarak her doku Homojenat örnek 15-20 kez Pipet
10. sürekli dönmesi ile 10 dakika için 37 ° C, doku kültürü inkübatöründe konusu parçaların dönün.
11. 50 m üzerine yerleştirilmiş 40 um gözenekli filtreden Homojenat her bir örneğe ^{(Ca2 + 2 + ve} Mg ile birlikte) 10 ml PBS ilave edin ve filtrel tüpü. PBS ilave 1-2 ml filtreyi durulayın.
12. bir 50 ml konik tüp içine Homojenat örneklerinin tüm havuz ve genel bir hücre sayımı kazanır.
13. hücre sayımı yapıldıktan sonra, (her bir numune için 1 tüp) 15 ml konik tüpler içine eşit Homojenat ayrıldı. 300 x g, 10-12 dakika boyunca santrifüj.

4. Anti-A2B5 tane uygulama, sütun saflaştırma ve Kaplama

1. kolon tamponu ve anti-A2B5 microbeads için hesaplamalar gerçekleştirin. Her 1 ^x 10 6 hücre 7 ul kolon tampon çözeltisi ekleyin. Her 1 ^x 10 6 hücre için 2 ul anti-A2B5 mikroboncukları ekleyin.
2. 10-12 dakika boyunca 300 xg'de kolon tamponu ve santrifüj 10 ml toplam hacmi içinde yeniden süspansiyona alınmasıyla numunelerin tümünü birleştirin.
3. Aşama 4.1 hesaplanan kolon tamponu uygun miktarda hücre pelletini. Pelet büyük ve gevşek ise, sadece anti-tutmak için kolon tamponu hacminin yaklaşık yarısını ekleyinHücre tabanda uygun konsantrasyonda vücut.
4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe edin.
5. (Adım 4.1 hesaplanan), anti-A2B5 mikroboncukları ekleme birkaç kez ters çevirin ve 30-60 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Tüp hafifçe birkaç kez, her 10 dakika ters. Daha uzun inkübasyon süreleri, hücre verimi arttırabilir, ancak spesifik olmayan arttırabilir.
6. kolon tamponu 5 hacim ekleyin. Hücreler 1 ml'lik bir hacimde yeniden süspanse edilir ise hücreler, 2 ml içinde tekrar süspanse edilir, sütun tamponu 10 ml ise, kolon tamponu 5 ml.
7. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj.
8. arıtma için gerekli olacak kaç LS sütun belirleyin. Bir LS sütun 15-20 ^x 10 6 toplam hücre için yeterlidir.
9. LS kolon başına kolon tamponu 1.000 ul hücre pelletini kullanılır.
10. Başbakan kolon tamponu 5 ml ekleyerek her LS sütun. 50 ml konik bir tüp içinde akışını yoluyla toplayın. Sütun met kezffer tamamen üst odanın içinden geçirilmiş olup, her sütun hücre süspansiyonu 1.000 ul uygulanır ve hücreler, yerçekimi ile geçmek için izin verir.
    Not: hücre yoğunluğu çok yüksekse, kolon, yavaş çalışabilir.
11. Hücre süspansiyonu, sütunun içinden geçtikten hemen sonra, yavaş yavaş, bağlanmamış hücreleri yıkamak için her sütun sütun tampon 3 ilave edin. Yıkama kolaylıkla kolonu (her 30-45 saniye için 1 damla) ile çalışıyorsa, kolon tamponu 3 ml ile iki kez yıkanır.
12. Her sütun çıkarın ve bir 15 ml konik tüp üzerine yerleştirin. kolon tamponu 5 ml ilave edilir ve sütun ile paketlenir plastik piston kullanarak hızlı bir oranda kolon boyunca tampon dalma. Daldırma sütundan onları bırakmadan bağlı hücreleri çıkarmak olacaktır.
13. LS sütun ikinci tur üzerinden örnek çalıştırarak saflığı artırın. ilk geçiş sırasında kullanılan sütunlarının sayısının üçte birini kullanabilirsiniz. Prime kolon tamponu, 5 ml sütunlar.kolon tampon çözeltisi üst odaya geçmesine izin verir.
14. Hücre süspansiyonu hacmi daha büyük olacaktır için, eşit her sütun hücre süspansiyonu 1.000 ul uygulamak ve süspansiyon ilave 1.000 ul ilave etme önce kolonun üst bölmesi geçmesine izin verir.
15. Hücre süspansiyonu, tamamen sütun ikinci tur uygulandıktan sonra, kolon tamponu 3 ml 2-3 kez yıkayın.
16. Her sütunu kaldırmak ve steril 15 ml konik tüp üzerine yerleştirin. kolon tamponu 5 ml ilave edilir ve sütun ile paketlenir plastik piston kullanarak tampon dalma. Daldırma sütundan onları bırakmadan bağlı hücreleri çıkarmak olacaktır.
17. 12-15 dakika boyunca 300 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj. Pelet kompakt görünmelidir.
18. Önceden ısıtılmış OPC proliferasyon ortam (PDGF-AA 20 ng / ml ile takviye edilmiş OPC baz ortamı) 5-10 ml hücre pelletini.
19. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
20. Hücreleri Plate. OPC proliferasyon ortam ile 60.000 hücre / ml hücre seyreltilir. Her siyah içine, açık alt 24 gözlü, kuyunun kenarı boyunca hücrelerin pipet 500 ul kuyu başına 30.000 hücreleri elde etmek. yatay plaka sallayarak bir şekil sekiz hareketi kullanarak hücreleri karıştırın. 48, 96 ya da 384-kuyucuklu plaklar içinde tahlili gerçekleştirmek için, sırasıyla oyuk başına 15,000, 7,500 veya 1,500 hücre ekleyin. Bu sayılar, her bir levha özelliklerine bağlı olarak ayarlanabilir.
21. Gün 0 bazal kontrol kültürleri için ayrı bir tabak hazırlayın. Bölüm 5.7 de tarif edildiği gibi farklılaşma 0. günde başlatılır, bu kontrol plakası,% 4 paraformaldehit ile sabitlenmelidir.
22. Kültür herhangi bir ortam değişikliği ile, 3 gün boyunca 37 ° C'de OPC proliferasyon ortam hücreler.

% 4 Paraformaldehit OPC Farklılaşmasının ve Fiksasyon 5. İndüksiyon

Not: oligodendrogenesis küçük moleküllerin etkisini test ederken, biz rutin dissolvdimetil sülfoksit (DMSO) içinde E ilaçların daha sonra -80 ° C'de saklanır ve% 0.1 DMSO nihai konsantrasyon elde etmek üzere Sato ortamı doğrudan seyreltilebilinir 1,000x stokları hazırlamak. OPC proliferasyon ve farklılaşma, ya DMSO bu konsantrasyonu kullanılarak herhangi bir değişiklik gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir).

1. Pre-sıcak OPC tabanı 37 ° C ortam ve oda sıcaklığına kadar ilaç tedavisi stoklarını Çözülme. nüsha halinde tedavileri yaparken, 1.5 ml tüp içinde tedavi grubu başına medyanın yaklaşık 1.25 ml hazırlamak. üçlü numuneler için, bolluk hesaba 2 ml kapasiteli santrifüj tüpleri kullanın.
2. doğrudan OPC baz ortamına tedavi stokları seyreltilmesi ile çoğaltmak kuyuları için tedavi usta karışımları hazırlayın. Kısaca girdap veya hafifçe tedavi homojen dağılımını sağlamak için her MasterMix karıştırın.
3. Pozitif kontrol ve negatif kontrol olarak, uygun bir araç olarak 45 nm _{triiyodotironin} (T3) hazırlayın. 10 mM T ₃ stokunu1: OPC baz ortam 1 ml 1.000 ve daha sonra, gerekirse nihai DMSO konsantrasyonunu azaltmak için tedavi ana karışımı seyreltin.
4. Hücreler kurutulduktan önlemek için her seferinde bir kültür kuyusu, bir tedavi grubu ortamı aspire. Kuyunun yanından ve kültürün içine siyah malzemeyi kazıma önlemek için cam Pasteur pipet ucunda 200 ul pipet ucu kullanın.
5. Yavaş yavaş de 1 mL pipet kullanılarak tarafı boyunca işleme master 500 ul ekle.
6. 2-3 günde taze tedavi ortamı ile tam bir medya değişimi gerçekleştirirken, istenilen süre için kültürleri kuluçkaya yatmaktadır. Biz rutin farklılaşma medya 4 gün sonra% 30-40 MBP ⁺ kültürünü gözlemlemek.
7. arzu edilen tedavi döneminin sonunda, taze% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlanması ya da oda sıcaklığına kadar dondurulmuş bir stok Çözülme. DİKKAT: PFA son derece toksik ve davlumbaz hazırlanmış olmalıdır.
8. medya aspire ve yavaşça 400 eklemek1 'dir; hücrelerin tespit edilmeleri için kuyunun tarafına PFA l. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübasyona bırakılır.
9. PFA aspire yavaşça hücreleri yıkamak için de yan steril (Ca ^{+ 2} ve Mg ^{+ 2),} D-PBS 500 ul ekle. yıkayınız iki kez toplam tekrarlayın. Nihai yıkama aspire etmeyin.
10. Daha sonra işlem için 4 ° C'de parafilm ve mağaza plaka sarın ve bir sonraki aşamada doğrudan devam edin. Plakalar birkaç hafta muhafaza edilebilir.

Miyelin Temel Protein 6. İmmünositokimya ve Niceleme

Not: 24 yuvalı plakalar içinde sıvı kullanım tekniklerinin, bu hücrelerin kurumasını önlemek için hızlı çalışma için tavsiye edilir. Burada, çok kanallı bir aspiratör ve çok kanallı pipet kullanılması tavsiye edilir.

1. % 0.1 Triton X-100 ve% 5 ihtiva eden (Ca ^{+ 2} ve Mg ^{+ 2),} D-PBS 250 ul, oda sıcaklığına kadar plaka getirmek kuyu aspire ve eklemenormal keçi serumu (NGS). yumuşak bir yörünge çalkalanarak 1 saat oda sıcaklığında inkübe plakası.
2. 1000 ve tavşan poliklonal anti-aktin antikor, 1: Fare monoklonal anti-MBP antikoru 1 seyreltilmesi ile primer inkübasyon çözeltisi hazırlayın% 5 NGS içeren D-PBS içinde 200 (Ca ²⁺ ve ^Mg2 +). Seçenek olarak ise, tavşan poliklonal anti-olig2 ile 1: 1,000 karışık glial kültürlerde oligodendrosit belirli bir normalizasyonu için kullanılabilir. kuyu başına 250 ul karşılamak için yeterli birincil çözüm hazırlayın.
3. yumuşak çalkalanması 16-18 saat boyunca 4 ° C 'de primer antikor inkübe edin.
4. Birincil inkübasyon çözeltisi aspire ve yumuşak yörünge çalkalama ile oda sıcaklığında (Ca ^{+ 2} ve Mg ^{+ 2),} D-PBS 500 ul hücreleri 3 X 10 dakika yıkama.
5. Plaka yıkarken anti-fare 680 ve anti-tavşan antikorları, 800 1 seyreltilerek sekonder inkübasyon solüsyonu hazırlamak: Ca (D-PBS içinde 500 ²⁺ ve Mg ^2+). Bu çözümü hazırlarken ortam ışığı maruziyeti en aza indirmek.
6. Nihai yıkama aspire ve ikincil inkübasyon çözeltisi 250 ul ekleyin. ışıktan plaka korumak ve yumuşak yörünge çalkalanarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
7. İkinci inkübasyon çözeltisi aspire ve yumuşak yörünge çalkalama ile oda sıcaklığında (Ca ^{+ 2} ve Mg ^{+ 2),} D-PBS 500 ul Wells 3 x 10 dakika yıkama.
8. 700 nm ve 800 nm flüoresans emisyonlarının saptayabilen bir görüntüleme sistemi kullanılarak plaka tarama. Bir başlangıç ​​noktası olarak, MBP için 1.5 ila 3 ve hassasiyetleri, Aktin için 5.0 ve olig2 için 3.5'e ofset fokal ayarlayın. Sinyal maruz kalmaktan kaçınılmalıdır gerektiği gibi hassasiyet değerlerini ayarlayın.
9. Yarı otomatik yazılım tabanlı yöntemler kullanılarak oligodendrogenesis düzeyinin nicelleştirilmesidir.
   1. yazılımı kullanarak, plaka analizi modunu "24 Peki" kurmak ve t etrafında daireler hizayaTaranan kuyu da dış çevresi. "800" ile normalleşme kanalı ayarlamak ve 700 nm (MBP) ve 800 nm (olig2 / Aktin) kanalları için toplam ve bağıl floresan yoğunlukları ihracat.
   2. bağıl floresan birimlerinde normalize MBP ifade vermek için 800 nm'de yoğunluğu 700 nm'de yoğunluğu bölün. tekrarlanan ölçümlerin ortalamasını hesaplayın ve analiz için gerekli olarak Günü 0 + PDGF denetimlerini ifade ölçek.

Sonuçlar

A2B5-pozitif OPC manyetik kolon ayırma sistemi kullanılarak pozitif hücre seçimi ile izole edilir. İzolasyon ^ işleminde önce, tüm beyin P5 ve P7 arasında olan sıçan yavrularından kaldırılır. Tüm beyin başarıyla kafatası ayrılmış sonra, koku ampuller ve beyincik ince cerrahi forseps (Şekil 1A) kullanarak kaldırılır. Serebral kortikal doku izole etmek için hipotalamus, talamus ve orta beyin dikkatli diseksiyon (Şekil 1B) taraf?...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol sıçan OPC izole edilmesi ve deney faktörlere yanıt olarak in vitro oligodendrogenesis olarak ölçülmesi için hızlı ve güvenilir bir yöntem tarif eder. Pozitif bir seçim kullanarak, canlı ve saf OPC yüksek verimi deneysel amaçlar için doğrudan kullanılır. Bu yöntem, bir 1 haftalık bir zaman çerçevesi içinde izolasyon, kültürlenmesini, ve farklılaşma adımları kolaylaştırır ve sabit hücreler uygun bir deney, hassasiyet kaybı olmaksızın birkaç h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm Polystyrene Petri Dishes	Fisherbrand	0857512
Light Dissection Microscope	Motic	SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628	Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
40 μm Cell Strainer	Corning	352340
A2B5 Column Purification
Anti-A2B5 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-097-864	Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Magnetic Selection Columns
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
PBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	20-030-CV	1x
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Quetiapine hemifumarate salt	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
24-well Black Visiplate with lid	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
mouse monoclonal anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1,000 Dilution
goat anti-mouse 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:1,000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A11008	1:1,000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor