JoVE Logo

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Özet

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Giriş

Metastaz solid tümörlerin yol açtığı ölümlerin% 90'ından sorumludur. Kemik çeşitli kanser türleri, özellikle meme ve prostat kanserlerinin metastazları en sık etkilediği organdır. klinikte teşhis edildiğinde, kemik metastazları genellikle zaten sık sık nörolojik semptomlar eşlik kemikte osteolitik veya osteoblastik ya değişiklikler ile ileri aşamalarında girdiniz.

Önceki çalışmalar ağırlıklı olarak ancak şu anda osteolitik sürecinin başlangıcından önce kemiklerinde mikrometastazlar anlayışı sınırlı, açık osteolitik kemik metastazları 1-3 üzerinde duruldu. Bu durum, uygun deneysel model ve yaklaşımların eksikliği en azından kısmen. Göğüs kanseri genetik mühendisliği fare modelleri genellikle akciğer metastaz, ama daha az verimli bir şekilde kemik 4. Aynı şekilde, orthotopically nakledilen tümörler nadiren bazı kemik tropikal 4T1 meme kanserleri, spontan kemik metastazları geliştirmekbir alt-klonlar MSP istisnalar 5-7 olarak PyMT transjenik fare modeli aşırı. Intra-tibia sondaj kemiğe 8-10 kanser hücrelerini sunabilirsiniz, ama aynı zamanda yerel dokulara zarar ve iltihap doğurur. Şu anda, meme kanseri hücre çizgilerinin intrakardiyak enjeksiyonu kemik kolonizasyon 11-13 araştırmak için önemli bir yaklaşım olmuştur. kanser hücreleri sol ventrikül içine tanıtıldı Ancak, sonra sadece sınırlı oranda nihayet zor ölçülebilir şekilde mikroskobik metastazlar izlemek için yapım, kemik ve kemik iliği ulaşacaktır.

Bu çalışmada, selektif bir şekilde, yerel dokulara zarar vermeden kemik ve kemik iliği kanser hücrelerini zenginleştirmek, arka bacak dokulara kanser hücrelerini sunmak için bir teknik, yani içi ilyak arter (IIA) enjeksiyonu 14 oluşturmaktadır. Çünkü kemik özgüllük, bu yaklaşım aynı zamanda, sonunda bir önceki kolonize tembel kanser hücrelerinin yeterli zaman tanırimals diğer hayati organlarda primer tümör veya metastaz yenik. Böyle biyoparlaklık görüntüleme, immünofloresan boyama ve kemik histomophimetri gibi diğer teknikler, çeşitli ile kombine edildiğinde, IIA enjeksiyon özellikle çok hücreye tek kanser hücrelerinden ilerlemesini izlemek için, kemik metastazı ile ilgili araştırma amaçlı geniş bir kapsam için potansiyel olarak yararlı olan mikrometastazlar. Özellikle, IIA enjeksiyon kanser hücreleri ve kemik mikro-hücreleri çevreleyen çeşitli arasındaki etkileşimi görselleştirmek sağlıyor gösterdi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Baylor College of Medicine hayvan bakımı kurallarına uygun olarak yapıldı.

1. Hücre Hazırlanması

Not: değişik kanser hücresi çizgileri IIA enjeksiyon araştırma amaçlı bağlı olarak kullanılabilir. Meme kanseri hücre çizgileri kullandık MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 ve araştırma prostat kanseri hücre dizisi C4-2. Biz genellikle bizim çalışma için GFP- ve ateşböceği lusiferaz etiketli kanser hücrelerini, hem kullanımı ve GFP-Lusiferaz etiketli MCF7 hücre hattından burada bazı verileri göstermektedir.

  1. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de,% 10 FBS ve 0.1 mg / ml penisilin-streptomisin içeren DMEM içinde hücreleri korumak.
  2. % 0.25 tripsin / EDTA çözeltisi ile% 90 birleştiği - IIA enjeksiyondan önce, 80 Hücreleri tripsinize edin. Hücre sayımı için 10 mi, PBS içinde hücreleri hücreleri iki kez yıkama ve yeniden askıya almak için soğuk PBS kullanın. 5 dakika boyunca 800 x g'de PBS santrifüj hücreleri çıkarmak için.
  3. hücrelerin yeniden askıyabuz soğukluğunda PBS içerisinde 5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir.
  4. 100 ul GFP- ve bir fare IIA enjeksiyon için ateş böceği lusiferaz etiketli kanser hücrelerini kullanarak.
    Not:. Bu nedenle, her bir hayvan tarafından alınan hücre sayısı 5 x 10 5 sayı ise hücre çizgilerinin saldırganlık dayalı değiştirilmesi gerekebilir.
  5. Buz üzerinde hücre süspansiyonları tutun.
    Not: Titreşimler bu enjeksiyon için hazır olana kadar her birkaç dakikada hücre toplanmasını önlemek için gerekli olabilir. (Örneğin, MDA-MB-231 gibi), bazı hücre hatları için, (örneğin, 45 mikron hücre süzgecinden geçen) daha sıkı prosedürler, toplanmayı önlemek için gerekli olabilir. gemilerin takunya doku nekrozuna neden olabileceğini unutmayın ve bu nedenle deneyler karıştırıcı edin.

2. Hayvan hazırlanması

  1. Hayvan ağrı tedavisi için, hiçbir az 24 saat ameliyat öncesi farelere besin takviyesi ile 5 mg / kg / gün Devletlerde köpekler (ya da diğer analjezik) vermek. yönetmekameliyat öncesi 0.1 mg / ml buprenorfin deri altından 60 dakikalık bir doz. Not: İsteğe bağlı prosedür ekstra östradiol sağlamak için hayvanların arkasına östradiol palet aşılamaktır. Bu ER + kanser hücrelerinin büyümesine (örneğin, MCF-7 hücreleri) 9 hızlandıracaktır.
  2. intraperitonal enjeksiyon ile - (100 mg / kg 80) ve ksilazin (10 -12.5 mg / ml) Ketamin ile 6 haftalık fare (yaklaşık 20 gr) - 4 anestezisi.
  3. Ayak tutam tarafından 20 g fare ve solunum hızı% 50 azalma gözlem sedasyon uygun düzeyde onaylamak ve mukozaları pembe (örneğin, fare kulak cilt ve pençe cilt). Ameliyat sırasında bu hayati belirtileri her 15 dk izleme tutun. Not: hayvan Hiçbir hareket hayvan cerrahisi için yeterli anestezi ve hazır olduğunu gösterir.
  4. kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
  5. Alt karın özellikle sağ kasık bölgesinde fare Tıraş nerede ameliyat ve enjeksiyon olacakmeydana gelmek.
    Not: atimik çıplak fareleri kullanılmıştır, bu gerekli değildir.
  6. , Sırtında fare koymak doğal pozisyonlarında bacakları yaymak ve bant ile mobil diseksiyon karton ayak sopa.
  7. % 70 izopropil etanol ıslatılmış steril pamuklu sağ kasık alanını silin, betadin cerrahi fırçalayın ile birkaç kez izledi.

3. Ortak İliak Ven ve Arter Konum ve Ayırma

  1. Uzun 4. ve bir No. 3 sap düzenlenen steril, 10. karbonlu çelik neşter bıçakları kullanarak sağ alt karında 5. meme arasında 1.2 cm - 1,0 bir cilt kesi olun. Sonra kesi dışında hayvan vücudu kapsayacak şekilde steril cerrahi örtü kullanın.
  2. Standart tezgah üstü diseksiyon mikroskobu hayvan taşımak. Enjeksiyon için 4X büyütme kullanın.
  3. Diseksiyon mikroskobu 4X büyütme altında, yağ dokusu ve peritoneu arasındaki künt ayırma forseps eklemekm ve iliak damarları ve sinirleri (Şekil 1) açığa her iki tarafta dışa doğru dokuları itin.
    Not: orta hattan aort ve arter dallarının alt kısmı arasındaki arter iliyak arter denir. Enjeksiyon gerçekleşir yerdir.
  4. yakın gemilere, damarları ve sinir arasındaki (bir zar gibi) bağ dokusu kırmaya düz ince forseps bir çift kullanın.
  5. sol el düz ince forseps geçin. sağ elini kullanan açılı ince forseps bir çift tut. bağ dokusu kırılmış olan aynı pozisyona sağ forseps yerleştirin. Ve sonra gemilerin altında, içinden sağ forseps sopa.
  6. Aynı zamanda, geçiyor sağ forseps rehberlik damarların sol tarafındaki bağ dokusu içine sol el forseps yerleştirin.
  7. Sağ forseps gemilerin altında alır sonra, çevredeki ti gelen gemiler ayırmak için deneyinbiraz daha ssue ve ardından sağ el forseps üstünde tutmak.
  8. sağ forseps bir 4-0 ipek sütür ucu sunmak için sol forseps kullanın ve sonra gemiler altından yoluyla nazikçe ve yavaşça dikiş çekin. Not: Şimdi hem ortak ven ve arter damarları sütür tarafından kaldırılır (Şekil 2).

4. Enjeksiyon ve Post-enjeksiyon Bakımı

  1. 31 G insülin şırınga enjekte hücreleri hazırlayın. enjeksiyon başına PBS içinde hücre süspansiyonu 100 ul kullanın. aşağı enjekte edilen hücrelerin yapışmasına neden olabilir ve kan akışını bloke olmayacak şekilde hücreleri ayırmak ve toplanmasını önlemek için birkaç kez pipet ve emin olun.
  2. sol elinde açılı forseps ile, forseps yavaşça düzenlenen damarları olan sütür rehberliğinde boyunca gemilerin altında forseps koymak ve sonra forseps iki kolu açın.
    Not: forseps iki kolu arasında aralık i olacaknjection sitesi.
  3. enjeksiyona hazır, yukarı iğne konik ile sağ elinde 100 ul hücre süspansiyonları ile 31 G iğne tutun.
  4. arter lümenine iğne takın (kan iğne ucu girecek). Sonra hücreler enjekte etmek yavaşça hücre süspansiyonu itin. Hücre süspansiyonu kapta kırmızı kanı itecektir. damarları kırmak ya da hücre süspansiyonu sızmasına çalışın.
  5. Enjeksiyon tamamlandığında, nazikçe iğneyi geri çekin ve kanamayı durdurmak için sol forseps gemiler tutan tutun. Sonra dikiş uzak çekin.
  6. sol el forseps çekmeye ve hızlı bir şekilde kanamayı durdurmak için arter kesi alanı basın bir pamuklu bir bez kullanın.
    Not: Genellikle 5-10 dk sürekli basınç kanamayı durdurmak için yeterlidir.
  7. Zaman kanama durur, cerrahi bölgede cilt kenarlarını kapatmak için cilt yapıştırıcı kullanın. bir kulak-etiketi olun ve enjekte edilen hücrelerin dağılımını incelemek için sinyal biyolüminesans kontrol edin.
    Not: Başarılı bir enjeksiyon Şekil 3'e benzer bir görüntü neden olur.
    1. 75 mg / içi orbital sinüs yoluyla kg fare konsantrasyonda PBS / ml luciferase 100 ul 15 mg enjeksiyon biyoışıldama sinyali kontrol edin.
      1. intra-yörünge enjeksiyon için, fare gözün her iki tarafta parmaklarını koymak göz top biraz, göz çerçevesinden dışarı pop göz top ve burun arasındaki 28 G insülin şırınga iğneleri yerleştirin ve sonra yavaş yavaş luciferase enjekte şırınga itmek yapmak için basınç kullanmayın .
        Not: Doğru pozisyonda, iğne 2 derinliğe ulaşmak mümkün olmalıdır - sert doku (kemik) isabet önce 3 mm.
      2. 10, in vivo bütün hayvan görüntüleme için görüntüleme sistemi içine fare yerleştirin - 5 dakika içinde 60 sn (bakınız Şekil 3).
        Not: İsteğe bağlı prosedür ekstra östradiol sağlamak için hayvanların arkasına östradiol pelet aşılamaktır. Bu ER + kanser hücrelerinin büyümesini (örn MCF-7 hızlandıracakhücre) 15.
  8. o uyanana kadar sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde fare bırakın. , Ameliyat sonrası dönemde açılma ve ağrı belirtileri, kanama Monitör şişme. Ağrı bulgusu kadar ağrı tedavisi için verilen analjezik kapsama (carprofin besin takviyesi önerilir) ile kafesine geri fareler koyun. ameliyatı takiben 7 gün boyunca hayvanlara yakın ilgi ve özeni gösteriniz.

5. İzleme Metastatik Büyüme

  1. histomorofmetrisi: Büyüme plakası
    1. Kemik dokularını taşıyan Hasat tümörü, daha sonra, 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde kemik tamir pH 3 7.0% 14 EDTA çözeltisi bunları kirecini - 5 gün ve daha önce gömme 14 tarif parafin tabi tutabilir.
    2. Bölüm parafin-embed kemik 3 mikron kalınlığında dokular ve daha önce 14 açıklandığı gibi Hematoksilen / Eosin boyama standart histolojik yöntemi gerçekleştirmek.
  2. Immunohistochemisdeneyin:
    1. Konu parafine gömülü tümör taşıyan kemik önce 14 tarif edildiği gibi, çeşitli amaçlar için boyama imünohistokimya için kayar. Kısaca, sırası ile, anti-Osterix antikorları ve anti-alkalin fosfataz (ALP) antikorlar ile anti-GFP antikorları ve immunostain osteojenik hücre düşen (osteoblast ve osteoblastlar), MCF7 kanser hücrelerinin immunostain.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 anatomik konumu ve iliyak arter (kırmızı) ve ven (mavi) ilişkiyi göstermektedir.

Şekil 2 diseksiyon mikroskobu altında iliak damarlar ve sinirlerin göreli konumunu göstermektedir. Şekil 2A gösterildiği gibi, damarlar ve sinirlerin periton duvarına altında doğru ve cilt kesi yapılır ve periton itti sonra ortaya çıkabilmektedir. iliyak ven solda ve ar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sadece iliyak arter kanser hücrelerinin enjeksiyon hedef olmasına rağmen, biz çevre dokulara hem iliak ven ve arter ayrılmasını tavsiye ve bir paket olarak birlikte bunları kaldırmak için. damar ve arter yoğun birbirleriyle temas için bu ve venöz damar duvarı ince ve kırmak için kolaydır. kanser hücreleri sadece artere enjekte edilir, ancak bu nedenle, başarılı bir enjeksiyon için, bu zaman ve birlikte iki gemi tutmak için çaba kaydeder. Şekil 2'de gösterildiği gibi bir 4-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Research in Zhang lab was supported by X. H.-F. Z.'s NCI CA151293, CA183878, Breast Cancer Research Foundation, U.S. Department of Defense DAMD W81XWH-13-1-0195, a Pilot Award of CA149196-04, McNair Medical Institute and by H.W.'s U.S. Department of Defense DAMD W81XWH-13-1-0296.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
DMEMHyCloneSH30022.01
FBSGibco16000
Pen/Strep Amphatericin BLonza Biowhittaker17-745E
PBSLonza Biowhittaker17-516F
Trypsin/EDTA solutionHyCloneSH30042.01
45 μM cell strainerVWR International Laboratory195-2545
MediGel CPF with carprofen Controlled item from veterinary care in BCMFor pain management
Buprenorphine Controlled item from veterinary care in BCMFor pain management
Estradiol pelletInnovative Research of AmericaSE-121
Ketamine and xylazineControlled item from veterinary care in BCM
Vet ointmentControlled item from veterinary care in BCMAvoid eye dryness
ShaverOster78005-050For furred mice
Isopropyl ethanolACROS67-63-0
Betadine surgical scrubControlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel bladesTed Pella, Inc549-3CS-10Multiple
No. 3 handleTed Pella, Inc541-31Need to be autoclaved
Sterile surgical drapeSai Infusion TechnologyPSS-SD1
Straight forceps Roboz Surgical InstrumentRS-5132Need to be autoclaved
Straight fine forcepsFine Science Tools11253-20Need to be autoclaved
Edged fine forcepsFine Science Tools11253-25Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk sutureJohnson & Johnson Health CareJ214H
31 G insuline syringesBD328418Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)VWR International Laboratory89031-272
Skin glueHenry Schein Animal Health31477For surgery site skin closure
Ear Tag ApplicatorFine Science Tools24220-00
Ear tagsFine Science Tools24220-50
D-luciferinGold BiotechnologyLUCKAvoid light and put on ice
28 G insulin syringesBD329410For intra-orbital injection
ParaformadehydeAlfa Aesar30525-89-4For tissue fixation
EDTAOmniPur4050For bone tissue decalficication
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Dissection microscopeLeicaLeica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging systemAdvanced Molecular Vision
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)Clontech632381
Anti-ALP antibodiesAbcamab108337
Anti-Osterix antibodiesAbcamab22552

Referanslar

  1. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).
  2. Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors. Cancer cell. 20 (6), 701-714 (2011).
  3. Ell, B., Kang, Y. SnapShot: Bone Metastasis. Cell. 151 (3), 690-690 (2012).
  4. Kretschmann, K. L., Welm, A. L. Mouse models of breast cancer metastasis to bone. Cancer Metastasis Rev. 31 (3-4), 579-583 (2012).
  5. Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17 (2), 163-170 (1999).
  6. Rose, A. A., et al. Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone. Mol Cancer Res. 5 (10), 1001-1014 (2007).
  7. Welm, A. L., et al. The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7570-7575 (2007).
  8. Li, X., et al. Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lessions. Mol. Cancer. Res. 10 (4), 494-503 (2012).
  9. Gregory, L. S., Choi, W., Burke, L., Clements, J. A. Breast Cancer Cells Induce Osteolytic Bone Lesions In vivo through a Reduction in Osteoblast Activity in Mice. PLoS ON. 8 (9), e68103(2013).
  10. Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nat Med. 21 (11), 1262-1271 (2015).
  11. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Vet Pathol. 52 (5), 827-841 (2015).
  12. Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51 (4), 868-881 (2014).
  13. Xiang, J., et al. CXCR4 Protein Epitope Mimetic Antagonist, POL5551, Disrupts Metastasis and Enhances Chemotherapy Effect in Triple Negative Breast Cancer. Mol Cancer Ther. 14 (11), 2473-2485 (2015).
  14. Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
  15. Hoffmann, J., et al. Characterization of new estrogen receptor destabilizing compounds: effects on estrogen-sensitive and tamoxifen-resistant breast cancer. J Natl Cancer Inst. 96 (3), 210-218 (2004).
  16. Tannehill-Gregg, S. H., Levine, A. L., Nadella, M. V., Iguchi, H., Rosol, T. J. The effect of zoledronic acid and osteoprotegerin on growth of human lung cancer in the tibias of nude mice. Clin Exp Metastasis. 23 (1), 19-31 (2006).
  17. Slyfield, C. R., Tkachenko, E. V., Wilson, D. L., Hernandez, C. J. Three-Dimensional Dynamic Bone Histomorphometry. J Bone Miner Res. 27 (2), 486-495 (2012).
  18. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. Am J Pathol. 182 (2), 319-324 (2013).
  19. Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
  20. Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Cancer ResearchSay 115Meme kanserikemik metastazYayg n t m r h creleriMikroskopik metastazIntra iliyak arter enjeksiyonuMetastaz modelleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır