Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Özet

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Özet

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

Giriş

Metastaz solid tümörlerin yol açtığı ölümlerin% 90'ından sorumludur. Kemik çeşitli kanser türleri, özellikle meme ve prostat kanserlerinin metastazları en sık etkilediği organdır. klinikte teşhis edildiğinde, kemik metastazları genellikle zaten sık sık nörolojik semptomlar eşlik kemikte osteolitik veya osteoblastik ya değişiklikler ile ileri aşamalarında girdiniz.

Önceki çalışmalar ağırlıklı olarak ancak şu anda osteolitik sürecinin başlangıcından önce kemiklerinde mikrometastazlar anlayışı sınırlı, açık osteolitik kemik metastazları ^1-3 üzerinde duruldu. Bu durum, uygun deneysel model ve yaklaşımların eksikliği en azından kısmen. Göğüs kanseri genetik mühendisliği fare modelleri genellikle akciğer metastaz, ama daha az verimli bir şekilde kemik ^4. Aynı şekilde, orthotopically nakledilen tümörler nadiren bazı kemik tropikal 4T1 meme kanserleri, spontan kemik metastazları geliştirmekbir alt-klonlar MSP istisnalar ^5-7 olarak PyMT transjenik fare modeli aşırı. Intra-tibia sondaj kemiğe ^8-10 kanser hücrelerini sunabilirsiniz, ama aynı zamanda yerel dokulara zarar ve iltihap doğurur. Şu anda, meme kanseri hücre çizgilerinin intrakardiyak enjeksiyonu kemik kolonizasyon ^11-13 araştırmak için önemli bir yaklaşım olmuştur. kanser hücreleri sol ventrikül içine tanıtıldı Ancak, sonra sadece sınırlı oranda nihayet zor ölçülebilir şekilde mikroskobik metastazlar izlemek için yapım, kemik ve kemik iliği ulaşacaktır.

Bu çalışmada, selektif bir şekilde, yerel dokulara zarar vermeden kemik ve kemik iliği kanser hücrelerini zenginleştirmek, arka bacak dokulara kanser hücrelerini sunmak için bir teknik, yani içi ilyak arter (IIA) enjeksiyonu ¹⁴ oluşturmaktadır. Çünkü kemik özgüllük, bu yaklaşım aynı zamanda, sonunda bir önceki kolonize tembel kanser hücrelerinin yeterli zaman tanırimals diğer hayati organlarda primer tümör veya metastaz yenik. Böyle biyoparlaklık görüntüleme, immünofloresan boyama ve kemik histomophimetri gibi diğer teknikler, çeşitli ile kombine edildiğinde, IIA enjeksiyon özellikle çok hücreye tek kanser hücrelerinden ilerlemesini izlemek için, kemik metastazı ile ilgili araştırma amaçlı geniş bir kapsam için potansiyel olarak yararlı olan mikrometastazlar. Özellikle, IIA enjeksiyon kanser hücreleri ve kemik mikro-hücreleri çevreleyen çeşitli arasındaki etkileşimi görselleştirmek sağlıyor gösterdi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Baylor College of Medicine hayvan bakımı kurallarına uygun olarak yapıldı.

1. Hücre Hazırlanması

Not: değişik kanser hücresi çizgileri IIA enjeksiyon araştırma amaçlı bağlı olarak kullanılabilir. Meme kanseri hücre çizgileri kullandık MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 ve araştırma prostat kanseri hücre dizisi C4-2. Biz genellikle bizim çalışma için GFP- ve ateşböceği lusiferaz etiketli kanser hücrelerini, hem kullanımı ve GFP-Lusiferaz etiketli MCF7 hücre hattından burada bazı verileri göstermektedir.

1. % 5 _CO2 içinde 37 ° C'de,% 10 FBS ve 0.1 mg / ml penisilin-streptomisin içeren DMEM içinde hücreleri korumak.
2. % 0.25 tripsin / EDTA çözeltisi ile% 90 birleştiği - IIA enjeksiyondan önce, 80 Hücreleri tripsinize edin. Hücre sayımı için 10 mi, PBS içinde hücreleri hücreleri iki kez yıkama ve yeniden askıya almak için soğuk PBS kullanın. 5 dakika boyunca 800 x g'de PBS santrifüj hücreleri çıkarmak için.
3. hücrelerin yeniden askıyabuz soğukluğunda PBS içerisinde 5 x 10 ⁶ hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir.
4. 100 ul GFP- ve bir fare IIA enjeksiyon için ateş böceği lusiferaz etiketli kanser hücrelerini kullanarak.
   Not:. Bu nedenle, her bir hayvan tarafından alınan hücre sayısı 5 x 10 ⁵ sayı ise hücre çizgilerinin saldırganlık dayalı değiştirilmesi gerekebilir.
5. Buz üzerinde hücre süspansiyonları tutun.
   Not: Titreşimler bu enjeksiyon için hazır olana kadar her birkaç dakikada hücre toplanmasını önlemek için gerekli olabilir. (Örneğin, MDA-MB-231 gibi), bazı hücre hatları için, (örneğin, 45 mikron hücre süzgecinden geçen) daha sıkı prosedürler, toplanmayı önlemek için gerekli olabilir. gemilerin takunya doku nekrozuna neden olabileceğini unutmayın ve bu nedenle deneyler karıştırıcı edin.

2. Hayvan hazırlanması

1. Hayvan ağrı tedavisi için, hiçbir az 24 saat ameliyat öncesi farelere besin takviyesi ile 5 mg / kg / gün Devletlerde köpekler (ya da diğer analjezik) vermek. yönetmekameliyat öncesi 0.1 mg / ml buprenorfin deri altından 60 dakikalık bir doz. Not: İsteğe bağlı prosedür ekstra östradiol sağlamak için hayvanların arkasına östradiol palet aşılamaktır. Bu ER + kanser hücrelerinin büyümesine (örneğin, MCF-7 hücreleri) ⁹ hızlandıracaktır.
2. intraperitonal enjeksiyon ile - (100 mg / kg 80) ve ksilazin (10 -12.5 mg / ml) Ketamin ile 6 haftalık fare (yaklaşık 20 gr) - 4 anestezisi.
3. Ayak tutam tarafından 20 g fare ve solunum hızı% 50 azalma gözlem sedasyon uygun düzeyde onaylamak ve mukozaları pembe (örneğin, fare kulak cilt ve pençe cilt). Ameliyat sırasında bu hayati belirtileri her 15 dk izleme tutun. Not: hayvan Hiçbir hareket hayvan cerrahisi için yeterli anestezi ve hazır olduğunu gösterir.
4. kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın.
5. Alt karın özellikle sağ kasık bölgesinde fare Tıraş nerede ameliyat ve enjeksiyon olacakmeydana gelmek.
   Not: atimik çıplak fareleri kullanılmıştır, bu gerekli değildir.
6. , Sırtında fare koymak doğal pozisyonlarında bacakları yaymak ve bant ile mobil diseksiyon karton ayak sopa.
7. % 70 izopropil etanol ıslatılmış steril pamuklu sağ kasık alanını silin, betadin cerrahi fırçalayın ile birkaç kez izledi.

3. Ortak İliak Ven ve Arter Konum ve Ayırma

1. Uzun ^4. ve bir No. 3 sap düzenlenen steril, 10. karbonlu çelik neşter bıçakları kullanarak sağ alt karında ^5. meme arasında 1.2 cm - 1,0 bir cilt kesi olun. Sonra kesi dışında hayvan vücudu kapsayacak şekilde steril cerrahi örtü kullanın.
2. Standart tezgah üstü diseksiyon mikroskobu hayvan taşımak. Enjeksiyon için 4X büyütme kullanın.
3. Diseksiyon mikroskobu 4X büyütme altında, yağ dokusu ve peritoneu arasındaki künt ayırma forseps eklemekm ve iliak damarları ve sinirleri (Şekil 1) açığa her iki tarafta dışa doğru dokuları itin.
   Not: orta hattan aort ve arter dallarının alt kısmı arasındaki arter iliyak arter denir. Enjeksiyon gerçekleşir yerdir.
4. yakın gemilere, damarları ve sinir arasındaki (bir zar gibi) bağ dokusu kırmaya düz ince forseps bir çift kullanın.
5. sol el düz ince forseps geçin. sağ elini kullanan açılı ince forseps bir çift tut. bağ dokusu kırılmış olan aynı pozisyona sağ forseps yerleştirin. Ve sonra gemilerin altında, içinden sağ forseps sopa.
6. Aynı zamanda, geçiyor sağ forseps rehberlik damarların sol tarafındaki bağ dokusu içine sol el forseps yerleştirin.
7. Sağ forseps gemilerin altında alır sonra, çevredeki ti gelen gemiler ayırmak için deneyinbiraz daha ssue ve ardından sağ el forseps üstünde tutmak.
8. sağ forseps bir 4-0 ipek sütür ucu sunmak için sol forseps kullanın ve sonra gemiler altından yoluyla nazikçe ve yavaşça dikiş çekin. Not: Şimdi hem ortak ven ve arter damarları sütür tarafından kaldırılır (Şekil 2).

4. Enjeksiyon ve Post-enjeksiyon Bakımı

1. 31 G insülin şırınga enjekte hücreleri hazırlayın. enjeksiyon başına PBS içinde hücre süspansiyonu 100 ul kullanın. aşağı enjekte edilen hücrelerin yapışmasına neden olabilir ve kan akışını bloke olmayacak şekilde hücreleri ayırmak ve toplanmasını önlemek için birkaç kez pipet ve emin olun.
2. sol elinde açılı forseps ile, forseps yavaşça düzenlenen damarları olan sütür rehberliğinde boyunca gemilerin altında forseps koymak ve sonra forseps iki kolu açın.
   Not: forseps iki kolu arasında aralık i olacaknjection sitesi.
3. enjeksiyona hazır, yukarı iğne konik ile sağ elinde 100 ul hücre süspansiyonları ile 31 G iğne tutun.
4. arter lümenine iğne takın (kan iğne ucu girecek). Sonra hücreler enjekte etmek yavaşça hücre süspansiyonu itin. Hücre süspansiyonu kapta kırmızı kanı itecektir. damarları kırmak ya da hücre süspansiyonu sızmasına çalışın.
5. Enjeksiyon tamamlandığında, nazikçe iğneyi geri çekin ve kanamayı durdurmak için sol forseps gemiler tutan tutun. Sonra dikiş uzak çekin.
6. sol el forseps çekmeye ve hızlı bir şekilde kanamayı durdurmak için arter kesi alanı basın bir pamuklu bir bez kullanın.
   Not: Genellikle 5-10 dk sürekli basınç kanamayı durdurmak için yeterlidir.
7. Zaman kanama durur, cerrahi bölgede cilt kenarlarını kapatmak için cilt yapıştırıcı kullanın. bir kulak-etiketi olun ve enjekte edilen hücrelerin dağılımını incelemek için sinyal biyolüminesans kontrol edin.
   Not: Başarılı bir enjeksiyon Şekil 3'e benzer bir görüntü neden olur.
   1. 75 mg / içi orbital sinüs yoluyla kg fare konsantrasyonda PBS / ml luciferase 100 ul 15 mg enjeksiyon biyoışıldama sinyali kontrol edin.
      1. intra-yörünge enjeksiyon için, fare gözün her iki tarafta parmaklarını koymak göz top biraz, göz çerçevesinden dışarı pop göz top ve burun arasındaki 28 G insülin şırınga iğneleri yerleştirin ve sonra yavaş yavaş luciferase enjekte şırınga itmek yapmak için basınç kullanmayın .
         Not: Doğru pozisyonda, iğne 2 derinliğe ulaşmak mümkün olmalıdır - sert doku (kemik) isabet önce 3 mm.
      2. 10, in vivo bütün hayvan görüntüleme için görüntüleme sistemi içine fare yerleştirin - 5 dakika içinde 60 sn (bakınız Şekil 3).
         Not: İsteğe bağlı prosedür ekstra östradiol sağlamak için hayvanların arkasına östradiol pelet aşılamaktır. Bu ER + kanser hücrelerinin büyümesini (örn MCF-7 hızlandıracakhücre) ^15.
8. o uyanana kadar sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde fare bırakın. , Ameliyat sonrası dönemde açılma ve ağrı belirtileri, kanama Monitör şişme. Ağrı bulgusu kadar ağrı tedavisi için verilen analjezik kapsama (carprofin besin takviyesi önerilir) ile kafesine geri fareler koyun. ameliyatı takiben 7 gün boyunca hayvanlara yakın ilgi ve özeni gösteriniz.

5. İzleme Metastatik Büyüme

1. histomorofmetrisi: Büyüme plakası
   1. Kemik dokularını taşıyan Hasat tümörü, daha sonra, 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde kemik tamir pH 3 7.0% 14 EDTA çözeltisi bunları kirecini - 5 gün ve daha önce gömme ¹⁴ tarif parafin tabi tutabilir.
   2. Bölüm parafin-embed kemik 3 mikron kalınlığında dokular ve daha önce ¹⁴ açıklandığı gibi Hematoksilen / Eosin boyama standart histolojik yöntemi gerçekleştirmek.
2. Immunohistochemisdeneyin:
   1. Konu parafine gömülü tümör taşıyan kemik önce ¹⁴ tarif edildiği gibi, çeşitli amaçlar için boyama imünohistokimya için kayar. Kısaca, sırası ile, anti-Osterix antikorları ve anti-alkalin fosfataz (ALP) antikorlar ile anti-GFP antikorları ve immunostain osteojenik hücre düşen (osteoblast ve osteoblastlar), MCF7 kanser hücrelerinin immunostain.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 anatomik konumu ve iliyak arter (kırmızı) ve ven (mavi) ilişkiyi göstermektedir.

Şekil 2 diseksiyon mikroskobu altında iliak damarlar ve sinirlerin göreli konumunu göstermektedir. Şekil 2A gösterildiği gibi, damarlar ve sinirlerin periton duvarına altında doğru ve cilt kesi yapılır ve periton itti sonra ortaya çıkabilmektedir. iliyak ven solda ve ar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sadece iliyak arter kanser hücrelerinin enjeksiyon hedef olmasına rağmen, biz çevre dokulara hem iliak ven ve arter ayrılmasını tavsiye ve bir paket olarak birlikte bunları kaldırmak için. damar ve arter yoğun birbirleriyle temas için bu ve venöz damar duvarı ince ve kırmak için kolaydır. kanser hücreleri sadece artere enjekte edilir, ancak bu nedenle, başarılı bir enjeksiyon için, bu zaman ve birlikte iki gemi tutmak için çaba kaydeder. Şekil 2'de gösterildiği gibi bir 4-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA solution	HyClone	SH30042.01
45 μM cell strainer	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF with carprofen	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Buprenorphine	Controlled item from veterinary care in BCM		For pain management
Estradiol pellet	Innovative Research of America	SE-121
Ketamine and xylazine	Controlled item from veterinary care in BCM
Vet ointment	Controlled item from veterinary care in BCM		Avoid eye dryness
Shaver	Oster	78005-050	For furred mice
Isopropyl ethanol	ACROS	67-63-0
Betadine surgical scrub	Controlled item from veterinary care in BCM
#10 scalpel blades	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Multiple
No. 3 handle	Ted Pella, Inc	541-31	Need to be autoclaved
Sterile surgical drape	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Straight forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5132	Need to be autoclaved
Straight fine forceps	Fine Science Tools	11253-20	Need to be autoclaved
Edged fine forceps	Fine Science Tools	11253-25	Need to be autoclaved
4-0 Vicryl silk suture	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 G insuline syringes	BD	328418	Multiple
Q-tips cotton swabs (Sterile)	VWR International Laboratory	89031-272
Skin glue	Henry Schein Animal Health	31477	For surgery site skin closure
Ear Tag Applicator	Fine Science Tools	24220-00
Ear tags	Fine Science Tools	24220-50
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK	Avoid light and put on ice
28 G insulin syringes	BD	329410	For intra-orbital injection
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	For tissue fixation
EDTA	OmniPur	4050	For bone tissue decalficication
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dissection microscope	Leica	Leica S6E stereo
IVIS Lumina II imaging system	Advanced Molecular Vision
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Anti-GFP antibodies (JL-8)	Clontech	632381
Anti-ALP antibodies	Abcam	ab108337
Anti-Osterix antibodies	Abcam	ab22552