En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Özet

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Özet

morfolojilerinden üzerinde çalışmaların çoğu belirli genler ve genetik yolların bozulması nasıl etkilendiğini anatomik özelliklerin niteliksel açıklamaları güveniyor. Genetik manipülasyon fenotipik etkilerin bir dizi üretmek ve varyasyonların da kontrol grubu içindeki bireyler arasında görülen, ancak nicel Tanımlar nadiren yapılır. delil Yükselen morfolojisi, boyut ve organellerin konumu hücre fonksiyonu ve sağkalım daha önce underappreciated, henüz temel bir rol oynadığını göstermektedir. Burada Drosophila larva nöromüsküler bileşke (NMJ) de fenotipleri kantitatif analizleri gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar. Biz biyo-görüntüleme teknikleri ve morfometrik spesifik hücresel süreçlere genetik mutasyonların etkilerini incelemek için analizler ile birlikte birçok güvenilir immunohistokimyasal işaretleri kullanmak. Özellikle, morfoloji, boyut ve n durumunu etkileyen fenotipleri nitel analiz odakuclei Drosophila larvaların çizgili kasların içinde. Drosophila larva NMJ sağlık ve hastalık hem yapısını ve kas sinir sistemi işlevini, altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli bir deneysel model. Bununla birlikte, burada tarif yöntemleri gibi diğer sistemlere uzatılabilir.

Giriş

Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.

We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.

The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle¹. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila². Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)¹.

Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role^3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.

The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.

Protokol

1. Deneysel hazırlanması

Not: inceleme ve bölümler 2 imüno-histokimya prosedürleri ve 3, ancak modifikasyonlar ile, referanslar ^3-6 göre gerçekleştirilir.

1. 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve% 0.1 Triton-X-100 ihtiva eden PBS (PBT) hazırlayın. buz üzerinde saklayın.
2. Bouin fiksatif hazırlayın (15 Pikrik Asit: 10 Formaldehit: 1 Asetik Asit). Bu reaktif taze olun.
3. temiz paslanmaz çelik minutien işaretçilerine ve ince forseps seçin.
4. 5 cm Petri kabındaki bir Sylgard diski içeren diseksiyon tabak hazırlayın.

Üçüncü evre Larva NMJs 2. Diseksiyon

1. Bir şişe veya ince bir fırça ile bir şişe üçüncü evre larvaları dolaşıp almak ve uzak kalan yiyecek yıkamak için 4 ° C PBS içeren 2 cm Petri kabı içine yerleştirin.
2. diseksiyon plaka Sylgard yüzeyinin üstünde bir larva yerleştirin ve positi olduğundan emin oluniki uzunlamasına trakea tüpleri üstünde görünecek şekilde dorsal yüzü oned.
3. forseps kullanarak, pimi tutun sağ ağız kanca altında, onun ön sonunda larva pin. mümkün olduğunca larva germek ve arka aşağı son pin.
4. plaka duvarları ulaşmak için yeterli PBS tuzlu ekleyin ve tamamen larva batırmayın.
5. Aynı genotip diğer larvalar için 2.3 adımları 2.1 prosedürü tekrarlayın. Tek bir 5 cm Petri kabı diseksiyon plaka kolayca 8 larva konaklayabilir.
6. Mikro-diseksiyon makas kullanarak, hafifçe dorsal manikür kaldırın ve pin yakın arka ucundaki küçük bir yatay bir kesi yapmak.
7. trakea iki boyuna yolları arasındaki orta hat boyunca ön sonuna kadar larvanın tüm yol kesip, kesi içine makas yerleştirin. orta hat kesintileri sadece manikür geçmesine ve kasların ile kesme önlemek için yeterince yüzeysel olduğundan emin olunventral yüzü.
8. her bir ucunda, sol ve sağ taraflarında iki çentik kesti.
9. ön kesi her iki tarafında iki işaretçilerine koyarak fileto açın. arka ucu ile aynı tekrarlayın. işaretçilerine yerleştirirken, ayrı beden duvarı yaymak için emin olun.
10. forseps ve PBS tuz kullanarak iç organları dışarı temizleyin. bozulmamış merkezi sinir sistemini bırakın. Yavaşça tamamen gerilir kadar köşe pimleri ile larva germek ama kaslar bu süreçte yırtık olmadığından emin olun.
11. Aynı diseksiyon plaka üzerinde diğer larvalar için aynı diseksiyon işlemi tekrarlayın.
12. tüm iç organları kaldırmak için PBS tuzlu su ile üç kez yıkayın.
13. Bouin fiksatifi PBS ile değiştirin ve 10 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
14. PBT ile birkaç kez yıkayın.
15. dikkatlice işaretçilerine çıkarın ve immün boyanması için 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne şimdi oldukça sert olan tüm hazırlıklarını, aktarın.

Kas ve Myonuclei için spesifik antikorlar ile Drosophila NMJs 3. immünohistolojik boyama

1. Hızla PBT larva filetosu durulayın.
2. sabit bir ajitasyon altında 2 saat PBT içinde% 10 normal keçi serumu (NGS) ile inkübe edilerek preparatlar bloke eder.
3. PBT 5 NGS ve% (1 konsantrasyonda: 500) bir tavşan anti-lamin antikoru ihtiva eden parçalara NMJs bir dizi inkübe: 2 saat ve (1: 500 arasında bir konsantrasyonda) kobay anti-DVAP antikoruyla Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de. Anti-lamin boyama myonuclei konturunu algılayan ise anti-DVAP antikoru çizgili kasları boyar.
4. aşan antikorlar kaldırmak için PBT kez hızlı bir şekilde yıkayın. PBT her 15 dakikada bir tampon değiştirerek 2 saat PBT yıkayın.
5. PBT 1 ile% 5 NGS ve fluoresan etiketli sekonder antikorları içeren örnekleri inkübe: Oda sıcaklığında 500 seyreltme 2 saat süredir. Aynı örnekler cBir başka kromofor ile konjuge sekonder antikor kullanıldığında, aynı anda birden fazla antikor ile boyanarak tabi.
6. ikincil antikorlar çıkarın ve PBT her 15 dakikada tampon değiştirerek 2 saat boyunca PBT yıkayın.
7. myonuclei PBS ile numuneleri üç defa yıkamak ve aşağıdaki işlemleri iç leke:
   1. PBS içinde 1000 ve sürekli ajitasyon altında 20 dakika boyunca inkübe edilir: 1 bir seyreltme TO-PRO-3 nükleer işaretleyici ekleyin. Bu işaretleyici, bu çalışmada kullanılan, ancak herhangi bir başka ticari olarak temin edilebilir, nükleer bir belirteç olarak da kullanılabilir.
   2. takmadan önce PBS içinde hızla üç kez yıkayın.

Slaytlar 4. Montaj Örnekleri

1. 1.5 ml mikro santrifüj tüpüne gelen forseps ile örnekleri Pick up ve bir işlem slayt onları uzandı.
2. Mikro-diseksiyon makas kullanarak, baş ve filetolar kuyruk kesilmiş ve iç yüzey yukarı tutmak.
3. th hazırlayıne birbirinden yaklaşık 1 cm mesafede temiz bir sürgünün her iki tarafında, selüloz bant üç şerit etrafına sarılarak slayt monte edilebilir. Lamel iki şeridin üzerine yerleştirildikten sonra, bir boşluk örnekleri düzleştirme önlemek olacaktır oluşturulur. yapıların üç boyutlu hacimli kaplamalar yapılacak ise, bu çok önemlidir.
4. Üç selüloz bandı şeritler arasındaki bağlantı sürgünün ortasında montaj orta, yaklaşık 20 ul arasında küçük bir damla koyun.
5. temiz forseps ile montaj orta yayıldıktan sonra, iç yüzey uydurarak, montaj ortama montaj slayt disseke larva sürükleyin. Dört ya da beş satır onları bağlamaya çalışın.
6. Yavaşça montaj slayt üstüne bir kapak kayma bırakın ve herhangi bir hava kabarcığı oluşturulan emin olun. şeffaf tırnak cilası ile slayt mühür. Numuneler görüntüleme önce en az 10 dakika süreyle kurumasını bekleyin.

Görüntüleme için 5. Konfokal Ayarları

Not: E inverted mikroskop: Bu çalışmada sunulan Görüntüler Ti üzerine entegre edilmiş bir Nikon A1R konfokal ünitesi kullanılarak alınır. Bununla birlikte, 488 nm, 561 nm ve 642 nm ve 3 kanal tespit sisteminin dalga boyu bölgeleri mevcuttur 3 lazer birimlerinin en az bir konfokal mikroskop bu amaç için uygundur.

1. lazerler, dedektör ünitesi, cıva ampul, sahne denetleyici, mikroskop ve PC AÇIN. kontrol yazılımı başlatın ve sahne tutucu slayt sabitleyin.
2. görüntüleme hızlı seçin yapmak ve 20X objektif kullanarak örnek üzerinde ilgi alanları (ROI) tüm bölgelerinde işaretlemek için.
3. Dikkatle 60X yüksek büyütme objektif lens (60X Planı Apo VC / NA 1.4 YAĞ) için burun salıncak.
4. objektif lens üzerine daldırma petrol bir damla koyun ve bilgisayarda XYZ genel bakış penceresinden işaretli ROI birini seçin.
5. Aşağıdaki optik ayarlarını kullanarak görüntüleme başlayın: İlk Dikroyik Ayna seçin: 405/488/561/640. Emisyon filtresi kanal 1, kanal 3 uzun geçiş filtresi 650 nm ile kanal 2 ve 642 nm lazer 595/50 emisyon filtresi ile 561 nm lazer nm 525/50 ile 488 nm lazer seçin.
6. görüntü toplama başlamadan önce aşağıdaki tarama ayarlarını kullanın: Galvano tarayıcıyı seçin; Tarama yönü: tek yön; Tarama hızı: saniyede 0.5 kare.
7. Kanal boşaltma-through önlemek için Kanal seriyi seçin.
8. 1 havadar ünitesine pin-hole boyutunu ayarlayın. Tarama ve lazer gücü, algılama kazancını ayarlamak ve piksel doygunluk ve arka plan düzeyi önlemek için her kanal için uygun ofset.
9. ROI ve slayt hazırlıkları için tüm voksel boyutu 0.2 x 0.2 x 0.5 mikron ³ kullanılarak z-yığınları elde edin. Görüntüler Dekonvolüsyonun tabi tutulacaktır sonra 0.06 x 0.06 x 0.15 mikron ila ³ voksel boyutunu ayarlayın.
10. .nd2 dosya biçimi veya .ics formatında görüntü kaydetmek.

Çizgili içinde Çekirdeklerin Arasındaki Mesafe 6. HESAPLAMA60; En Yakın Komşu Analiz Yöntemi ile Kaslar

1. Bu analiz için, kasları görselleştirmek için DVAP antikorlar ile ve lamin antikorlar ve çekirdekleri vurgulamak için bir nükleer işaretleyici ile boyandı larva vücut duvarı kasları görüntüleyen konfokal görüntüleri kullanın.
2. Çekirdekleri arasındaki yakın mesafeyi tahmin etmek için, görüntü analiz yazılımı (örneğin, Imaris) ve MeasurementPro modülü içinde Ölçüm Noktaları kullanın. Görüntü analizi için diğer benzer yazılım uygulamaları aynı amaçlar için kullanılabilir.
3. konfokal görüntüleri açın. Yazılım simgesine çift tıklayın başlatmak için. Sürükle ve Arenaya konfokal z yığın görüntüleri bırakın.
4. Görüntülerde çift tıklayın otomatik olarak menü araç çubuğu simgesinin altında, Aşmak View bunları açmak için . Görünüm Alanı, Özellikler Alanı Listesi Nesne ve Nesne: Aşan Görünüm üç ana çalışma alanı panelleri vardır.
5. Bir ses görüntü render t oluşturmenü simgesini 3B Görünüm tıklayarak hree kanal görüntü .
6. Ekle Yeni Ölçüm Noktaları simgesini tıklayın itibaren Nesneler araç çubuğu ve Nesne Özellikleri Alanında görünen yaratma sihirbazı izleyin.
7. oluşturma sihirbazı ilk Düzen sekmesini seçin ve ardından Özgü Kanal. Nükleer işaretleyici veya çekirdekleri vurgulamak için lamin kanalı birini seçin.
8. klavyenizdeki Esc sekmesine basarak seçin moduna işaretçi olarak ayarlayın.
9. Görüntünün belirli bir çekirdeği içeren fare tekerleği ile 3D imleç kutusunun boyutunu ayarlayın. Aynı çekirdeği üzerinde Shift tuşunu ve sol fare tıklaması tutarak ölçüm noktası eklemek.
10. Önceki adımları yineleyerek aynı kası üzerindeki yakındaki bir çekirdeği üzerinde ikinci noktası ekleyin. Bir çizgi otomatik olarak iki nokta ile ölçülen mesafeye arasındaki çizilir iki çekirdek gösterilir. İki çekirdekleri arasındaki mesafe şimdi sekmesi İstatistik> Ayrıntılı> Uzaktan veri altında Nesne Özellikleri Area istatistiksel değişken olarak kaydedilir.
11. Belirli bir çekirdeğini çevreleyen tüm çekirdeklerin için 6.10 adımları 6.6 prosedürü tekrarlayın.
12. İstatistikler> tüm toplanan ölçüm noktaları görüntüleme Ayrıntılı> Mesafe verileri, en kısa mesafe belirleyebilirsiniz itibaren.
13. Dosya Sekme Ekranında İhracat İstatistikleri tıklayarak Nesne Özellikleri Alanı altında bulunan veriler bir tablo üzerinde kaydedilir.
14. çevredeki diğer çekirdeklerin ve genotip başına kas liflerinin seçilen bir dizi için aynı işlemi tekrarlayın.
15. Bir tablo dosyasına ihraç verileri kullanarak, aşağıdaki denklem kullanılarak kasların tüm M numarası için ortalama en kısa mesafeyi (D _ave) hesaplamak:
    OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/>
    Di i 0 ila N değişir ve N kas başına analiz çekirdeklerin sayısı, belirli bir çekirdeği i komşu çekirdeğe en kısa mesafedir. j değerlerin toplamıdır = 0 j = m analiz kasların M sayısını gösterir.
16. Alternatif olarak, kullanımı Noktalar Oluşturma sihirbazı ve Spotlar Spotlar yakın mesafe yakın komşu çekirdeğine ortalama mesafeyi tahmin etmek. Bu, bir Matlab uzatma modülü gereklidir.
    1. Arena ve 3D hacimli görüntü üzerinde belirli bir resme çift tıklayınız gör Alanında görüntülenir. Nesne Oluşturma simgesine tıklayın ve Yeni Noktalar ekleyin Nesneler araç çubuğundan.
    2. Nesne Özellikleri Bölgesindeki oluşturma sihirbazı itibaren seçeneği Atla Otomatik Oluşturma, Düzenleme Manuel tıklayın.
    3. Lamin veya çekirdekleri görüntülemek için nükleer işaretleyici kanal birini seçin.
    4. lef Shift ve tıklayınGörüntüdeki belirli bir kas bütün çekirdekler t fare düğmesi. Her çekirdeğin üzerine bir nokta belirir.
    5. Spotlar Spotlar Nesne Özellikleri Alan Araçlar sekmesinin altında listelenen en yakın mesafe seçin. Sonuç modu ve Matlab penceresinin altında seçin Noktalar İstatistik görünür.
    6. İstatistikler sekmesi altında, detaylı ve daha sonra özel Değerler seçin. Distmin tıklayın ve her çekirdeğin asgari mesafeler değerleri görünür.
    7. Bir tablo dosyasına veri ihracat ve kas başına bu mesafelerin ortalamasını hesaplar. Belirli bir genotip tüm kaslar için prosedürü tekrarlayın.

7. Drosophila Larva Vücut duvarı kasları içinde Çekirdeklerin Şekli belirlenmesi

1. Bu analiz için, lamin ve çekirdekleri görselleştirmek için bir nükleer işaretleyici ile boyandı vücut duvarı kasları konfokal görüntüleri kullanmak.
2. myonuclei, ölçü küresellik şeklini değerlendirmek (sur oranı olarak tanımlanmaktadırYüzey çekirdeğinin alan) ya da ellipticity (verilen çekirdekten aynı hacme sahip bir küre, yüzü alanı / basık uzun elipsoitlere ve parçacıklarının) arasında ayrım yapmaktadır.
3. daha önce açıklandığı gibi görüntüyü açın. Yeni Yüzeyler ekle Nesneler araç çubuğu simgesini tıklayın .
4. Nesne Özellikleri Alanı görünen oluşturma sihirbazı olarak, çekirdekleri görüntülemek için Kaynak Channel gibi nükleer işaretleyici boyama seçin.
5. eşik olarak seçenek Mutlak Yoğunluk ayarlayın. çekirdeklerin çoğu eşik eğrisinde değerini değiştirerek sorunsuz ve aşırı render gösterdiğinden emin olun. Aynı zamanda, aynı eğrisi kullanılarak bir çekirdeğe delik veya eksik maskenin varlığı önlemek.
6. Kullan Filtre aracı yüzey işleme herhangi bir gürültü dışlamak için. Yeni oluşturulan yüzey tabakasının, Split Düzen sekmesinde veya yanlış olduğunu yeniden çekirdekler yüzeyleri Birleştirmendered.
7. Bir e-tabloya İhracat İstatistikleri sekmesinin altında mevcut yüzey render çekirdeklerin elipsliği ve küresellik değerleri dosya.
8. Circularity (C) C tanımlandığı gibidir Alternatif olarak, çekirdek daireselliğe ölçmek için ImageJ ya da Fiji yazılımı kullanmak . sıfıra yaklaşan bir değer giderek uzatılmış şekli gösterir iken birinin değeri mükemmel bir daire temsil eder.
9. Menü Görüntüleri> Stacks> Z Projesi z yığınlarının maksimum yoğunluğu projeksiyonları oluşturun. Maksimum Şiddeti olarak ayarlayın projeksiyon tipi.
10. kanal bölünmüş ve nükleer işaretleyici kanalını seçin.
11. Ana menüde, Görüntü>> Eşik ayarlayın.
12. Segment yoğunluğu eşiği ayarlayarak çekirdekleri. Yakın çekirdekler tek bir birim olarak segmente ise,> Süreci Hakkında çekirdekleri kesmek İkili> Havza aracı tıklatın.
13. Ana menüden Düzenle> seçin SSeçim> seçim oluşturun.
14. > Araçlar> ROI Yöneticisi Analiz menüsünde tıklayarak ROI Yöneticisi seçilen tüm ROI ekleyin. ROI Manager penceresinde Ekle üzerine tıklayın. aynı pencere içinde fazla> bölme seçin.
15. Analiz> Set Ölçümler Shape Tanıtıcılar seçin. ROI Manager penceresinde sekmesini tıklayın Ölçün. Bu seçilen tüm çekirdeklerin dairesellik değerlerinin bir listesini görüntüler.
16. Buna ek olarak, nükleer hacmini ölçmek alt 7,3-7,7 açıklandığı gibi nükleer işaretleyici boyama kanalını kullanarak yüzey oluşturma sihirbazı takip etmek.

Belirli Protein intranüklear Yerelleştirme değerlendirin Drosophila Larvaların vücut duvarı kasları içinde Seçilmiş Çekirdeklerin 8. 3D ses Çizimler

1. Nükleer işaretleyici ile ve lamin ve DVAP için spesifik antikorlar ile boyandı vücut duvarı kasları raporlama konfokal görüntüleri kullanın.
2. yazılım ve sel başlatarak görüntüleri açınvb özel çekirdek analiz edilecek. Bu ana menü öğesi Düzen> Kırpma 3D seçerek yapılabilir.
3. fıkrasında 7,3-7,7 açıklandığı gibi lamin kanalını kullanarak yüzey oluşturma sihirbazını izleyin.
4. Yüzey oluşturulduktan sonra, Nesneler Özellikleri Bölgesindeki Düzenle üzerine tıklayın ve ardından çekirdeğinde sinyali izole etmek için tüm Maske seçin. Bu yeni bir pencere oluşturur.
5. Kanal Seç açılır menüden seçin DVAP sinyali. sıfıra Yüzey dışında seçenek Seti Voksellerden tıklayarak çekirdeğin içinde DVAP immün reaktivite sinyalini seçin. Yeni bir maskeli bir kanal oluşturulur ve seçimi için gösterge ayar penceresinde temin edilebilir.
6. çekirdeğin içinde sinyalin varlığını görselleştirmek ekle ikonuna Yeni Kırpma Plane tıklayarak bir kontur düzlemi oluşturmak Nesneler araç çubuğundan.
7. Etkileşimli kırpma açısını ayarlamakdüzlem ve çekirdeğin içinde sinyal dağılımını görselleştirmek için konumu.

Sonuçlar

ALS özellikle çizgili kaslar ⁷ ilerleyici ve ölümcül bir felç yol açan motor nöronların etkileyen dejeneratif bir hastalıktır. İnsan VAMP-ilişkili protein B (hVAPB) missense mutasyonlar ALS tip ^08-12 Ağustos olmak üzere motor nöron hastalıklarının bir dizi neden olur. HVAPB genindeki bir yanlış anlamlı bir mutasyon (V234I) en son insanlarda ¹³ tipik ALS bir olguda saptanmıştır. Patojenik potansiyeli değerlendirmek için, hastalığa neden olan bir mutasyon (DVAP-V260I) taşıyan hVAPB Drosophila ortolog DVAP ifade eden transgenik sinekler oluşturulur. Bu transgen ifadesi UAS / GAL4 sistemi ve kas-özel bir sürücü BG57-Gal4 ^14,15 kullanarak kas hedeflenmiştir. DVAP-V260I transgenik ekspresyonu etkisi karşılaştırılmıştır ve vahşi tip DVAP proteininin ¹⁶ farklı düzeylerde eksprese iki transgenlerin (DVAP-WT1 ve DVAP-WT2), bu tezat edilmiştir. More özellikle DVAP immünoreaktivitesinde artış DVAP-WT2 hattı için kontrollere göre daha yüksek 2,2 kat iken, aynı sinyalin ¹⁶ DVAP-V260I ve DVAP-WT1 sergi karşılaştırılabilir ve daha düşük seviyeleri.

Nükleer değişiklikler yaşlanma ve Parkinson hastalığı dahil olmak üzere çeşitli ^17,18 nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. ALS8 için sinek modeli nükleer mimarisi, konumu ve büyüklüğü değişiklikleri sergiler olmadığını değerlendirmek için, bir nükleer işareti ve nükleer zarf görselleştiren bir anti-lamin antikoru ^19-22, uygun genotiplerin çizgili kaslar içinde çekirdekleri boyandı. Kasları vurgulamak için bir DVAP özgü antikor aynı numune (Şekil 1) ilave edildi. Konfokal görüntüler toplandı ve ayrıntılı morfometrik analizleri bir görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapıldı. Kontrol kaslarda, çekirdekler eşit kas boyunca dağıtılmış bulunmuşturkas ifade DVAP-V260I ve DVAP-WT ise elyaf çekirdekler yakın ilişkili kümeleri (Şekil 1) dağıtmak için bir eğilim gösterirler.

Her genotip kas lifleri boyunca çekirdeklerin dağılımının kantitatif değerlendirmesini gerçekleştirmek için en yakın komşu analizi yapılmıştır. Bir yakın komşu analizi ilk verilen bir çekirdeğin merkezi ve diğer her çevreleyen çekirdeğin merkezi arasındaki mesafeyi ölçerek her çekirdeğe en yakın komşu tanımlar. Bu prosedür daha sonra kas lifi boyunca her çekirdekleri için tekrarlanır. Son olarak, belirli bir kas içinde çekirdekleri arasındaki en kısa mesafe, her çekirdek ve onun en yakın komşularının kısa mesafelerde ortalaması alınarak hesaplanır. (Şekil 2A - C). kontrol ile karşılaştırıldığında, DVAP-V260I transgeni ya da vahşi-tip protein aşırı ifade transgenlerin herhangi birini ifade eden kaslarıBunun sonucu olarak, çekirdekler yakın kümeler halinde ilişkili gibi görünmektedir, çekirdek arasındaki ortalama en kısa mesafe belirgin bir azalma bu vb. Alel DVAP-V260I neden ALS etkisi güçlü DVAP-WT2 transgen (Şekil 1 ve Şekil 2D) kullanılmış olsa bile, doğal tipte proteinin aşırı ekspresyonu ile ilişkili daha fazla şiddetlidir.

DVAP-V260I ya DVAP-WT, ya transgenlerin aşırı ifadesi aynı zamanda, uzatılmış bir yapı (Şekil 1) deforme çekirdeklerde elde nükleer mimari ciddi bir bozulma gösterir. Bu yapısal sapmaları dairesellik formül Cı tarafından tanımlandığı ImageJ yazılımı kullanılarak nicelleştirilmiştir C = 1 mükemmel bir daire temsil ve C = 0 sonsuz uzun çokgen her çekirdeğin uzunluğu oranı genişliğini ölçmek hangi. Contr içindeTransgenik mutantlar döngüsellik kaybı ile sonuçlanan şeklinde bir değişiklik, bu değere (Şekil 1 ve Şekil 3) önemli bir sapma neden olurken farklı bir yuvarlak sergileyen ol çekirdekleri, C 1'e eşittir.

Ayrıca ALS neden alel DVAP-WT transgenlerin (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında, bu bir fenotipi uyarmak için daha etkili olduğu görülmektedir, ancak, aynı transgenlerin sentezlenmesi kaslarda, çekirdekler, kontroller ile karşılaştırıldığında belirgin bir büyütülmüş çekirdek hacmi gösterdikleri bulundu.

Hemen hemen tüm nörodejeneratif hastalıklar, patojenik proteini içeren agregaların hücre birikimi ile karakterize edilir. Bu 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve çekirdek hacmi kaplamalar yapılmış ve kas mutan transgen eksprese eden ya da vahşi-tip protein aşırı ifade olarak DVAP immüno-reaktivite kümeleri meydana getirdiği görülmüştürnd bazıları da çekirdeklerinde (Şekil 5) içine lokalize olduğunu. Bunun aksine, kontrol NMJs olarak DVAP immüno-reaktivite zayıf kas lifi boyunca dağıtılır ve nükleus ¹⁶ hariç tutulmuştur.

. Şekil 1: DVAP-wt ya da DVAP-260I transgenlerin eksprese çizgili kaslar olan myonuclei Konfokal görüntüler (A) BG57-Gal4 / + kontrol, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 ve (D) BG57; belirtilen transgenlerin ifade DVAP-WT2 kasları DVAP (kırmızı sinyal), lamin (yeşil sinyal) için spesifik ve çekirdekleri (mavi sinyali) görselleştirmek için bir nükleer özel işaretleyici ile antikorlar ile boyandı. Ölçek çubuğu = 30 mikron bir görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şekil 2: En yakın komşu analizi çekirdeği ve tek en yakın komşusu arasındaki ortalama mesafeyi belirlemek için (B) DVAP-WT2 transgeni aşın ifade eden kaslarda değişmiş nükleer konumlandırma gösteren Temsilcisi sonuçları (A) kontrol grubu ile karşılaştırıldığında.. Belirtilen genotiplerinin kaslarda ortalama çekirdek mesafe (C) 'de formül kullanılarak tahmin edilmiştir ve veri (D)' de rapor edilmiştir. Larvaların NMJs DVAP (kırmızı sinyal) lamin (yeşil) için özel antikorlar ile nükleer işaretleyici (mavi sinyali) ile boyanır. Yıldız istatistiksel olarak anlamlı belirtir. *** P <0.001, ** p <0.01. İstatistiksel Bu deney analizi ve tek yönlü ANOVA testi aşağıda bildirilen tüm deneyler kullanıldı ve bir Tukey MULTIP içingenotipler arasındaki farklar ANOVA testi ile anlamlı bulunmuştur zaman le karşılaştırma testi post-hoc test olarak uygulanmıştır. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 30 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Nükleer hacminin hesaplanmasında temsilcisi adımları gösteren Görüntüler (A) yüzey oluşturma sihirbazı kullanılarak segmente çekirdekleri gösteren bir temsili resim. Görüntülerin sınırında Çekirdekleri göz ardı edildi. Çevredeki DVAP boyama sonrası nükleer DVAP sinyali gösteren (B) Görüntü nükleer işaretleyici kanalda oluşturulan yüzey kullanarak maskelenmiş edilmiştir. (C) yüzey tabakası ilave parametrelerin bilgi sağlarNükleer hacim ve küresellik dahil. Çeşitli genotiplerin nükleer birimde (D) Veri. Yıldız istatistiksel olarak anlamlı belirtir. Dissected NMJs önleyici DVAP antikorları (kırmızı sinyal), anti-lamin antikorlar (yeşil sinyali) ve nükleer işaretleyici (mavi sinyali) ile boyanmıştır. *** P <0.001, ** p <0.01. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 30 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Görüntüler ImageJ nükleer şekil tahmininde temsilcisi adımları gösteren.    görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyon kaslar içinde çekirdeklerin daireselliğe tahmin etmek ImageJ kullanılarak analiz edildi. (A) yoğunluk projeksiyonu temsili bir örneği,protokolün adım 7.9 olarak üç kanal resmin. Kanallar bölünmüş olduğu protokol ve nükleer işaretleyici kanalının adım 7.10 gösteren (B) Görüntü seçilir. ImageJ segmente çekirdekler ve ROI yöneticisi eklentisi yoğunluğu eşik uyguladıktan sonra, tüm ilgi çekici çekirdekleri seçilebilir ve şekil Şekil tanımlayıcıları ile ölçülen gösteren (C) bir temsilci görüntü (7.117.15 adımlar). Çeşitli genotiplerinin döngüsellik (D) miktarının belirlenmesi. Yeşil çekirdekleri özetliyor ve lamin boyanma tekabül ederken larva NMJs üzerinde, kırmızı sinyal DVAP boyama gösterir. Her çekirdeğin iç yüzünden nükleer işaretleyici ile lekelenmeye karşı mavi etiketli. Yıldız istatistiksel olarak anlamlı belirtir. *** P <0.001, ** p <0.01. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu = 30 mikron onu tıklayınızE bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 5: myonuclei hacmi kaplamalar oluşturulmasında belirli adımları gösteren görüntüler. 3D yoğunluğunu gösteren (A) Görüntü DVAP protein (kırmızı), lamin (yeşil) ve DNA markeri (mavi) ile boyandı kasların görünümü harmanlanmış. (B) segmentine çekirdekleri lamin kanalı kullanılarak oluşturulan bir yüzey tabakası temsil Görüntü. (C) yüzey tabakası seçilen çekirdeğin dışında DVAP sinyalini maskelemek için kullanılan edildiği bir çekirdek temsil Görüntü. sarı renkle vurgulanmış görüntüye eklenmiş bir kırpma uçağı. görünüm ve pozisyon açısını etkileşimli çekirdeğinde sinyallerin dağılımını görselleştirmek için ayarlanabilir. (D), nükleer yüzey tabakası oluşturulur USI enine kesit bir görünümü rapor bir resimng lamin kanalı maskesiz DVAP ve nükleer işaretleyici sinyalleri ile birleşti. (E ve F) aynı çekirdeğin ek kesitli hacmi render. Ölçek çubuğu = 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Geçmişte, içinde ve deney grupları arasında morfolojik farklılıklar nadiren dikkate alınmıştır. Ancak, nicel yöntemlerin uygulanması artık morfolojisi ve anatomik formları matematiksel tanımı karşılaştırmalı çalışmalar norm hesaplanır haline gelmektedir. kantitatif kullanımı belirli hücresel süreçleri üzerinde genetik manipülasyon etkilerini değerlendirirken analizleri, morfolojik değişiklikleri saptamak için kabiliyetinin artırılması ve bu değişiklikler açıklanan hangi ile doğruluğunu artıran umut tutun. Ayrıca, nicel verilerin istatistiksel analizi bize fenotipleri arasında gözlenen farklılıkların anlamlı olup olmadığını değerlendirmek için izin verir.

çizgili kaslarda, çekirdeklerin ayrı bir yuvarlak yapı sergiler ve eşit kas lifi boyunca dağıtılır. kurulması ve boyut, şekil ve çekirdeklerin mimarisini koruyarak moleküler mekanizmalar bilinmemekle birlikte, bu nükleer özellikler muhtemel t vardıro kas fonksiyonunu kontrol edilmesinde temel bir rol oynar. Nitekim, birkaç Miyopatiler kasların içinde çekirdeklerin morfoloji ve konumunu düzenleyen genlerdeki mutasyonların neden olur. şekil ve bir hücre içinde çekirdeklerin dağılım fonksiyonel önemi kas ile sınırlı değildir. Giderek artan kanıtlar, nükleer kusurlar da Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların ^18,24 ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu morfoloji, boyut ve endoplazmik retikulum ve fonksiyonel sonuçlar doğurabilir mitokondri dahil olmak üzere diğer organellerin hücre içi dağıtımını takdir başlıyor. Örneğin, mitokondriyal morfolojisi değişiklikler gibi optik atrofi tip-1 (OPA1) ve Charcot-Marie-Tooth tip 2A nöropati ²⁵ gibi nörolojik bozukluklar ile ilişkili.

Bu önemli süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların sürecinde yardımcı olmak için, biz yüksek çözünürlüklü konfokal birleştirmek için teklifgörüntüleme yazılımı ve morfometrik veri nicel genetik manipülasyonlar kas liflerinin içinde çekirdeklerin şekil, boyut ve konumunu nasıl etkileyebileceğini değerlendirmek için analiz eder. Drosophila larvaları nöromüsküler sistemin son derece basmakalıp doğa ile güç ve birlikte Drosophila genetiği çok yönlülüğü Larvaların NMJ analizler bu tür için özellikle uygun bir deneysel model olun. Larva NMJs, fenotipik analizi NMJs bir sayıda aynı sinek içinde incelenebilir ve hatta aynı tanımlanabilir NMJ farklı genotipler ^3,4 sinekler arasında karşılaştırılabilir doğru bir morfometrik sağlayan tek bir sinaps çözünürlükte gerçekleştirilebilir.

Drosophila larva NMJ nükleer pozisyon, şekil ve boyut Fenotipik karakterizasyon kaslarının içinde kasları ve çekirdekler vurgulamak antikorlar ile disseke NMJs immün gerçekleştirerek başlar. Protokolde Thi özetlenenödevi, myonuclei bütün kas leke DVAP özel çekirdek iç ve sahip antikorlar vurgulama nükleer işaretleyici ile, lamin, çekirdek zarfına bir göstergesi karşı poliklonal antikorlar ile lekelendi. Bu deneylerde kullanılan lamin antikorlar nazik Paul Fisher ^19-22 temin edilmiştir, ancak anti-lamin antikorların alternatif kaynaklar kullanılabilir. Buna ek olarak, çekirdek zarfı için özel diğer antikorlar bir takım ticari olarak temin edilebilir. kasları, anti-aktin ya da anti-tubulin antikor ile boyanarak görünür olabilir süre Son olarak, DAPI ve propidyum iyodür nükleer belirteçler de mevcuttur. Bu deneysel prosedürde kullanılan dışındaki antikorlar kullanılırsa, immün protokol sabitleme koşulları ve yeni antikorlar için çalışan konsantrasyonları optimize edilmesi gerekecektir ekstra-adımlar gerektirir. hacim render analiz edilmesi gerekir, özellikle bu protokol, bir kritik adım, the slaytta numunelerin montajı. Bu durumda, slayt ve örnekler ezilmiş değildir, böylece lamel arasında aralayıcılar dahil etmek çok önemlidir. lamel her iki sürgünün sarılı selüloz bandı üç bant ara parçalar yapmak için kolay bir yol göstermektedir.

ImageJ 2D görüntüleri için kullanılan iken, 3D çok kanallı görüntü çoğu bu makalede sunulan analizleri, çünkü onun içi durumu Imaris kullanılarak yapılmıştır. Bununla birlikte, herhangi bir diğer benzer ticari yazılım paketi bu uygulamalar için de kullanılabilir.

Konfokal görüntüleri analiz için kullanılabilir (örneğin, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME ve diğerleri için) birçok açık kaynak ve ticari yazılım platformları bulunmaktadır. ImageJ ^26, Fiji ²⁷ olarak bilinen NIH ya da daha gelişmiş versiyonu ücretsiz yazılım, dünya çapında görüntüleme haberleşme için kullanılabilir ithalat filtreleri, makro ve eklentileri çok sayıda varty. Bu eklentileri çoğu bir dilim-dilim yan şekilde bilgi işlem odaklandık. Çok kanallı 3D görüntülerin görüntülenmesi ve analiz için uygun eklentiler vardır. Ancak, genellikle belirli bir görev için tasarlanmış ve kullanıcıların kendi ihtiyaçlarına bu eklentileri uzatmak veya uyarlamak gerekebilir. Öte yandan, ticari platformlar nispeten deneyimsiz kullanıcıları hedef ve genellikle inanılmaz bir hızla görüntü işleme görevleri kolaylığı kullanımı, geniş kapsama odaklandık.

Bu protokolde belirtilen nicel fenotipik analizi ile birlikte deneysel prosedür, organel morfolojisi ve hücre içindeki dağılımını kontrol moleküler mekanizmaların yardımcı olabilir. Ancak, bu yaklaşım, belirli bir uç noktada bu süreçleri analiz bariz bir sınırlama vardır. morfoloji ve organellerin dağılımı kontrol süreci çok dinamik olması ve sadece farklı hücre ty arasında değişmektedir muhtemelengelişimsel ya da fizyolojik durumuna bağlı olarak aynı hücre içinde pes değil, aynı zamanda. Bu analizin bir başka uygulama organel morfolojisi ve pozisyon değişiklikleri zamanla izlenecek izin zaman atlamalı görüntüleme ile temsil edilecektir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm	Fine Science Tools	11030-12
Sylgard dissection plates	SIGMA-ALDRICH	76103	Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 °C for at least 24 hr
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection scissors (ultra-fine)	Fine Science Tools	15200-00
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7			NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1)			Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton			Triton-X100. SIGMA-T8787
Normal Goat Serum	SIGMA	G9023
Guinea Pig anti-DVAP antibody			Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Rabbit anti-Lamin antibody			Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
TO-PRO-3	Molecular Probes	T3605
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated	Jackson ImmunoResearch	bs-295G-A555-BSS	Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated	Jackson ImmunoResearch	bs-0358G-Cy3-BSS	Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Vectashield mounting medium for fluorescence	Vector laboratories	H-1000