Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Özet

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Özet

yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ile optik süper çözünürlüklü görüntüleme kimyasal ve biyomedikal bilimlerde moleküler düzeyde süreçlerin görselleştirme için önemli bir teknolojidir. Ticari SIM sistemleri mevcut olmakla birlikte, özel ticaret sistemler daha iyi performans laboratuvar tasarlanmış sistemler, ikincisi genellikle görüntüleme sadakat ve hız açısından hem de kullanım ve genel amaçlı uygulamalar kolaylığı için tasarlanmıştır. Bu makale toplam iç yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanır ve 100 nm ulaşan bir çözünürlükte üç renk 10 Hz kadar az görüntüleme yeteneğine sahip bir SIM sistemi inşa etmek derinlemesine bir rehber sunuyor. Nedeniyle SIM ve TIRF kombinasyonu, sistem rakip teknolojilere daha iyi görüntü kontrast sağlar. Bu özelliklere ulaşmak için, birkaç optik elemanlar mevcut tüm uyarma wav için aydınlatma ışık polarizasyon durumu ve mekansal yapısı üzerinde otomatik denetimini etkinleştirmek için kullanılırelengths. Donanım uygulanması ve denetimi tüm ayrıntılar maksimum kazanım kare hızını elde bir vurgu ile uyarma ışık deseni üretimi, dalga boyu, polarizasyon devlet ve kamera kontrolü arasındaki senkronizasyon sağlamak için verilmiştir. Sistem hizalama ve kalibrasyon için bir adım-adım protokolü sunulmuştur ve ulaşılabilir çözünürlük iyileştirme ideal bir test örnekleri üzerinde doğrulanmıştır. video oranı süper çözünürlüklü görüntüleme için yeteneği canlı hücreler ile gösterilmiştir.

Giriş

son yarım on yıl içinde, süper çözünürlük mikroskopi olgunlaştı ve biyolog eline uzman optik laboratuarları taşındı. Ticari mikroskop çözümleri optik süper çözünürlük elde etmek için üç ana varyantlar için mevcuttur: tek bir molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM), emisyon tükenmesi mikroskobu (STED) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ^1,2 uyarılmış. SMLM photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi kolayca aşağı 20 nm, büyük ölçüde optik kurulum kolaylığı ve yüksek uzaysal çözünürlüğü vaadi, en popüler teknik olmuştur. Tek molekül yerelleştirme yoluyla Ancak süper çözünürlük mikroskopi içsel ticaret-off ile birlikte gelir: uzaysal çözünürlük ulaşılabilir dolayısıyla zamansal çözünürlüğe sınırlayan, bireysel florofor lokalizasyonu yeterli sayıda biriktirme bağlıdır. Görüntüleme dinamik bir süreçtirbir yeterli de görüntüyü yeniden oluşturmak için bu süre yeterli yerelleştirme olayları elde edilirken hareket eserler önlemek için faiz yapısının hareketini örnek gerektiği gibi canlı hücrelerde es nedenle sorunlu olur. Bu gereksinimleri karşılamak amacıyla, canlı hücre SMLM gösteriler büyük ölçüde uyarma gücünü artırarak fluorofor photoswitching oranlarında gerekli artış almış ve bu sayede örnek yaşam sürelerini ve biyolojik alaka ³ sınırlayıcı, fototoksisite ve oksidatif strese sırayla açar.

SIM ve SMLM hem üzerinde STED'in net bir avantajı yaklaşık 60 nm örnek yanal çözünürlük için kalın numunelerde süper çözünürlük, görüntü 120 mikron ⁴ derinliğe kadar Organotipik beyin dilimleri elde edildi olmasıdır. SMLM veya SIM tek objektif uygulamaları ile bu tür derinliklerde görüntüleme olanaksız olduğunu, ancak tek-molekül ışık levha veya kafes ışık levha mikrofon ile ya mümkün olurfloroskop ^5. Şimdiye kadar bu bakış ⁶ küçük alanları görüntüleme sınırlı olmasına rağmen video oranı STED da göstermiştir ve sinaptik vezikül hareketliliğini eşleştirmek için kullanılır olmuştur.

Hücre biyolojisi ve moleküler kendinden montaj reaksiyonlarında ⁷ uygulamalar için ^- belirli bir floresan Fotofiziksel özelliklerine bağlı değildir gibi birçok kez puan üzerinden yüksek zamansal çözünürlüğe sahip görüntüleme gerektiren ^12, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SİM) çok uygundur olabilir prob. SIM bu doğal avantajına rağmen, şu ana kadar kullanımı ağırlıklı olarak sabit hücreler veya yavaş hareket eden süreçleri görüntüleme sınırlı olmuştur. Bu piyasada mevcut SIM sistemleri sınırlamaları nedeniyle: Bu enstrümanların alım kare hızı gerekli sinüs aydınlatma modelleri yanı sıra optik muhafaza kutuplaşmayı üretmek için kullanılan ızgaralar dönme hızı ile sınırlı kalmıştır. Ticari SIM yeni nesilaraçlar hızlı görüntüleme yeteneğine sahip ama onlar merkezi görüntüleme tesislerine ama tüm pahalıya bulunmaktadır.

Bu protokol canlı hücrelerin bazal yüzeyindeki ince örneklerinde ve yakın hızlı süreçleri görüntüleme için esnek bir SIM sisteminin inşası için bir rehber sunuyor. Bu büyük ölçüde odak background sinyalinin out azaltır numune ¹³ içine hiçbir derin, 150, yaklaşık nm'den nüfuz bir aydınlatma deseni oluşturmak için toplam iç yansıma floresan (TIRF) kullanmaktadır. TIRF ile SIM birleştirerek fikri SIM kendisi ¹⁴ olarak neredeyse eski ama 2006 ¹⁵ önce deneysel olarak fark değildi. 2009 yılında tubulin ve kinesin görselleştirmek için 11 Hz ¹⁶ ulaşmada kare hızları bildirildi TIRF-SIM ile elde edilen in vivo ilk görüntüler dinamikleri ve iki renkli TIRF-SIM sistemleri ^17,18 sunulmuştur. En son olarak, bir tek renk iki ışınlı bir SIM s yapımı ve kullanımı için bir kılavuzistem 18'e kadar Hz ^19,20 çerçeve oranlarını içeren sunuldu.

Burada sunulan kurulum TIRF-SIM çalıştırılabilir ikisi üç renk, 20 Hz SIM süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneğine sahiptir. Tüm sistem ters bir mikroskop çerçeve etrafında inşa ve bir piezo-çalıştırılan z sahne ile bir motorlu xy çeviri aşamasında kullanır. TIRF-SIM için gerekli sinüs uyarma desenleri oluşturmak için, sunulan sistem ferroelektrik uzaysal ışık modülatörü (SLM) kullanır. İkili ızgara desenler SLM görüntülenir ve ortaya çıkan ± 1 kırınım emirleri, süzülmüş geçirilen ve objektif lens TIR halka içine duruldu. Gerekli faz kaymaları ve ızgaralar rotasyonlar görüntülenen SLM görüntüyü değiştirerek uygulanır. Bu protokol, inşa etmek ve böyle bir uyarım yolu hizalamak açıklamaktadır emisyon yolunun uyum ayrıntıları ve optimum uyum sağlamak için test örnekleri sunuyor. Ayrıca de polarizasyon kontrolü ve bileşenlerinin senkronizasyonu ile ilgili sorunları ve yüksek hızlı TIRF-SIM özel zorluklar scribes.

Tasarım Hususlar ve Kısıtlamalar

Bu protokol sunulan TIRF-SIM sistemi monte etmeden önce, optik bileşenlerin seçimini belirleyen dikkate çeşitli tasarım kısıtlamaları vardır. Optik bileşenlerin tüm kısaltmalar Şekil 1'e bakınız.

Mekansal Işık Modülatör (SLM)

bu alt-milisaniye desen anahtarlama yeteneğine sahip olarak bir ikili ferroelektrik SLM Bu kurulum kullanılır. Gri Ölçeği nematik SLM'ler kullanılabilir ancak bu geçiş zamanlarını büyük ölçüde teklif azalttı. veya piksel kapalı her bir ikili fazda SLM periyodik ızgara deseni o ızgara bir faz difraksiyonu olarak çalışacaktır SLM görüntülenen nedenle eğer olay düzlem wavefront ofset ya π ya da 0 faz vermek olacaktır.

ent "> Toplam İç Yansıma (TIR)

TIR elde etmek ve genliği azalan bir alan üretmek için, cam numunesi arayüzü uyarma kirişlerin gelme açısı önemli açıdan daha büyük olmalıdır . Bu fani aydınlatma desen gerekli minimum olay açısı ve dolayısıyla aynı zamanda maksimum boşluk veya dönem, ayarlar. Maksimum olay açısı (Kabul açısı) tanımı hesaplanabilir objektif merceğinin sayısal açıklık (NA) ile sınırlıdır . Bu Abbe formülüne göre elde aralığı, minimum kalıp belirler NA ve dalga boyunu bağlayan minimum desen aralığına . Pratikte, 1.49 NA yağ daldırma TIRF amacı yaklaşık 79 ° insidansı ve 488 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu kullanılarak 164 nm örnek en az model süresinin maksimum açı elde edilir. Bu iki açı gösterge TIR aydınlatma (yani. TIR halka) ve burada iki uyarım odakları doğru konumlandırılmalıdır elde ve her bir aydınlatma desen oluşturmak için döndürülür, üzerinde amacı arka açıklığı bir halka tanımlar.

TIRF-SIM görüntülerin İmar deseni dönme başına üç faz kaymaları minimum satın alınması dolayısıyla SLM desen süresi 3 ile bölünebilir olmalıdır gerektirir (Şekil 1). Örneğin, 488 nm aydınlatma 9 piksel ve 640 nm aydınlatma için 12 piksel bir dönem. makaslanmış ızgaralar kullanılarak aralık desenin alt piksel optimizasyonu dahil SLM desen tasarım kapsamlı bir tartışma içinSLM dalga boyudur gelen, tüm dalga boyları için TIR halkasının içinde olmalıdır ± 1 siparişlerin ancak sapma açısını iki uyarım odaklarının KNER ve ark., ¹⁶ ve Lu-Walther ve ark., ²⁰ pozisyonun önceki iş görmek bağımlı. Standart SİM için çok renkli görüntüleme uzun dalga boyu için ızgara periyoduna optimize edilmesi ve daha kısa kanallar için bir performans kaybına tolere ile elde edilebilir. TIRF-SIM için, ancak, bir dalga boyu için optimize Diğer dalga boyu odakları artık TIR halka içinde olduğu anlamına gelir. odakları arka diyafram ve TIR halka içinde çapının% 95 altındadır Örneğin, 9 piksel ızgara periyoduna kullanılarak 488 Nm TIRF sağlamak için yeterli olmakla birlikte, 640 nm, bu dönem dışında odak konumu olacaktır açıklık. Bu nedenle, farklı piksel paterni aralıkları, her uyarım dalga boyu için kullanılmalıdır.

TIRF-SIM uyarma yolu hizalamaSon derece mikroskop gövdesinde (Şekil 1 'de DM4) dikroik aynanın pozisyonda küçük değişikliklere karşı duyarlı, çok daha çok geleneksel SİM bulunmaktadır. Dönen filtre küp taret kullanımı yerine kullanılan uyarma dalga boyları için özel bir sabit bir pozisyonda tutulur ve tasarlanmış bir tek, çok bantlı dikroik ayna kullanın, tavsiye edilmez. Sadece yüksek kalitede dikroik aynalar kullanılır esastır. Bunlar en az 3 mm kalınlığında substratlar gerektirir ve genellikle üreticiler tarafından "görüntüleme düz" olarak nitelendirilmektedir. Diğer tüm yüzeyler TIRF-SIM dayanılmaz sapması ve görüntü bozulmasına yol açar.

Polarizasyon Kontrol

TIRF-SIM ulaşmak için o optik eksene göre objektif öğrenci düzleminde azimut polarize kalacak şekilde aydınlatma deseni ile eşzamanlılık içinde uyarma ışık polarizasyon durumunu döndürmek için gerekli (yani. s-polarize). Polarizasyon kontrol optik hizalama motorlu bir dönme platformu ^22, örneğin, kullanılan spesifik optik eleman üzerinde Pockel hücre ²¹ ya da bir yarım dalga plakası bağlıdır. Bu protokolde özel bir sıvı kristal değişken geciktirici (LCVR), kullanılan dalga boyu aralığında tam dalga (2π) geciktirici sağlamak için tasarlanmıştır 488 hızlı (~ msn) anahtarlama izin verdiği nm 640. sıvı kristal geciktirici kullanılıyorsa bir yüksek kaliteli bileşeni kullanmak esastır: standart bileşenler genellikle yol açar kamera maruz kalma süresi uzunluğu boyunca sabit bir geciktirici vermek için yeteri kadar sabit değildir, bir aydınlatma desen ve düşük modülasyon kontrast dışarı bulanıklık . Sıvı kristal geciktiriciler da güçlü sıcaklığa bağlıdır ve sıcaklık kontrolü inşa gerektirir.

senkronizasyon

lazerler SLM ile senkronize olması gerekir. İkili ferroelektrik SLM'ler dahili s tarafından dengelenirdevlete ve devlet dışı bir arasındaki büyüleyici. piksel sadece ya onların ya da devlet dışı değil interframe anahtarlama süre içinde yarım dalga plakaları hareket ederler. Bu nedenle lazerler nedeniyle sadece piksel ara durumuna desen aksine bir azalma engellemek için SLM sinyal Enable LED üzerinden açma / kapama durumlarında devreye sokulmalıdır. lazerler dijital şekilde modüle edilmiş olamaz bir akusto-optik modülatör (AOM) alternatif olarak bir hızlı çekim olarak kullanılabilir.

Lensler seçimi

Bu kısıtlamaları dayanarak, örnek düzlemde üzerine SLM uçağın gerekli demagnification istenen aydınlatma modelleri tespit edilebilir üretmek. Bu görüntü röle teleskop ve uyarma kondenser mercek L5 iki lensler L3 ve L4 odak uzunlukları hesaplanmasını sağlar. Bu sistemde bir 100X / 1.49NA yağ daldırma objektif lens 488 nm ve 640 nm uyarma ile kullanıldığında, bu nedenle 300 ve 140 mm odak uzunlukları kullanırL4 ve L3 ve örnek düzlemde 38 nm'lik bir SLM piksel büyüklüğüne eşittir 357X toplam demagnification vererek L5 için 300 mm, için. lenslerin bu arada kullanarak, SLM sırasıyla 70 ° ve 67 ° lik açılarda karşılık, 488 nm aydınlatma ve örnek 172 ve 229 nm desen aralıklarını vermek nm 640 için 12 piksel 9 dönemleri ızgara. Cam suyu arabirimi için, kritik açı Bu nedenle, bu iki desen aralıkları, her iki dalga boyları için TIRF uyarma izin 61 °, ve dalga boyu bağımsızdır. 37 ° C üzerinde ya da, eğer, bir düzeltme yaka ile donatılmış bir objektif lens lamel kalınlığı varyasyonları getirdiği küresel sapmaları düzeltilmesi için yararlıdır.

görüntü İmar

Ham SIM veri elde edildikten sonra bu iki aşamalı bir süreç içinde süper çözülmesi görüntüler oluşturmak için hesaplamalı çaba meselesidir. İlk olarak, aydınlatma patern belirlenmelidirHer görüntü ve ikinci SIM spektrumunun bileşenleri ayrılmalıdır ve etkili OTF desteği (-parçalar Şekil 6) çift olarak uygun recombined.

süper çözülmesi frekans bileşenleri örtüşen bileşenlerin kalıntı parçalarının neden olduğu eserler önlemek için karışmamış kadar doğru mümkün olması olarak öngörülen aydınlatma desen kesin bilgi, her şeyden önemlidir. Biz aydınlatma desen her biri için bulunacak olan Gustafsson ve ark. Kısacası ^23, normalize iki boyutlu sinüzoid açıklar aydınlatma parametreleri bir dizi ile getirilen prosedür izlenerek ham görüntü verilerinden bir posteriori parametreleri belirlemek uyarma desenleri :

Bu vesile ile ve saçak kontrast ve sırasıyla her görüntü m cafeye desen açıklar. dalga vektörü bileşenleri, ve Sadece farklı yönlerde ile değiştirmek desen ve tenekenin aksi sabit olduğu kabul. kaba üst üste optimize etmek için çapraz korele görüntü birine altpiksel vardiya uygulayarak rafine ham görüntü spektrumları bir çapraz korelasyon yapılır dalga vektörü, bileşenlerini belirlemek. Bu gerçek uzay faz geçişlerini çoğalması ile yapılır Bu fre bir altpiksel kaymasını teşvikfrekans-alan. gerçek model tahmini önce dalga vektörlerin iyi bir tahmin olması yararlıdır ve bu bir floresan boncuk tabakası görüntüleme bulunabilir unutmayın.

kaymıştır desenleri arasındaki faz adım olarak Yani. Frekans bileşenlerinin ayrılması "Faz ekseni" birlikte bir Fourier Dönüşümü ile gerçekleştirilebilir. küresel faz ve saçak kontrast Daha sonra, farklı bileşenlerin karmaşık bir doğrusal regresyon kullanılarak belirlenebilir. Bireysel ayrılmış bileşenler daha sonra genel bir Wiener filtresi kullanılarak birleştirilir. genelleştirilmiş Wiener filtrenin her iki parametre çıkarma ve uygulama ayrıntılı bir açıklama için biz Gustafsson okuyucu bakınve ark., ^23, aynı algoritma kullanılır.

Protokol

1. düzenlenmesi ve Uyarma Yolu hizalama

1. Optik masaya bileşenlerin konumlarını işaretleyin (optik kurulum genel bir bakış için bakınız Şekil 1). hedefi ayırın, objektifler L3, L4, L5 ve SLM SLM yüzey hedefi odak düzlemi üzerine geçirilen olacak şekilde kendi odak uzunlukları toplamı her.
2. mikroskop karesinin filtre küp taret içine çok kenarlı dikroik ayna dm4 yerleştirin.
3. mount 1 "kare kinetik aynaya ikinci dikroik ayna DM3 takın ve bir odak uzaklığı uzak kondenser mercek L5 onu getirin.
   Not: Bu uyarım yolu tasarımı iki özdeş dikroik aynı üretim partisinden alınır DM3 ve DM4 özdeş optik özellikleri sağlamak için aynalar içermektedir. s- ve p- eksenleri mikroskobu (DM3) bulunan dikroik kıyasla açık olduğunu dikroik ayna (DM4) ve böylece herhangi bir iptal gibi konumlandırılmışpolarizasyon elipsliği kendi çift kırılma tarafından tanıtıldı (Şekil 1). Bu tazminat, her aydınlatma dalga boyu için eşit derecede iyi çalışır. Bu aşama, yüksek modülasyon kontrast sağlamak için gereklidir.
4. uyarma yoluna her türlü merceği takmadan önce, doğru sistem için optik eksen tanımlar.
   1. kulesinden objektif lens (OB) çıkartın ve bir hizalama aracı vida yerine. Bu her iki uçta iki hizalama diskler ile 500 mm uzunluğunda bir optik kafes sisteminden oluşur.
   2. iki hizalama diskler deliklerden merkezinden Lazer 1 bir paralel referans ışını yönlendirmek için dikroik ayna DM3 ve SLM yaklaşık sonraki bir konumda yerleştirilmiş geçici bir hizalama ayna kullanın. Üç aynalar ve dikroik ayna dm2 kullanılarak Şekil 1'de gösterildiği gibi geçici ayna Lazer 1'den ışını doğrudan. SLM pozisyonunda geçici ayna optik eksene dik yakın olmalıdır.
      Not: Kullanım Lazer 1 referans kiriş olarak, uyarma yolu tamamladıktan sonra diğer lazerler sonradan hizalanmış edilebilir.
   3. o mikroskopi vücuda girmeden önce kaba optik eksen determined.Insert ışın yoluna bir iris olmuştur kez hizalama aracı kaldırmak ve kiriş üzerinde ortalamak. iris.Reinsert objektif lens (OB) merkezli küçük bir deliği olan, beyaz bir marka kartı takın.
      hedefi bırakarak ışın şimdi çok farklı olacak, ama beyaz kartta görünür olacak lensin arka yüzeyinden çok zayıf bir yansıması olacaktır: Not. Tüm lensler, bu kaplanmış anti yansıtma bile, koaksiyel hizalamayı sağlamak için kullanılabilir, zayıf arka yansımaları olacaktır. kiriş tam objektif dik ise, arka yansıma iris merkezi aracılığıyla geri döner
   4. (SLM konumunda DM3 ve hizalama ayna) iteratif açısal iki ayna ayarlamalar yapmak geri yansıma merkeziGelen ışın ile kart. Geçici objektif lens (OB) kaldırmak ve bir referans noktası oluşturmak için tavana lazer nokta işaretleyin.
   5. Tablonun dişli deliklere boyunca referans kiriş yükseklikte süsen bir çift takın. ışınlı optik tablo yüzeyine paralel olmalıdır. optik eksen şimdi tanımlanır.
5. kondenser mercek (L5) uzak objektif kabaca bir odak uzunluğunu takın. Referans ışınının yönünde çevirmek için bir doğrusal çeviri sahne sette bu lensi monte edin.
6. hedefi terk ışın collimated ve tavana referans nokta vurur şekilde yoğunlaştırıcı mercek konumunu ve açısını ayarlayın. Lens tekrar iris ve beyaz kart ile geri yansıma kontrol ederek kirişe dik olup olmadığını kontrol edin. objektif lens (OB) çıkartın ve görüntü röle teleskop (L4) ikinci lensi yerleştirin.
   Not: olması doğru kolimasyon ve non-saptırma sağlanmasıışın yolu lenslerin bir çift sayı olduğunda AM kolaylaştırılmıştır.
7. kolimasyon korumak ve referans ışını hala tavana belirgin tatmin edecek sağlamak için doğrusal bir çeviri aşamasında kullanarak bu lensin konumunu ve açısını ayarlayın.
8. objektif lens (OB) değiştirin ve teleskop (L3) ilk lensi yerleştirin. Önceki adımda tarif edildiği gibi, kolimasyon olmayan sapma sağlamak için bu lens konumunu ve açısını ayarlamak.
9. çip yüzeyinin merkezi etrafında çeviri olmadan dönüşü sağlayan montaj bir oynak üzerinde SLM çip monte edin.
   Not: Belirli montaj tasarım kullanılan SLM bağlıdır. SLM bir montaj olmadan verilirse, o zaman bir lens pusula montaj bağlı bir özel işlenmiş alüminyum levhaya sabit olmalıdır.
10. lensler hizalanmış ile, aynanın yerine SLM yerleştirin. referans ışını SLM çip merkezinde yer almaktadır şekilde SLM konumunu ayarlamak, ve An ayarlamakkiriş iki röle lens (L3 ve L4) üzerinden geçtiği bir şekilde Gle. referans ışını hala belirgin noktada merkezli olup olmadığını kontrol edin.
11. Genişletin ve Kepler ışın genişletici kullanarak referans ışını .birleştirecek.
    1. ayarlanmasının kolaylığı için bir kafes sisteminde iki lens (L1 ve L2) monte edin.
    2. Merkezi lensleri çıkarmadan ve süsen ile değiştirerek referans kiriş üzerinde kafes sistemi.
    3. İki lens takın ve bir kesme girişimölçer kullanan genişletilmiş ışın .birleştirecek şekilde L2 eksenel konumunu ayarlamak. L2 bir odak uzunluğu uzak SLM yüzeyinden olmalıdır.
    4. genişletilmiş ışın hala iki röle lensler L3 ve L4 sonra collimated olup olmadığını kontrol edin. kolimasyonu kontrol etmek için sadece DM3 sonra kesme interferometre kullanın.
12. uyarma yolu, tek bir dalga boyu, çift ışın yoluna, diğer iki lazerler için hizalanmış edildikten sonra. kullanarak uyarma yolunda merkez iki süsen ile her kiriş Steerışın birleştirerek dikroik aynalar (DM1 ve DM2).

Polarizasyon Rotator 2. Hizalama

1. Olay kutuplaşmaya 45 ° onun hızlı ekseni LCVR monte edin.
2. Hwp ve çapraz polarize arasındaki LCVR takarak bir akromatik yarım dalga plakası (HWP) kullanarak LCVR kiriş olayın İnce ayar polarizasyon açısı. iletilen güç en aza indirmek için hwp döndürün.
   Not: Bir değişken polarizasyon rotator olarak hareket etmek amacıyla, sıvı kristal geciktirici (LCVR) hızlı ekseni tam olay dikey ışın kutuplaşmaya 45 ° aynı hizada olmalıdır. LCVR fiziksel 45 ° monte edilir, ancak bu sadece iri hizalanmasıdır. HWP LCVR hızlı eksenine göre olay polarizasyon mükemmel 45 ° hizalamayı sağlamak için kullanılır. Çeyrek dalga plakası (QWP) uygulanan gerilim ile kontrol edilen bir açıyla geri doğrusal kutuplaşma LCVR tarafından uyarılan eğimli eliptik polarizasyon dönüştürür^24.
3. LCVR sonra QWP takın ve çapraz polarize arasında iletilen gücü minimize ederek gelen kutuplaşma yavaş ekseni hizalamak için döndürün.

Emisyon Yolu 3. Hizalama

1. Kaba bir sahne mikrometre slayt ve iletilen ışık kullanılarak kamerayı yerleştirin.
   1. mikroskop Okülerin kullanarak dürbün ağı odaklanın ve bu pozisyonda objektif lens düzeltmek.
   2. Kabaca kamera ortalamak ve ekrandaki görüntüyü gözlemleyerek odağa retikülün imajını getirmek için kamera konumunu taşımak.
      Not: Harici filtre tekerleği sonra kullanılırsa lazerler açık olduğunda filtre küp nedenle Okülerin kullanılmaması gerekir, bir emisyon filtresi içermez.
2. İnce bir floresan boncuk örneği kullanarak kamera konumunu ayarlamak.
   1. Bir # 1.5 coverglass 100 nm çok renkli boncuklar bir damla yayarak floresan boncuk bir tek tabaka hazırlayın. d bırakınRy coverglass boncuk adsorbe ve daha sonra su içinde yeniden sokmak.
   2. immersiyon ile objektif üzerine boncuk örnek yerleştirin. İnce floresan boncuk tabakası odakta olacak şekilde kameranın konumunu ayarlamak. Odak bulunduktan sonra objektif lens konumunu ayarlamak etmeyin.
      Not: SLM örnek düzlemde bir düzlem konjugat olmalıdır gibi, SLM pozisyonu, objektifler röle ve hedef tespit edilmelidir. Odağı ayarlamak için, örnek eksenel yerine piezo z sahne kullanarak hedefi taşıyın.
3. bitmap dosyaları gibi uygun bir SIM ikili ızgara desenleri oluşturun.
   1. 3 eşit aralıklı faz vardiya ile 3 desen yönelimleri her: 2D / TIRF-SIM için 9 ikili ızgara görüntülerin bir dizi oluşturur. Daha sonra ikili görüntü elde etmek için eşikleme, uygulanan ofset bir faz ile döndürülmüş 2B sinüzoidin dan (örneğin MATLAB kullanarak) sayısal olarak bu oluşturun. örnek kod yazmak Kod Dosyaları Bkz.
   2. Alignmen içint amaçları, aynı zamanda pencereli hizalama kafesler dışarıdan tetiklenen gerek yoktur. Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3 yönelimleri her biri için, küçük bir dairesel delik tarafından pencereli edilmiş ızgara modellerini oluşturmak fakat el ile bir kullanıcı tarafından değiştirilebilir slm yazılımı.
      Not: Optimal rotasyon açıları bir tartışma ve ızgara desen oluşturma kodu ^16,20 bir örnek için referanslara bakınız.
4. (Örneğin MetroCon için) üreticinin yazılımını kullanarak SLM bitmap görüntüleri yükleyin.
   1. SLM kontrol yazılımı yükleyin ve "Bağlan" butonuna tıklayınız.
   2. "Repertuarı" sekmesinde, repertuar dosyasını açın ve dosyanın içerdiği Siparişler Running sayısını kontrol etmek için "Load" tıklayın. Verilen örnek repertuar dosyasında beş Koşu Siparişler vardır.
   3. Click SLM repertuar dosya yüklemek için "Yönetim Kurulu Gönder".
   4. bitmap görüntüleri yüklemek için bekleyinnd cihaz otomatik olarak yeniden için.
      Not: Izgara bitmap görüntüleri ve düzeni tanımlayan bir dosya içeren bir örnek repertuar dosyası, bir Yan Kod dosyası olarak yer almaktadır. ".repz" Dosya ZIP dosya sıkıştırma yazılımı kullanılarak açılabilir.
5. (Örneğin 0 ° için) ilk yönlendirme için SLM üzerinde ızgara bir pencereli hizalama görüntüler.
   1. SLM kontrol yazılımı, "Durum" sekmesini seçin (bu "1" Sipariş Çalışıyor örnek bir dosya halinde) Running Sipariş numarasını girin.
   2. hizalama ızgara Koşu Sipariş değiştirmek için "Seç" düğmesine tıklayın.
      Not: Bu örnek düzlemde küçük bir dairesel bölge yanacaktır. SLM yüzeyi düzgün örnek düzlemde konjuge ise o zaman bu bölgenin kenarları odakta olacak. ızgara desen L3 odak noktasında birden kırılma siparişleri üretecek: sıfır sıralı yansıma yansıtıcı arka paneldenSLM SLM cihaza özgü iç unsurların kırınımı ortaya çıktığını -1 ve ızgara, ve aynı zamanda zayıf yüksek siparişlere karşılık gelen 1 emir (örn. Piksel kenarlarında SLM piksel ve usulsüzlüklerin iç hatlar yansımaları) . Tüm ancak -1 ve +1 emir filtre edilmelidir.
6. mekansal maske (SM) L3 odak pozisyonunda ışın yoluna, bir x y sahne monte yerleştirin ve sadece istenen ilk siparişler geçirilen şekilde optik eksene göre konumunu çevirmek. Doğrudan mekansal filtreden sonra, sadece iki dairesel kirişler görünür olacaktır.
   Not: uzamsal maske bir iğne kullanılarak alüminyum folyo içine 6 delikler açarak imal edilir. delikler tüm lazer dalga boyları için birinci dereceden kirişler geçmek için yeterli büyüklükte olmalıdır. Mekansal maske ayrıntılı bir analiz referans ²⁰ verilmektedir.
7. daha sonraki hizalama ızgara yönünü (60 °, koşma sırası 2) ve DisplayGerekirse sadece ilk siparişler konumunu ayarlayarak, mekansal maske aracılığıyla izin emin olun.
8. Nihai oryantasyon (120 °, koşma sırası 3) için tekrarlayın.
9. kamerada floresan boncuk tabakasının görüntüsünü kontrol edin. Şekil 2'de gösterildiği gibi iki dairesel kirişler üst üste değilse o zaman tekrarlanarak objektif lens ve kamera konumunu ayarlayarak örnek uçağı yeniden konumlandırmak.
10. odak dışında resim getirecektir iki kiriş üst üste objektif konumunu ayarlayın. durumunda geri odak ve ince ayar içine hedefi görüntüyü getirmek için fotoğraf makinesinin yerini değiştirin iki daire hala görebilir. İki kiriş üst üste ve tek bir dairesel bölge odakta kadar bu işlemi tekrarlayın.
11. örnek düzlemde pozisyonu ayarlandıktan sonra, sabit objektif konumunu korumak.
12. Görüntü 488 nm eksitasyon dalga boyu için, örneğin flüoresan boya içeren bir çözelti, TIRF aydınlatma teyit etmek için, 10, ihtiva eden bir çözelti kullanımı81; M rodamin 6G.
    1. odak haline boya örneği getirin. iki ışın doğru TIRF açıda olay varsa o tek moleküller yüksek arka plan olmadan görünür olacak ve dairesel diyafram kenarları odak olacaktır. Hizalanmış ve yanlış hizalanmış TIRF kirişler örnekleri için Şekil 2B-D bakın.
    2. sırayla pencereli ızgaralar her yönünü görüntüler ve her üç yönelimleri TIRF aydınlatma sağladığını ve iki kiriş örnek düzlemde üst üste emin olun. Kirişlerin pozisyonunda ince ayar dikroik ayna DM3 ayarlanması ile yapılabilmektedir.
       Not: Farklı dalga boyları renk sapması eksenel nedeniyle farklı konumlarda odaklanmış olmasına rağmen, bu kritik değildir ve uygulanması ile düzeltilebilir sabit bir ikinci dalga boyu ile uyarım önce, numune, konumuna Z uzaklığı.

4. Sistemi Senkronizasyon ve Kalibrasyon

1. boncuk tek tabaka s yerleştirinobjektif geniş ve odak noktası haline getirmek.
2. İlk model oryantasyon (0 °) için, sırayla 3 faz kaydırmalı görüntü her görüntülemek için kendi kontrol yazılımı kullanarak SLM programlayın.
   1. SLM kontrol yazılımı kullanarak, örnek repertuarının Sipariş 4. Koşu geçmek.
   2. Pozitif bir küresel maruz kalma döneminde bir negatif TTL tetikleme sinyali: çıktıya iki sinyal (örneğin HCImage için) elde etme yazılımı kullanarak kamerayı yapılandırın. sırasıyla "Pozlama" ve Çıkış Tetik Polarite 1 ve 2 "Pozitif" ve "Negatif" kamera "Advanced Camera Özellikleri" altında yazılımı, set Çıktı Tetik Kind 1 ve 2.
   3. "Tetik" ve koaksiyel kablo kullanarak sırasıyla SLM "Finish" girişlerine, kameranın Çıkışını 1. ve 2. bağlayın. SLM şimdi kameraya eşitlenir.
3. 3 görüntülerin bir dizi kazanır.
   1. "Dizi" bölmesinde, & seçin# 34; tarama türüne Sabit Disk Kayıt "ve 3 kare sayısı olarak ayarlayın.
   2. 3 kare elde etmek için "Başlat" düğmesini tıklayın. SLM desen her maruziyet üzerine değişecektir. Görüntüdeki floresan boncuk 3 görüntülerin her biri arasında açık ve kapalı yanıp sönmeye görünecektir. Yanıp sönen miktarı sinüzoidal aydınlatma desen modülasyon kontrast dışında bir okuma olduğunu.
4. azimuthal kutuplaşma ve verilen desen yönelimi dolayısıyla yüksek modülasyon kontrast elde etmek için özel yazılım kullanarak LCVR ile uyarma lazer polarizasyon döndürün.
   1. LCVR kalibrasyon yazılımı yükleyin.
   2. sırasıyla Minimum ve Maksimum Gerilim 0 ve 8 girin.
   3. kutuplaşma döndürmek için "LCVR Gerilim Sweep" tıklayın.
      Not: LCVR geciktirici sıcaklığının bir fonksiyonudur ve hatta sıcaklık kontrolü ile güne-gün kayması olabilir. Bu adımda, uygun azimutal polarizasyon Sweepi ampirik bulunanörnek polarizasyon olayı döner etkisine sahip olan asgari ve azami gerilim arasında uygulanan gerilimin ng. Modülasyon kontrastı Her gerilim ²⁵ ile en üst nokta kontrast Aşağıdaki adımlarda kullanılan elde gerilim için hesaplanır.
   4. tamamlamak için kalibrasyon işlemi için bekleyin ve ölçülen gerilim not edin.
5. Kalan iki desen yönelimleri (60 ° ve 120 °) ve uyarma dalga boyları her biri için bu kalibrasyon işlemi tekrarlayın.
6. LCVR, lazerler, emisyon filtre tekerleği ve piezo z evre ²⁶ ile kamera pozlama eşitleyin. Bunu başarmak için, sistemin ana saat kaynağı olarak yüksek hızlı veri toplama (DAQ) kartı kullanmak ve SLM en lazerler modüle çıkış sinyali Enable LED kullanımı (Şekil 3B).
   Not: özel uygulama kullanılan bileşenlerin ancak dijital TRI için, yüksek hızlı bir DAQ kartının kullanımı bağlıdırgger senkronizasyon ve yazılımı ile kontrol edilen bir analog voltaj ile LCVR kontrolü, tavsiye edilir. Bu protokolde kullanılan kontrol yazılımı istek üzerine mevcuttur.
7. Nedeniyle eksenel renk sapmaları, her dalga boyu için, ayrıca bir z-ofset örnek aşamasına uygulanır.
   1. İlk dalga boyu (örn., 488 nm) daha sonra ikinci geçiş (örn., 640 nm) çok renkli boncuk tek tabakalı örneklem üzerinde odaklanarak deneysel ofset belirleme. boncuklar artık odak dışı olacaktır.
   2. boncuk yönlendirmesi ve gerekli z pozisyonuna değişimi ölçmek. Bu daha sonra piezo z sahneye dalgaboyu her değiştiğinde uygulanabilir ofset.
8. SLM kontrol yazılımı kullanarak, TIRF-SIM için gerekli 9 ikili ızgara görüntülerin tam serisi SLM Running Sipariş geçin. Bu örnek repertuarında Sipariş 0 Running olduğunu.
9. kamera kontrol yazılımı kullanarak, boncuk örnek 9 görüntü kazanır.
   1. Kamera yazılımı "Dizi" bölmesinde, tarama türü olarak "Sabit Disk Kaydı" seçeneğini seçin ve 9 kare sayısı değiştirin.
   2. görüntüler elde etmek için "Başlat" düğmesini tıklayın.
   3. "Kaydet Tamponlu Görüntüler" penceresinde görüntü türü olarak "TIFF" seçerek ve OK tıklayarak TIFF dosyaları olarak elde edilen görüntüleri kaydedin.
10. Standart TIRF üzerinde çözünürlükte iyileşme doğrulamak için, ticari veya özel yazılımını kullanarak ham TIFF görüntüleri süper çözünürlüklü bir görüntüyü yeniden.
    Not: Biz özel imar kod-house ve Dr Lin Shao ²⁷ hem geliştirdiği kullandığımız mikroskop için.

Sonuçlar

Çok renkli 100nm çapı floresan boncuk TIRF-SIM standart TIRF karşılaştırmak ve yanal çözünürlükte ulaşılabilir iyileşme (- B Şekil 4A) ölçmek için görüntülenmiştir. Süper çözünürlüklü görüntü içine çiğ çerçevelerin İmar literatüründe ^27,28 belirtildiği gibi standart algoritmaları kullanarak gerçekleştirildi. TIRF-SIM açıkça TIRF kıyasla önemli ölçüde daha yüksek yanal çözünürlük sahip olduğu görülebilir. Bir mikroskop nokta dağılım fonksiyonu (PSF) de bu nedenle, tek bir alt-kırınım büyüklüğünde floresan boncuk görüntü ile PSF yaklaşılır ve çözünürlük her dalga boyu için ayrı ayrı boncuk 2B Gauss fonksiyonları takarak ölçülebilir. Tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) ortalama değerine dayalı mikroskop tahmini çözünürlüğü 89 nm ve sırasıyla 488 ve 640 nm TIRF-SIM (Şekil 4C) için 116 nm. Bu iki kat Impro tekabülTeorik kırınım sınırlı duruma göre her iki dalga boyları için yanal çözünürlükte letle. Floresan etiketli amiloid fibrilleri da iki katına çözünürlüğü (Şekil 4D) göstermek için mükemmel bir test örneği vardır. Amiloid fibrillerin% 10 rodamin türevi boyalar (488 nm eksitasyon) 1 hafta ve daha sonra TIRF-SIM ile görüntüleme ile etiketlenmiş β-amiloid inkübe edilerek in vitro olarak oluşturulmuştur. Daha fazla bilgi için ¹² başvuru bakın.

Böyle emGFP olarak yüksek kontrastlı hücre içi yapılar Mikrotübülleri (Şekil 5B, G) veya LifeAct-GFP (Şekil 5D) TIRF-SIM görüntüleme için idealdir ve yüksek kontrast süper çözünürlüklü görüntüleri elde etiketli. Bu protokol ayrıntılı kurulumu kullanarak TIRF-SIM görüntüleme bazal hücreli korteks yakınında bulunan mikrotübül bir alt nüfusun gözlem sağlar ve mikrotübül polimerizasyon ve depolimerizasyon olabilir be zamanla görülen (Animasyon Şekil 1). Tüm numuneler ayrık yapılar olmadan özellikle, düşük kontrastlı örneklerinde, TIRF-SIM ile görüntüleme için uygun değildir. Sitosolik GFP ifade eden hücreler, plazma zarının kenarları (Şekil 5F, H'dir ve Hareketli Şekil 2) bir kenara yüksek çözünürlüklü bilgi eksikliği ve elde edilen rekonstrüksiyonları eşya ile kaplanmış esas TIRF görüntüler gibi TIRF SIM görüntüleme için bu nedenle, alt-optimal. Bu örneklerde, aksine artış genellikle yeniden algoritmasının ters evrişim aşamasından atfedilebilir.

Yüksek Modulation Contrast başarılı bir SIM görüntüleme için gereklidir. Fourier yeniden görüntünün dönüşümü SIM optik transfer fonksiyonu (OTF) (Şekil 6A, ek) görselleştirme sağlar. azimuthal kutup sağlayarak Her yön için modülasyon kontrastı en üst düzeye olmadanSIM passbands düşük bir sinyal-gürültü oranı gelen numune içinde yüksek çözünürlüklü bilgi çok az modülasyonu, orada bir polarizasyon rotator ile leştirilmesi. Standart Wiener filtresi yaklaşımı kullanmak İmar algoritmaları sadece SIM passbands gürültü yükseltmek ve esasen altıgen (veya "petek") eserler (Şekil 6A, sağ panel) zil ile kaplanmış bir standart TIRF görüntü bir görüntü verecektir. Olası bir geliştirme numune tipine bağlı olarak, bu fazladan unsurların düşürüleceği ^29,30 yinelemeli veya kör yeniden algoritmaları ^31,32 kullanılması olabilir. Biz önce ve yeniden ³³ sonra SIM verilerin kalitesini kontrol etmek için SIMcheck eklentisi ImageJ kullanılmasını tavsiye ederiz.

Şekil 1:. Çok renkli TIRF-SIM Kur'un Düzen TIRF-SIM microscope üç ana bölümden, kiriş oluşturma birimi, desen projeksiyon ünitesi ve tespit birimi oluşur. ışın nesil biriminde, üç farklı lazerler dikroik aynalar (DM1 ve DM2) üzerinden aynı ışın yoluna hizalanmış ve polarizasyon kontrolü için dört optik elemanlar yoluyla yönetti. İlk olarak, bir polarize (P) lazer ışınları her doğrusal polarizasyon durumu saflığını temin eder. Aşağıdaki üç optik elemanlar metinde ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, hızlı, otomatik bir şekilde polarizasyon döndürmek için gereklidir. Daha sonra, bir teleskop konfigürasyonunda iki lensler (L1 ve L2) uzaysal ışık modülatörü (SLM) aktif yüzeyini maç ışını genişletmek ve slm yansıttığı ikili ızgara desenleri ile üç küçük ışın içine kırınan edilir (örnekler fayans 1- gösterilmiştir 9). SLM desen aydınlatma ışığı göreli polarizasyon durumu bir ok olarak gösterilir. İkinci teleskop (L3 ve L4) desen de-büyütür ve inci erişim sunarSLM desen e Fourier düzlemi. Bu düzlemde bir mekansal maske (SM) SLM piksellenmiş yapısı ve iç kablolama merkez bileşeni ve diğer istenmeyen kırılma bileşenlerini süzmek için kullanılır. Kalan iki kiriş yoğunlaştırıcı mercek (L5) üzerinden objektif (OB) arka odak düzlemi üzerine odaklanmış önce iki dikroik ayna (DM3 ve DM4) kurulum dahildir. DM4 emisyon ışıktan ayrı aydınlatma için floresan mikroskobu geleneksel bir dikroik ayna gibi davranır. Ancak, bu ayna kaçınılmaz DM3, DM4 olarak ideal aynı partiden bir dikroik ayna ile telafi edilebilir aydınlatma ışığın polarizasyon durumunda ekliptiğinde neden olur. Yağ daldırma TIRF amacı doğrudan tamamen yansıtılır lamel üzerine iki karşıt yayılan dalgaları başlatmak ve lamel yapılandırılmış bir fani alana yol vermek için yeterince büyük bir NA vardır. örnek, bir xyz çeviri aşamasında üzerine monte edilir. Algılama perfiletim aynı amaç ve DM4 aracılığıyla ormed artı bant geçiren emisyon filtreleri tarafından ek bir filtreleme, bir bilgisayar kontrollü filtre tekerleği (EFW) monte. Son olarak, görüntü dahili mikroskop tüp lens (L6) tarafından sCMOS kamera yansıtılıyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Örtüşen Kirişlerin Hizalama (A), bir dairesel delik ile pencereli bir SLM ızgara deseni hizalama için yararlıdır. İki örtüşmeyen kirişler kamera (solda) görünür ise, o zaman numune uçağın konumu iteratif tek dairesel aydınlatma nokta (sağda) vermek üzere objektif lens ve kamera eksenel pozisyonlarını ayarlayarak yeniden konumlandırılmış olmalıdır. kirişler orde örtüşmesi gerekirr TIRF-SIM için gerekli sinüs uyarma desen üretmek. kirişler tam örtüşmeyen yoksa bu girişim deseni oluşturulduğu üzerinde görüş alanını azaltır. (B ve C) ışınlarının kesin açı TIRF-SIM önemlidir. açısı doğru değilse, kirişler bir TIRF için gerekli bir açıda olmayacak bir floresan boya çözeltisini görüntüleme bu kolayca görülebilir. Bir ışın dairesel nokta üretmektedir önemli açıdan daha büyük bir geliş açısına sahiptir, ve diğer (b) görüntünün sol parlak çizgi yol açar değildir. Ayna DM3 açısını ayarlama (D) Her iki kirişler aynı açıda olay olmasını sağlar ve bu amaca odaktan uzaklaşma ile doğrulanabilir: doğru şekilde hizalanmış ise, bir floresan boya örneğinin z istifinin xz projeksiyon iki simetrik kesişen göstermesi gerekir en önemsiz arka plan ile kirişlerodaklanın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Farklı Sistem Bileşenlerinin Senkronizasyon Bağımlılıklar (A) Hızlı bir SIM edinimi için, bir donanım tabanlı çözümü kullanarak sistem bileşenlerinin senkronizasyon esastır. (B) bir veri toplama kartı (VDC), bir ana tetikleyici olarak kullanılmalıdır. DAQ kurulu bir TTL sinyali sCMOS Dış Girişine gönderilen ve kamera pozlama tetiklemek için kullanılır. Kamera Küresel Poz çıktı daha sonra bir ızgara desenini görüntülemek için SLM tetikler ve SLM çıkış dijital SLM piksel "üzerinde" devlet olduğunda lazer sadece yayan öyle ki lazer uyarma modüle etmek için kullanılır Enable LED. pozlama komple sonrate, kamera Küresel Pozlama çıkışı bir sonraki ızgara faz ya da açı üzerinde SLM desen ilerlemek için kullanılır. DAQ kurulu ayrıca aydınlatma ışınının lineer polarizasyon durumunu kontrol etmek için LCVR denetleyicisine bir analog gerilim üretir. Bu gerilim, her model açısı için 3 faz görüntüler kazanılmasından sonra açılır. Tek bir dalga boyu için 9 görüntülerin kazanılmasından sonra, DAQ kurulu emisyon filtresi tekerlek kontrolöre bir sinyal ve bir sonraki dalga boyu geçer. DAQ kurulu da z-ofset z aşamalı piezo denetleyicisi analog voltaj çıkışı ile örnek. Uygular , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: 100 nm renkli Boncuk ve floresan L test Örneklerinde TIRF SIM Görüntülemeabelled Amiloid fibrillerin. (A ve B), standart TIRF karşılaştırılması 488 nm ve 640 nm uyarma için TIRF SIM rekonstrüksiyonlar göre. Gauss tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) (C) Histogram beklenen çözünürlük iyileşme gösteren TIRF-SIM boncuk uyuyor. % 10 rodamin türevi boya (488 nm eksitasyon) ile etiketlenmiş β-amiloid fibril TIRF-SIM karşı (D) TIRF. Ölçek çubukları = 1 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: a. HEK293 hücresinde (A, B) mikrotübüllerin (emGFP-tübülin) Canlı Hücre TIRF-SIM geleneksel TIRF Görüntüleme Karşılaştırılması ve TIRF-SIM görüntüleri, (C, D ) ipliksi aktin bir COS-7 hücre içinde (LifeAct-GFP) ve (E, F), bir HEK293 hücre içinde sitozolik GFP. B ve F Görüntüler filmleri tek zaman noktalarıdır. Kutu içindeki bölümler (G, H) 'de büyütülmüş olarak gösterilmektedir. Ölçek çubukları = 3 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6:. Yeniden İnşa Boncuk Images Polarizasyon Rotator Etkisi (A) Böyle bir LCVR olarak bir kutuplaşma rotator kullanmadan, SIM passbands sinyal-gürültü oranı yeniden SIM karakteristik altıgen eserler sonuçlanır düşük görüntü (sağda), (B) 2D-SIM yılında yapılandırılmış aydınlatma modelleri Fourier doğrudan görülebilirTIRF-SIM Ancak, ham görüntüleri (sol, uyarma uzamsal frekans vurgulanmış) onlar emisyon OTF desteği yarıçap içinde düşmek gibi bir dönüşümü, onlar OTF desteği dışında ve (sağda) bu nedenle görünmez. Protokolde belirtildiği gibi, bu durumda, desen modülasyon kontrast, seyrek boncuk tek tabaka kullanılarak değerlendirilmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7:. Mekansal Işık Modülatör Tabanlı Desen Nesil Böyle Multifokal SIM As Diğer Görüntüleme Yöntemleri Uygulanmasını verir (A) MSIM yılında kare bir kafes SLM (içerlek) üzerine pointsdisplayed görüntü düzlemi kırılma sınırlı odaklarının bir kafes verir. düşük konsantrasyonda Rodamin 6G ince bir tabaka Visua için görüntülü odaklar Lize. Desen örneği (B) karşısında çevrilmiştir ve elde edilen ham görüntü z-yığın out-of-odak ışığı (C) azaltılmış bir görüntü oluşturmak için yeniden yapılmıştır. Ölçek çubukları = 5 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Hareketli Resim 1: a. HEK293 Hücresinde EmGFP-tubulin Zaman Serisi Sinema Hızlı polimerizasyon ve emGFP depolimerizasyon mikrotübüller TIRF-SIM kullanılarak görülebilir etiketli. Görüntüler 0,5 saniyelik aralıklarla ham çerçeve başına 50 milisaniye pozlama süresi (SIM çerçeve başına 450 msn) kullanılarak elde. kullanılan maruz kalma zamanı değil kamera veya SLM hızıyla, fluorofor parlaklık ile sınırlı kalmıştır. 3988movie1.mov "target =" _ blank "> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Hareketli Resim 2: a. HEK293 Hücre içinde Sitosolik GFP Zaman Serisi Film Bunun gibi düşük kontrastlı numuneler TIRF-SIM görüntüleme için ideal örnekler değildir. Retrograd membran akış TIRF görüntüleri görülebilir ancak TIRF-SIM cep kenarlarında dışında herhangi bir ek bilgi sağlamaz. TIRF-SIM görüntüleri 5 saniyelik aralıklarla ham çerçeve (SİM çerçeve başına 450 msn) 50 msn pozlama süresini kullanılarak elde edildi. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yan Kod Dosya: Örnek SLM repertuar dosyası (48449_300us_1-bit_Balanced.seq3).d / 53988 / 48449_300us_1-bit_Balanced.seq3 "> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_001.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_002.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_003.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya: Örnek SLM repertoidosyası (period9_004.bmp) yeniden. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_005.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_006.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_007.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_008.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_009.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_mask_1.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_mask_2.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız. >

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (period9_mask_3.bmp) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek SLM repertuar dosyası (TIRF-SIM_example.rep) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Örnek ızgara nesil kodu (2 1) (generate_gratings.m) Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya: Örnek ızgara nesil kodu (2 2) (circular_mask.m).= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53988/circular_mask.m"> Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Yan Kod Dosya:. Modülasyon kontrastı (calculate_contrast.m) hesaplamak için örnek kod , bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Tartışmalar

Böyle bu protokolde ayrıntılı kurulum olarak özel yapılmış TIRF-SIM sistemleri piyasada mevcut mikroskoplar ile karşılaştırıldığında yüksek hızda çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme yeteneğine sahiptirler. süper çözümün tekniğiyle, SIM artısı zamansal çözünürlüğü gibi tek bir molekül lokalizasyon mikroskobu (SMLM) veya uyarılmış emisyon tükenmesi mikroskopi gibi noktası tarama yöntemleri (ve diğer yöntemlere göre, fluorofor fotofizikten ile sınırlı değildir, yani STED). renkli görüntüleme basittir, böylece bu tekniklerin aksine, SIM photoswitchable ya tükenebilir florofor gerektirmez. Burada bildirilen 2 iyileştirme faktörü aksine SIM ve multifokal SIM kesit gibi optik olmayan TIRF-SIM sistemleri, genellikle uygulamada 1.7 kat veya daha az çözünürlüğü iyileştirmeler elde edebilirsiniz ve ticari sistemler de sistemden daha sık yavaş ve daha az esnektir Bu protokolde sundu.

"> Bu tekniği uygulamak iki ana zorluklar öncelikle optik hizalama işlemini tüketen bir zahmetli ve zaman gerektirir objektif arka diyafram, TIR bölgesi içinde altı SIM kirişlerin hassas konumlandırma için gerekliliktir. İkincisi, yüksek model kontrast üretmek için örnek de, polarizasyon rotasyonu düşük NA 2D-SIM sistemleri için, polarizasyon rotasyonu doğrusal polarizasyon yönlendirme dikkatli seçimi ile önlenebilir. esastır, ancak bu TIRF-SIM ²⁵ imkansız hale gelir. yüksek hızlı renkli görüntüleme için, elektro optik polarizasyon kontrolü gereklidir ve bu sistemin karmaşıklığı ve gider artırır.

tekniğin sınırlamaları

TIRF SIM geleneksel TIRF gibi doğal, biyolojik yapılar ve kaybolan alan 150-200 nm penetrasyon derinliği ile aydınlatılabilir bazal hücre membranında bulunan işlemlerin bir gözlem ile sınırlıdır. SüreSIM genellikle STED veya SMLM, yanal çözünürlük iki katına hala geleneksel TIRF mikroskopi ile karşılaştırıldığında en az 4 kat ⁵ ile fotonların gerekli sayısını artırmak değil, ya daha hücrelere daha az photodamaging olarak kote edilir. Kısa pozlama süresi ile yüksek kare hızlarında görüntüleme için, bu foton artış, aydınlatma şiddetleri kullanımını zorunlu kılmaktadır. Herhangi bir flüorofor sabit veya yavaş hareket eden numune, yüksek parlaklık fluoresan protein ya da geliştirilmiş Fotostabilitesi sonraki nesil sentetik boyaların SİM görüntüleme için kullanılabilir olsa da canlı hücre görüntüleme için tavsiye edilir.

Bu uygulama, 20 Hz fazla SIM kare hızlarında tek bir renk görüntüleme kapasitesine sahip olsa da, sunulan sisteme çok renkli görüntüleme motorlu emisyon filtresi tekerleğin sviçleme zaman ile sınırlıdır. Nedeniyle sCMOS kamera çipi büyük boyutu, bir çok bantlı emisyon filtresi ve görüntü bölme optik kullanılması mümkün ve eşzamanlı i izin verecekHiçbir hız cezası anda birden fazla dalga boyları ile maging. Bir başka olasılık farklı uyarma lazerler alternatif ve ikaz ışığı reddetmek için bir çok bantlı çentik filtresi kullanmak olacaktır. Bu uygulamada, bir ikili ferroelektrik SLM kullanımı da uygun değildir. gelen ışık en mekansal maske ile filtrelenir sıfır sıralı yansıması olduğu şekilde bu tür bir SLM sapma verimliliği, son derece düşüktür. Çok yüksek kare hızı gerektiren uygulamalar için, bir görüntüleme hızı, bu nedenle, lazer diyotları çıkış gücü ile sınırlıdır. SLM da uzak piksel olarak ideal bir yarım dalga plakaları faaliyet yok 550 nm dalga boyunda tasarım gelen dalga boyları için kutuplaşma bazı ekliptiğinde tanıtır. Bu ek bir LCVR kullanılarak telafi edilebilir olsa da, ideal bir çözüm desen jeneratör olarak bir dijital mikro-ayna cihazı (DMD) kullanımı olabilir.

Olası değişiklikler

kurulum preseBurada nted esnek ve daha kolay gibi 3D-SIM, hızlı 2D-SIM, multifokal SIM (MSIM) ve non-lineer SIM (NL-SİM) kadar diğer görüntüleme yöntemleri ^21,34,35 uygulanabilir ticari araçların daha değiştirilmiş olduğunu.

2D-SIM hızlı periferik endoplazmik retikulum gibi yapılar hareketli, nispeten düz görüntüleme için uygun olabilir. periferik ER nedeniyle düz yapıya TIRF kaybolan alan, ancak kullanılarak aydınlatılabilir daha hücre içinde derin yatıyor önemsiz out-of-odak arka plan ile standart 2D-SIM kullanılarak görüntülenebilir. Ayrıca, geliştirilmiş optik kesit rekonstrüksiyon algoritmaları kullanılması ışığı optik kalın örnekleri, olsa eksenel çözünürlük iki katına ²¹ gerekmez 2D-SIM kullanımını genişletmek out-of-odak bastırmak için.

MSIM, örnek uyarma odaklarının ³⁶ seyrek kafes ile aydınlatılmıştır. Bu yöntem SM (sadece mekansal maske kaldırarak uygulanabilir) Ve polarize bunu yerine. SLM şimdi bir genlik modülatörü olarak faaliyet göstermektedir. SLM görüntülenen dijital SIM ızgaralar görüntü düzleminde bir kırınım sınırlı odak boyutuna eşit olacak şekilde seçilmiştir noktalar boyutu ile, noktalar 2B kafes ile ikame edilmiş olabilir. Şekil 7A, 4 x 4 piksel kareler kafes 13.62 um fiziksel SLM piksel büyüklüğü göz önüne alındığında, numune üzerine demagnified zaman 150 x 150 nm kırınım sınırlı odakları oluşturur SLM (ek) görüntülenir. uyarma odakları sonra SLM üzerinde kafes deseni kaydırarak tercüme edilebilir ve bu görüş tüm alanını aydınlatmak için birden çok kez tekrarlanır. Görüntüler her tercüme desen pozisyon için edinilen ve yığını olan bir faktör kadar geliştirilmiş çözünürlüğe sahip bir yeniden görüntü elde etmek için post-işlenmiş ve düşük ışık eşdeğer widefield görüntüye göre out-of-focusKazanım süresi ham kare çok sayıda nedeniyle artan olmasına rağmen 30. Bu yöntem, standart SIM böyle lekeli kırmızı kan hücrelerinin (Şekil 7C) olarak örnek düşük kontrastlı yapılar için, elverişsiz olduğu için kalın, yoğun örnekleri görüntüleme için yararlı olabilir (Bu durumda, 168 = N cinsinden) görüş alanı başına gereken.

Li ve arkadaşları tarafından en son sunulan Son olarak, kurulum, yüksek Na doğrusal TIRF-SIM veya desenli aktivasyon doğrusal olmayan bir SIM (PA NL-SIM) ya sağlamak için modifiye edilebilir. Bir ultra 1.7 NA objektif veya ilave kullanımıyla 405 nm fotoaktivasyon lazer ve SLM ızgara desen ³⁵ dikkatli optimizasyonu.

gelecek Uygulamaları

SIM hala hızla gelişen bir tekniktir ve yaşam bilimleri birçok uygulama gelecekte etkin olacak. tekniğin hızı, çözünürlük ve kontrast geliştirmeleri ve standart fluorophores m kullanarak yeteneğiEAN Biyogörüntüleme için, SIM böyle konfokal ve geniş alan platformları gibi geleneksel birçok mikroskop sistemleri yerine ayarlanmış olduğundan emin olun. Ticari SIM sistemleri önemlisi, onlar değiştirilmiş ve bu alanda en son araştırma gelişmeleri uygulamak için geliştirilecek esnek olmayan, ancak, birçok araştırma laboratuvarlarının mali yetmeyeceği, üstün teknik özellikleri ile bugün zaten mevcuttur ve. Onlar da gerekli yetenek, kenar yaşam bilimleri araştırma kesme genellikle kritik bir darboğaz 'eldeki deney için uyarlanabilir' için yoksundur. Burada anlatılan sistem özellikle de örneğin malzeme ve fiziksel bilimler, yüzey kimya okumak için, sulandırılmış iki katmanlı sistemleri in vitro çalışmalar için, hücre yüzeyine yakın dinamik süreçleri incelemek için uygun olacaktır. 2B malzeme ve diğer birçok uygulama.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
488 nm laser	Toptica	iBeam SMART	with digital modulation
561 nm laser	Coherent	OBIS LS	with digital modulation
640 nm laser	Cobolt	MLD	with digital modulation
Long-pass dichroic mirrors	Thorlabs		for combining excitation beams
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube
Quad band dichroic mirror	Chroma	ZT405/488/561/640rpc	From same batch as above, 25 x 25 mm
1" square kinematic mount	Edmund Optics	58-860
Glan-Taylor calcite polarizers	Thorlabs	GT5-A	For alignment of LCVR
Glan-Taylor mount	Thorlabs	SM05PM5
Achromatic half wave plate	Thorlabs	AHWP05M-600	400-800 nm
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	For HWP
Liquid Crystal Variable Retarder	Meadowlark Optics	SWIFT	Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm.
LCVR controller	Meadowlark Optics	D3060HV	Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders
Achromatic quarter wave plate	Meadowlark Optics	AQM-100-0545
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1P/M	For QWP
10 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC080-010-A-ML	For beam expander
200 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC254-200-A-ML	For beam expander
Cage XY Translators	Thorlabs	CXY1
Ferroelectric spatial light modulator	Forth Dimension Displays	M0787-00249	SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1,280 x 1,024 pixels, with driver board
SLM mounting frame	Forth Dimension Displays	M0787-10014	Fixed to custom built aluminium mount
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount	Thorlabs	GM200/M	For SLM mounting
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform	Thorlabs	XYR1/M	For SLM mounting
Rail carrier	Newport	M-PRC-3	For SLM mounting
Precision Optical Rail	Newport	PRL-6	For SLM mounting
300 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 273 322	f = 300 mm, 31.5 mm diameter
140 mm achromatic doublet lens	Qioptiq	G322 239 322	f = 140 mm, 31.5 mm diameter
Precision XY Translation Mounts	Thorlabs	LM2XY
Lens Mounting Adapters	Thorlabs	SM2AD32	For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts
Translation stages	Comar	12XT65	Dovetail, side drive
XY Translator with Differential Drives	Thorlabs	ST1XY-D/M	for spatial filter
Rotation cage mount	Thorlabs	CRM1/M	for spatial filter
300 mm achromatic doublet	Thorlabs	AC508-300-A-ML	Excitation tube lens
Automated XY stage with Z-piezo top plate	ASI	PZ-2150-XYFT-PZ-IX71	with MS-2000 controller
Inverted microscope frame	Olympus	IX-71
Objective lens	Olympus	UAPON100XOTIRF	100X/1.49NA
High speed filter wheel	Prior Scientific	HF110A	with Prior ProScan III controller
Bandpass emission filters	Semrock	FF01-525/30, FF01-676/29
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA Flash v4.0
Stage top incubator	OKO Lab	H301-K-FRAME	For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers
Stainless steel optical posts	Thorlabs	TR series	for mounting optical components
Post holders	Thorlabs	PH series	for mounting optical components
Kinematic mirror mounts	Thorlabs	KM100	for mounting 1" mirrors
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
100 nm fluorescent microspheres	Life Technologies	T-7279	Tetraspeck
Rhodamine 6G	Sigma Aldrich	83697-250MG
8 well glass bottom dishes	ibidi	80827	with #1.5 coverglass
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Fisher Scientific	155409	with #1.5 coverglass
0.01 mm microscope reticle slide	EMS	68039-22
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific	C10613